CN109734711A - 一种检测过硫化氢的荧光探针及其合成方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测过硫化氢的荧光探针及其合成方法和应用，属于化学分析检测技术领域。本发明探针由具有绿色荧光发射的苯并噻唑吩噻嗪荧光团与2‑氟‑5‑硝基苯甲酸反应得到，具有如下结构通式：此探针的荧光团为苯并噻唑吩噻嗪，对过硫化氢的响应基团为2‑氟‑5‑硝基苯甲酸酯。该探针分子对过硫化氢有高的选择性和灵敏度，检测范围为0–8μmol·L^‑1，检测限为26 nmol·L^‑1。该探针可用于水体、土壤以及细胞内过硫化氢的检测。

Description

一种检测过硫化氢的荧光探针及其合成方法与应用

技术领域

本发明属于化学分析检测技术领域，具体涉及一种trun-on型检测过硫化氢的荧光探针及其合方法和在检测过硫化氢方面的应用。

背景技术

过硫化氢(hydrogen persulfide,H₂S₂)是一种重要的生物含硫分子，参与细胞保护作用的相关生理过程。此外过硫化氢还起着其它的一些生理调节功能，如作为转录激活因子，离子通道，肿瘤抑制等。因此，开发高灵敏、高选择检测过硫化氢的方法对阐明过硫化氢的生理病理过程是非常必要的。

基于荧光探针的荧光检测法具有响应速度快，灵敏度、选择性高，样品处理简单，能实现细胞内测试等优点，因此，为一种重要小分子的有效检测手段。但目前已经报道的用于过硫化氢检测的荧光探针分子其斯托克斯位移值小，且信噪比不高。这样激发光容易引起干扰且灵敏度不够，因此，不利于生物样品的检测。而具有大斯托克斯位移值和高信噪比的荧光探针能很好的克服这一问题。

发明内容

针对目前技术现状，本发明目的在于提供一种易于制备、性能稳定、具有较大斯托克斯位移值的新型检测过硫化氢荧光分子探针，并提供该探针的合成方法，还在此基础开发出对过硫化氢进行高选择性和高灵敏度的检测方法。

为实现本发明目的，本发明利用过硫化氢特有的反应性质，能选择性地与2-氟-5-硝基苯甲酸发生双亲核反应；另一方面基于苯并噻唑吩噻嗪结构的荧光团具有斯托克斯位移值大，荧光效率高，灵敏度高的特点，且通过在酚羟基位引入吸电子基团能改变原荧光骨架的推拉电子体系特性从而改变其荧光性质。基于此，设计了一种2-氟-5-硝基苯甲酸酯为响应基团，苯并噻唑吩噻嗪作为发光团的用于检测过硫化氢的荧光分子探针。

所述检测过硫化氢的荧光分子探针，结构式如下：

其中n为取自0–17的任一整数。优选：n为1–5的任一整数。

进一步优选为：

其合成方法具体如下：

将化合物2与2-氟-5-硝基苯甲酸在催化剂作用下在有机溶剂中反应，分离纯化后得到最终目标产物探针分子1；其中n为取自0–17的任一整数。

所述有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮中的一种或几种；催化剂为4-二甲氨基吡啶，二环己基碳二亚胺，N,N-二异丙基碳二亚胺，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺中的一种或两种。

其合成反应流程如下：

更进一步优选如下：

将化合物2(n取3)与2-氟-5-硝基苯甲酸在含4-二甲氨基吡啶及二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液中室温下反应，减压蒸馏除去溶剂后分离纯化得到探针分子1。

利用该分子探针对过硫化氢进行定性和定量测定，用于水体、土壤或生物体系中过硫化氢的检测。

采用比色法或荧光法检测时，分子探针溶解于水与乙腈的混合缓冲溶液中，对过硫化氢进行测试。当加入过硫化氢后，过硫化氢能亲核取代氟原子，剩余的另外一个巯基进一步进攻酯键的羰基从而发生脱除反应，使荧光团的酚羟基游离出来，从而产生强烈的分子内质子转移(ESIPT)效应，使探针溶液产生强的绿色荧光发射。

采用荧光法检测时，所述荧光分子探针对过硫化氢的检测浓度为0–8μmol·L^-1，检测限为26nmol·L^-1。

本发明荧光探针分子具有如下特点和优点：

该荧光探针分子具有良好的稳定性和光学性质，单独溶液无荧光发射；随着过硫化氢的加入，在534nm处有强的荧光发射性质。

本发明所述的探针分子原料易得，合成产率较高，达87％以上，光学性能稳定(探针母液能在室内稳定存放三个月以上，其光谱性质保持不变)，高选择性和高灵敏度，对过硫化氢识别能力强，响应速度较快，响应范围为0–8μmol·L^-1，检测限低(26nmol·L^-1)，因此，该类型探针可用于水体、土壤以及生物体系中过硫化氢的检测。

