CN108690042B - 一种同时检测onoo-和h2s的荧光探针及其合成方法和应用 - Google Patents

一种同时检测onoo-和h2s的荧光探针及其合成方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及荧光传感材料制备及生物检测技术领域，具体涉及一种同时检测ONOO‑和H2S的荧光探针及其合成方法和应用。本发明探针分子具有两个反应位点：一个能够与H2S发生亲核加成反应(激发波长480nm，发射波长580nm)，导致荧光信号显著增强；另一个与ONOO‑发生亲核反应(激发波长400nm，发射波长520nm)后重排得到两个香豆素衍生产物，反应后荧光信号也显著增强。因此，RC‑Br可以双激发双发射分别检测H2S和ONOO‑。该探针灵敏度高，响应速度快，并很好的用于细胞成像中。该探针为研究生物体系中H2S与ONOO‑的相互作用关系提供了有效的分析工具。

Description

一种同时检测ONOO-和H2S的荧光探针及其合成方法和应用
技术领域
本发明涉及荧光传感材料制备及生物检测技术领域，具体涉及一种同时检测ONOO-和 H2S的荧光探针及其合成方法和应用。
背景技术
H2S作为体内重要的气体信号分子，参与了一系列的生理和病理过程。H2S浓度过高或 者过低都可以引起疾病，适量的H2S具有降低血压、舒张血管和抑制血管平滑肌细胞增殖 等多种生物学作用。H2S在高血压、冠心病以及缺血性心肌损等病理活动过程和后期治疗过 程中都表现出重要作用。
ONOO-是生物体内重要的活性氧分子，是由超氧阴离子(O2 ·-)和一氧化氮(NO)通过自由基反应生成的产物。ONOO-作为较强的氧化剂和亲核试剂，参与了生物体内广泛的生理和病理活动过程。一方面，ONOO-可以在机体的免疫系统中发挥辅助调节的作用。另 一方面，ONOO-能够引起生物体内的酪氨酸硝基化，并且能氧化核酸、巯基分子和含有磷 脂的不饱和脂肪酸等分子，导致细胞内线粒体功能紊乱以触发细胞死亡。因此，ONOO-与 许多生物疾病如阿兹海默症、炎症、肝损伤以及癌症等密切关联。
在生物体系中的H2S和ONOO-在细胞内的浓度很低、寿命非常短，一般的方法很难实现对其测定。但荧光探针由于具有灵敏度高、实时监测等优点，近年来已作为有力的手段用于高活性物种的检测与成像。
发明内容
本发明主要目的是，提供一种新型的同时检测ONOO-和H2S的分子荧光探针及其合成 方法和应用。本发明荧光探针具有合成简单、灵敏度高、响应速度快的优点。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明目的之一，提供一种荧光探针，其结构式如下：
Figure BDA0001663020130000011
本发明目的之二，提供所述荧光探针的合成方法，包括以下步骤：
将4-二乙氨基酮酸和3-乙酰基-6-溴香豆素溶解在的浓硫酸中，然后在80-95℃加热 10-15h；冷却至室温，倒入冰水中，搅拌15-25min后过滤，冷水洗涤，真空干燥得粗品；将所得粗品用硅胶柱层析纯化，即得。
Figure BDA0001663020130000021
优选的，4-二乙氨基酮酸和3-乙酰基-6-溴香豆素按照物质的量比1:1混合。
优选的，在90℃加热12h。
优选的，硅胶柱层析所用洗脱剂为二氯甲烷和甲醇。
优选的，二氯甲烷和甲醇体积比为10:1。
本发明目的之三，提供所述荧光探针在检测ONOO和/或H2S中的应用。
本发明目的之四，提供所述荧光探针检测ONOO-和/或H2S的方法，将探针溶解在生理 盐水、缓冲液或二甲亚砜水溶性有机溶剂中，然后加入缓冲液及ONOO-或H2S待测液进行混合，调节pH，进行检测，即得。
优选的，所述缓冲液为PBS缓冲液。
优选的，调节pH值为4.0-10.0。本发明探针在所述pH值范围内性质稳定。
与现有技术相比，本发明的优点是：
1.探针合成简单、灵敏度高、响应速度快。
2.信噪比高：探针自身背景信号低，反应产物荧光信号强。
3.该分子探针具有两个活泼的反应位点：一个能够与H2S发生亲核加成反应(激发波长 480nm，发射波长580nm)，导致荧光信号显著增强；另一个与ONOO-发生亲核反应(激发波长400nm，发射波长520nm)，反应后荧光信号也显著增强。
4.利用双激发双发射原理检测细胞内ONOO-和H2S。
附图说明
图1是本发明分子荧光探针对不同浓度的ONOO-的荧光响应光谱图；横坐标为波长(nm)， 纵坐标为荧光发射强度。探针的激发波长为400nm，发射波长为520nm。
