CN109734710A - 一种检测半胱氨酸的荧光探针及其合成方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测半胱氨酸的荧光探针及其合成方法和应用，属于化学分析检测技术领域。本发明探针由具有绿色荧光发射的苯并噻唑吩噻嗪荧光团与2,4‑二硝基苯磺酰氯反应得到，其具有如下结构通式：此探针的荧光团为苯并噻唑吩噻嗪，对半胱氨酸的响应基团为2,4‑二硝基苯磺酰基。该探针分子对半胱氨酸有高的选择性和灵敏度，检测范围为0–10μmol·L^‑1，检测限为0.12μmol·L^‑1。该探针可用于水体、土壤以及细胞内半胱氨酸的检测。

Description

一种检测半胱氨酸的荧光探针及其合成方法与应用

技术领域

本发明属于化学分析检测技术领域，具体涉及一种trun-on型检测半胱氨酸的荧光探针及其合方法和在检测半胱氨酸方面的应用。

背景技术

半胱氨酸(Cysteien,Cys)是一种具有重要的生物巯基分子，在人体内起着重要的生理作用，如体内相关多肽及蛋白质的合成，与金属离子结合等。半胱氨酸的缺失会导致诸多症状及生理功能的异常，如头发脱色，生长缓慢，肝损伤及水肿。因此，开发高灵敏、高选择检测半胱氨酸的方法对阐明半胱氨酸的生理病理过程是非常必要的。

目前传统检测半胱氨酸的方法主要有液相色谱法(ZhangL.Anal.Bioanal.Chem.,2014,406,6723；Zhang L.J.Sep.Sci.,2014,37,30.)，毛细管电泳法(Ivanov A.J.Chromatogr.B,2015,1004,30.)，电化学方法(Lee P.Electroanalysis,2014,26,1488.)及比色法(Hao Y.Talanta,2013,115,253.)。但这些方法一般都耗时较长、涉及复杂繁琐的样品处理过程或需要昂贵的精密仪器等。而利用分子探针荧光法检测半胱氨酸具有样品处理简洁、成本低廉及操作简便快速等优点，近年来得到了快速发展与利用。但目前开发的用于检测半管氨酸的荧光探针分子其斯托克斯位移值小，这样激发光会引起干扰，不利于生物样品的检测。而大斯托克斯位移值的荧光探针能很好的克服这一问题。

发明内容

本发明目的在于提供一种大斯托克斯位移值的荧光探针，实现高灵敏度检测半胱氨酸；另一目的在于提供其制备方法。

为实现本发明目的，本发明利用半胱氨酸特有的反应性质，选择性地巯解2,4-二硝基苯磺酰酯；另一方面基于苯并噻唑吩噻嗪结构的荧光团具有斯托克斯位移值大，荧光效率高，灵敏度高的特点，且通过在酚羟基位引入吸电子基团改变原荧光骨架的推拉电子体系特性从而改变其荧光性质。基于此，设计了一种2,4-二硝基苯磺酰酯为响应基团，苯并噻唑吩噻嗪作为发光团的荧光分子探针，用于检测半胱氨酸。

所述检测半胱氨酸的荧光分子探针，结构式如下：

其中n为取自0–17的任一整数。优选：n为1–5整数。

进一步优选为：

其合成方法具体如下：

将化合物2与2,4-二硝基苯磺酰氯在碱性化合物催化下在有机溶剂中反应，分离纯化后得到最终目标产物探针分子1；其中n为取自0–17的任一整数。

所述有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮中的一种或几种；碱性化合物为碳酸钠，碳酸钾，三乙胺，N,N-二异丙基碳二亚胺的一种或两种。

其合成反应流程如下：

更进一步优选如下：

将化合物2(n取3)与2,4-二硝基苯磺酰氯及三乙胺在二氯甲烷溶液，室温下反应，减压蒸馏除去溶剂后分离纯化得到探针分子1。

利用该分子探针对半胱氨酸进行定性和定量测定，用于水体、土壤或生物体系中半胱氨酸的检测。

采用比色法或荧光法检测时，分子探针溶解于水与二甲基亚砜的混合缓冲溶液中，对半胱氨酸进行测试。当加入半胱氨酸后，半胱氨酸能亲核进攻苯氧基，并进一步通过脱除反应，使荧光团的酚羟基游离出来，从而产生强烈的分子内质子转移转移(ESIPT)效应，使探针溶液产生强的绿色荧光发射。

采用荧光法检测时，所述荧光分子探针对半胱氨酸的检测浓度为0–10μmol·L^-1，检测限为0.12μmol·L^-1。

本发明荧光探针分子具有如下特点和优点：

该荧光探针分子具有良好的稳定性和光学性质，单独溶液无荧光发射；随着半胱氨酸的加入，在～530nm处有强的荧光发射性质。

本发明所述的探针分子原料易得，合成产率较高，达87％以上，光学性能稳定(探针母液能在室内稳定存放三个月以上，其光谱性质保持不变)，高选择性和高灵敏度，对半胱氨酸识别能力强，响应速度较快，响应范围为0–10μmol·L^-1，检测限低(0.12μmol·L^-1)，因此，该类型探针可用于水体、土壤以及生物体系中半胱氨酸的检测。