图2是本发明分子荧光探针对不同浓度的H2S的荧光响应光谱图；横坐标为波长(nm)， 纵坐标为荧光发射强度。探针的激发波长为480nm，发射波长为580nm。
图3是本发明分子荧光探针分别与ONOO-和H2S的荧光响应光谱叠加图。横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光发射强度，激发波长为400nm。
图4是本发明分子荧光探针对ONOO-的选择性实验。横坐标为干扰物和待测物，纵坐标为 荧光发射强度。探针的激发波长为400nm，发射波长为520nm。
图5是本发明分子荧光探针对H2S的选择性实验。横坐标为干扰物和待测物，纵坐标为荧 光发射强度。探针的激发波长为480nm，发射波长为580nm。
图6是本发明分子荧光探针对ONOO-的反应动力学检测实验。横坐标为时间(s)，纵坐标 为荧光发射强度。探针的激发波长为400nm，发射波长为520nm。
图7是本发明分子荧光探针对H2S的反应动力学检测实验。横坐标为时间(s)，纵坐标为 荧光发射强度。探针的激发波长为480nm，发射波长为580nm。
图8是本发明分子荧光探针在不同pH环境下对ONOO-的荧光响应变化。横坐标为pH值， 纵坐标为荧光发射强度。探针的激发波长为400nm，发射波长为520nm。
图9是本发明分子荧光探针在不同pH环境下对H2S的荧光响应变化。横坐标为pH值，纵坐 标为荧光发射强度。探针的激发波长为480nm，发射波长为580nm。
图10是本发明分子荧光探针与ONOO-反应产物高分辨质谱验证。
图11是本发明分子荧光探针与H2S反应产物高分辨质谱验证。
图12是本发明分子荧光探针与外源性ONOO-在HepG2细胞中的荧光成像。(a)，(b)和(c) 为细胞成像图，(d)为相对荧光强度。
图13是本发明分子荧光探针与外源性H2S在HepG2细胞中的成像。(a)，(b)，(c)和(d) 为细胞成像图，(e)为相对荧光强度。
图14是本发明分子荧光探针在HepG2细胞内的TPM成像。(a)，(d)，(g)，(b)，(e)和(h) 为细胞成像图。(c)，(f)和(i)为细胞亮场的叠加图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指 明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的 相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发 明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图 包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其 指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实 施例详细说明本发明的技术方案。
实施例：荧光探针的合成
将4-二乙氨基酮酸(313.1mg，1.0mmol)和3-乙酰基-6-溴香豆素(266.0mg，1.0mmol) 溶解在5.0mL的浓硫酸中，然后在90℃加热12h。冷却至室温，将溶液缓慢倒入50mL 冰水中(紫色固体析出)，搅拌20min后过滤，冷水洗涤，真空干燥得粗品。进一步用硅胶 柱层析(CH2Cl2/MeOH＝10:1，v/v)纯化，得到紫色固体化合物RC-Br(450.2mg，83％)。 质谱及核磁表征：
HRMS-ESI(m/z):calcd for C29H22BrNO5[M+H]+544.0754/546.0735；found544.0700/546.0678。
1H NMR(400MHz,DMSO):δ8.84(s,1H),8.24(s,1H),7.95(d,J＝7.6Hz,1H),7.85(q,J＝ 6.4Hz,1H),7.80(t,J＝6.5Hz,1H),7.70(t,J＝7.4Hz,1H),7.46(d,J＝8.2Hz,1H),7.37(d,J＝ 6.0Hz,1H),6.60(s,1H),6.51(d,J＝5.9Hz,3H),3.38(q,J＝6.9Hz,4H),1.13(t,J＝6.9Hz, 6H)。
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ169.48,157.22,152.58,152.15,145.71,138.65,135.24,134.54, 131.11,129.57,128.64,126.59,125.24,124.00,120.29,119.84,118.05,117.31,104.68,44.60, 29.70,29.32,27.22,22.69,14.12,12.49。
试验例
探针对ONOO-的荧光响应实验：
在2.0mL EP管中依次加入RC-Br(1.0×10-3M,20.0μL)、1.0mL PBS缓冲溶液(0.1M,pH＝7.4)和不同浓度的ONOO-(0-100.0μM)，最后用二次水稀释到2.0mL。室温下，检 测RC-Br对不同浓度ONOO-的荧光变化。设定RC-Br的λex/λem＝400/520nm，测量时激发 和发射的狭缝均设为2.0nm。如图1所示，当用400nm激发时，探针在520nm处无明显 荧光信号，与不同浓度的ONOO-反应后，在520nm处荧光信号显著增强。
接着，研究了探针的选择性。图4表明其它潜在干扰物质均不能引起探针的荧光变化， 包括NO、1O2、·OH、H2O2、HS-、ONOO-、O2 ·-、ClO-、SO4 2-、CO3 2-、Cu2+、K+、Mg2+、 Hcy、GSH、Cys、和Vc等。相比之下，RC-Br只在ONOO-存在时表现出明显的荧光信号 增强。综上所述，探针RC-Br对ONOO-具有高度的特异性，可用于生理环境中ONOO-的 荧光可视化研究。
然后，研究了探针对ONOO-的动力学响应。如图6所示，探针自身在520nm处荧光 信号很弱，当加入100μM的ONOO-之后，其荧光信号瞬间增强，在10s内到达平衡，实 验表明探针能够快速响应ONOO-。
之后，研究了探针在不同pH值环境下对ONOO-的荧光响应变化。如图8所示，探针RC-Br在pH＝4.0-10.0范围内有较好的稳定性。设定RC-Br的λex/λem＝400/520nm，在pH ＝7.0-9.0范围内，探针RC-Br对ONOO-有较好的荧光响应。因此，探针RC-Br也能在生理 环境中检测ONOO-。
最后，研究了探针RC-Br与ONOO-的反应产物。探针RC-Br溶解在色谱纯乙腈中，加入待测物ONOO-混合均匀，高分辨质谱检测。探针RC-Br与ONOO-反应加成后重排得到两 个香豆素衍生产物，其中一个溴代香豆素化合物是无发射荧光的，另一个7-(二乙胺基)香豆 素化合物有较强的发射荧光(λex/λem＝400/520nm)。如图10所示，从质谱图可验证探针RC-Br与ONOO-反应得产物峰[M-H]-＝336.1239和[M-H]-＝238.9383/240.9393。
探针对H2S的荧光响应实验：
在2.0mL EP管中依次加入RC-Br(1.0×10-3M,20.0μL)、1.0mL PBS缓冲溶液(0.1M,pH＝7.4)和不同浓度的H2S(0-100.0μM)，最后用二次水稀释到2.0mL。室温下，检测 RC-Br对不同浓度ONOO-的荧光变化。设定RC-Br的λex/λem＝480/580nm，测量时激发和 发射的狭缝均设为2.0nm。如图2所示，当用480nm激发时，探针在580nm处无明显荧 光信号，与不同浓度的H2S反应后，在580nm处荧光信号显著增强。随后，相同条件下分别 检测RC-Br对不同浓度ONOO-(0-100.0μM)的荧光变化(λex/λem＝400/520nm)和RC-Br对不同浓度 H2S(0-100.0μM)的荧光光谱(λex/λem＝400/580nm)，即相同激发波长(λex＝400nm)激发得到不同 发射波长的两个荧光光谱图叠加合成一个谱图，如图3所示。测量时激发和发射的狭缝均设为2.0nm。RC-Br与ONOO-反应后在520nm处荧光信号显著增强；RC-Br与H2S反应后在580nm处荧光信号显著 增强。
接着，研究了探针的选择性。图5表明其它潜在干扰物质均不能引起探针的荧光变化， 包括NO、1O2、·OH、H2O2、ONOO-、ONOO-、O2 ·-、ClO-、SO4 2-、CO3 2-、Cu2+、K+、 Mg2+、Hcy、GSH、Cys、和Vc等。相比之下，RC-Br只在HS-存在时表现出明显的荧光 信号增强。综上所述，探针RC-Br对H2S具有高度的特异性，可用于生理环境中H2S的 荧光可视化研究。
然后，研究了探针对H2S的动力学响应。如图7所示，探针自身在580nm处荧光信 号很弱，当加入100μM的H2S之后，其荧光信号瞬间增强，在10s内到达平衡，实验表 明探针能够快速响应H2S。