附图说明

图1为本发明合成的分子探针的核磁共振氢谱；

图2为本发明分子探针与半胱氨酸反应前后的紫外谱图A与荧光光谱图B，其中，A图中，1-反应前，2-反应后；B图中，1-反应前，2-反应后；

图3为本发明5μmol·L^-1分子探针在加入不同浓度半胱氨酸后荧光发射光谱图，从a至u，半胱氨酸浓度分别为0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100μmol·L^-1，溶液体系为水与二甲基亚砜的混合缓冲溶液(H₂O/DMSO＝1/1,v/v,10mMHEPES,pH 7.4)，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图4为半胱氨酸的浓度标准曲线图，即5μmol·L^-1本发明分子探针，反应前后在530nm处荧光发射强度的和半胱氨酸浓度的线性关系；横坐标为半胱氨酸的浓度，纵坐标为荧光强度。

图5为本发明分子探针对半胱氨酸选择性；即5μM本发明分子探针，加入100μmol·L^-1不同物质(Ala、Asn、Arg、Asp、Gly、Gln、Glu、Lys、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Tyr、Thr、Ser、His、Ile、Val)后，在530nm处荧光发射强度的变化；横坐标为测试的干扰物质，纵坐标为荧光强度。

图6为本发明分子探针检测A549细胞内半胱氨酸的成像图片。(C,D)分别是本发明分子荧光探针(10μmol·L^-1)培养的A549的明场图片和荧光图片；(A,B)分别是本发明分子荧光探针(10μmol·L^-1)和N-乙基马来酰亚胺处理过A549细胞培养的明场图片和荧光图片。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：荧光分子探针的合成

将化合物2(80mg,0.2mmol)，三乙胺(24.0mg,0.24mmol)，2,4-二硝基苯磺酰氯(70.0mg,0.24mmol)，溶剂二氯甲烷(10mL)中室温下反应8h。待反应结束后，减压蒸馏除去溶剂，柱层析柱分离(洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝6:1，v/v)得到产物固体110g(收率：87％)。产物结构式如下:

1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.95(s,1H),8.25(d,J＝14.7Hz,2H),8.06(d,J＝6.8Hz,1H),7.89(d,J＝6.7Hz,1H),7.77(s,1H),7.46(d,J＝31.9Hz,2H),7.34–7.15(m,2H),7.16–6.96(m,2H),6.86(s,1H),3.81(s,2H),1.60(s,2H),1.36(s,2H),0.87(s,3H).MS[ESI]:m/z,calcd for[M+H]⁺635.0729,Found:635.0737。

实施例2：探针对半胱氨酸的荧光检测

将上述制得分子探针溶解于水与二甲基亚砜的混合缓冲溶液(H₂O/DMSO＝1/1,v/v,10mM HEPES,pH 7.4))，配制成5μmol·L^-1的探针溶液。在3mL的比色皿中加入2mL配制的5μmol·L^-1的本发明探针溶液，然后分别加入不同浓度的半胱氨酸均匀混合，测试其荧光光谱，结果如图3所示。以溶液在530nm处荧光发射强度对半胱氨酸的浓度作图，半胱氨酸浓度在0–10μmol·L^-1范围内时，两者之间呈现良好的线性关系(图4)，能实现该浓度范围内半胱氨酸的定量检测。并且此探针不受其它一些常见物质的影响，如Ala、Asn、Arg、Asp、Gly、Gln、Glu、Lys、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Tyr、Thr、Ser、His、Ile、Val。在上述干扰离子存在的条件下，探针对含半胱氨酸仍具有良好的选择性和灵敏度(图5)。

将细胞与含本发明探针培养液培养后，细胞荧光成像可观测到红色荧光(图6)。

可以看出，本发明能实现对半胱氨酸的定性、定量检测，灵敏度高，检测限达0.12μmol·L^-1，且抗干扰强，并能实现细胞内的半胱氨酸的检测。

Claims (8)

1.一种检测半胱氨酸的荧光分子探针，其特征在于，结构通式如下：

其中n为取自0–17的任一整数。

2.如权利要求1所述的检测半胱氨酸的荧光分子探针，其特征在于，n为1–5整数。

3.如权利要求2所述的检测半胱氨酸的荧光分子探针，其特征在于，n为3，荧光分子探针为：

。

4.合成如权利要求1所述的检测半胱氨酸的荧光分子探针的方法，其特征在于，通过如下方法实现：

化合物2与2,4-二硝基苯磺酰氯在碱性化合物催化下在有机溶剂中反应，分离纯化后得到最终目标产物探针分子1；其中n为取自0–17的任一整数；

所述有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮中的一种或几种；碱性化合物为碳酸钠，碳酸钾，三乙胺，N,N-二异丙基碳二亚胺的一种或两种。

5.合成权利要求3所述的检测半胱氨酸的荧光分子探针的方法，其特征在于，通过如下方法实现：

化合物2与2,4-二硝基苯磺酰氯及在三乙胺催化下，在二氯甲烷溶液中室温下反应，减压蒸馏除去溶剂后分离纯化得到探针分子1。

6.如权利要求1-3其中之一所述的检测半胱氨酸的荧光分子探针的应用，其特征在于，利用该分子探针对水体、土壤或生物体系中半胱氨酸进行定性或定量测定。

7.如权利要求6所述的检测半胱氨酸的荧光分子探针的应用，其特征在于，采用比色法或荧光检测时，将所述分子探针溶解于含水与二甲基亚砜的混合溶液缓冲体系中，对水体、土壤中半胱氨酸进行定量检测。

8.如权利要求6所述的检测半胱氨酸的荧光分子探针的应用，其特征在于，将探针与细胞培养，定性检测细胞中的半胱氨酸。