之后，研究了探针在不同pH值环境下对H2S的荧光响应变化。如图9所示，探针RC-Br 在pH＝4.0-10.0范围内有较好的稳定性。设定RC-Br的λex/λem＝480/580nm，在pH＝6.0-9.0 范围内，探针RC-Br对H2S有较好的荧光响应。因此，探针RC-Br也能在生理环境中检测H2S。
最后，研究了探针RC-Br与H2S的反应产物。探针RC-Br溶解在色谱纯乙腈中，加入待 测物H2S混合均匀，高分辨质谱检测。探针与H2S发生加成反应。如图11所示，从质谱图 可验证RC-Br与H2S反应得产物峰[M-H]-＝576.0434/578.0453。
探针在细胞中荧光成像实验：
为了研究探针在细胞中荧光成像，本发明选用肝癌细胞为实验研究对象。细胞先用PBS 清洗后加入RC-Br(1.0μM)在37℃下孵育10min作为实验对照组。其它组巨噬细胞加入 不同物质处理细胞，然后加入RC-Br(1.0μM)在37℃下孵育10min。最后在共聚焦显微 镜下进行细胞成像。
外源性ONOO-的检测：如图12所示，用生理PBS缓冲清洗细胞三次后加入1mL PBS再加入RC-Br(1.0μM)，在37℃下孵育10min，再次清洗细胞后进行共聚焦显微镜成像，其 基本没有荧光信号。预先加入1.0mM的5-氨基-3-(4-吗啉基)-1,2,3-恶二唑盐酸盐 (3-Morpholinosydnonimine hydrochloride，SIN-1)[11]在37℃下孵育30min，然后再加入RC-Br (1.0μM)在37℃下孵育10min后成像，结果荧光信号显著增强。当预先加入1.0mM的 SIN-1在37℃下孵育30min，然后再加入100μM尿酸在37℃下孵育3h，最后加入RC-Br (1.0μM)在37℃下孵育10min进行细胞成像，其荧光信号相对较弱。实验说明，RC-Br 可以检测外源性的ONOO-。
外源性H2S的检测：如图13所示，用生理PBS清洗肝癌细胞后加入RC-Br(1.0μM) 37℃孵育10min，进行共聚焦显微镜成像，其荧光信号增强；当预先在细胞中加入2.0mM 的NEM在37℃下孵育2h，然后再加入RC-Br(1.0μM)37℃孵育10min后成像，结果荧 光信号相对降低；当外加100μM的H2S后37℃孵育20min，然后加入RC-Br(1.0μM)在 37℃孵育10min后进行细胞成像，其荧光信号明显增强；当向细胞外加100μM的H2S并在 37℃孵育20min，然后再加入2.0mM的NEM在37℃孵育2h，最后加入RC-Br(1.0μM) 在37℃孵育10min进行细胞成像，其荧光信号显著降低。本实验结果说明：细胞内的硫醇 等可能造成荧光干扰，但RC-Br对细胞中加入外源性的H2S的荧光信号增强还是很明显的。
最后，本发明选用肝癌细胞(HepG2)作为研究对象，利用双光子共聚焦显微镜对细胞 外源性的ONOO-和H2S进行荧光成像。如图14所示，设置双光子激发波长为800nm，采集 图像发射通道范围分别为450nm-530nm和570nm-650nm。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均 应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
参考文献
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Claims (6)

1.一种荧光探针，其特征在于，其结构式如下：
Figure FDA0002300181350000011
2.根据权利要求1所述荧光探针的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
将式1和3-乙酰基-6-溴香豆素溶解在的浓硫酸中，然后在80-95℃加热10-15h；冷却至室温，倒入冰水中，搅拌15-25min后过滤，冷水洗涤，真空干燥得粗品；将所得粗品用硅胶柱层析纯化，即得；式1的结构式为：
Figure FDA0002300181350000012
3.根据权利要求2所述荧光探针的合成方法，其特征在于，式1和3-乙酰基-6-溴香豆素按照物质的量比1:1混合。
4.根据权利要求2所述荧光探针的合成方法，其特征在于，在90℃加热12h。
5.根据权利要求2所述荧光探针的合成方法，其特征在于，硅胶柱层析所用洗脱剂为二氯甲烷和甲醇。
6.根据权利要求5所述荧光探针的合成方法，其特征在于，二氯甲烷和甲醇体积比为10:1。
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