附图说明

图1为本发明合成的分子探针的核磁共振氢谱；

图2为本发明5μmol·L^-1分子探针在加入不同浓度过硫化氢后荧光发射光谱图，从a至y，过硫化氢浓度分别为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100μmol·L^-1，溶液体系为水与乙腈的混合缓冲溶液(H₂O/MeCN＝7/3,v/v,10mMHEPES,pH 7.4)，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图3为过硫化氢的浓度标准曲线图，即5μmol·L^-1本发明分子探针，反应前后在534nm处荧光发射强度的和过硫化氢浓度的线性关系；横坐标为过硫化氢的浓度，纵坐标为荧光强度。

图4为本发明分子探针对过硫化氢选择性；即5μM本发明分子探针，加入100μmol·L^-1不同物质，(从1-21，加入物质分别为S₂ ^2-、S^2-、S₂O₃ ^2-、SO₃ ^2-、SO₄ ^2-、HSO₄ ^-、S₂O₈ ^2-、S₂O₅ ^2-、Cr₂O₇ ^2-、ClO₄ ^-、IO₄ ^-、NO₂ ^-、NO₃ ^-、CO₃ ^2-、HCO₃ ^-、Ca²⁺、Mg²⁺、ClO^-、半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽、H₂O₂)，在534nm处荧光发射强度的变化；横坐标为测试的干扰物质，纵坐标为荧光强度。

图5为本发明分子探针检测A549细胞内过硫化氢的成像图片。(A,B)分别是本发明分子荧光探针(10μmol·L^-1)培养的A549的明场图片和荧光图片；(C,D)分别是本发明分子荧光探针(10μmol·L^-1)和过硫化氢处理过的A549细胞培养的明场图片和荧光图片。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：荧光分子探针的合成

将化合物2(80.8mg,0.2mmol)，2-氟-5-硝基苯甲酸(56mg,0.3mmol),，二环己基碳二亚胺(54mg,0.26mmol)，4-二甲氨基吡啶(4mg,0.034mmol)加入到溶剂二氯甲烷(15mL)中室温下反应12h。待反应结束后，减压蒸馏除去溶剂，柱层析柱分离(洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝5:1，v/v)得到产物固体68.6mg(收率：87％)。产物结构式如下:

1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.02(s,1H),8.70(s,1H),8.06(d,J＝7.0Hz,1H),7.95(s,1H),7.91–7.77(m,1H),7.74(d,J＝7.3Hz,1H),7.35(ddd,J＝38.5,19.1,7.3Hz,5H),7.19–6.92(m,2H),3.95(s,2H),1.71(s,2H),1.42(d,J＝5.7Hz,2H),0.89(s,3H).MS[ESI]:m/z,calcd for[M+H]⁺572.1114,Found:572.1121。

实施例2：探针对过硫化氢的荧光检测

将上述制得分子探针溶解于水与乙腈的混合缓冲溶液(H₂O/CH₃CN＝1/1,v/v,10mMHEPES,pH 7.4))，配制成5μmol·L^-1的探针溶液。在3mL的比色皿中加入2mL配制的5μmol·L^-1的本发明探针溶液，然后分别加入不同浓度的过硫化氢均匀混合，测试其荧光光谱，结果如图2所示。以溶液在530nm处荧光发射强度对过硫化氢的浓度作图，过硫化氢浓度在0–8μmol·L^-1范围内时，两者之间呈现良好的线性关系(图3)，能实现该浓度范围内过硫化氢的定量检测。并且此探针不受其它一些常见物质的影响，如S^2-、S₂O₃ ^2-、SO₃ ^2-、SO₄ ^2-、HSO₄ ^-、S₂O₈ ^2-、S₂O₅ ^2-、Cr₂O₇ ^2-、ClO₄ ^-、IO₄ ^-、NO₂ ^-、NO₃ ^-、CO₃ ^2-、HCO₃ ^-、Ca²⁺、Mg²⁺、ClO^-、半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽、H₂O₂。在上述干物存在的条件下，探针对含过硫化氢仍具有良好的选择性和灵敏度(图4)。

将细胞与含本发明探针培养液培养后，细胞荧光成像可观测到绿色荧光(图5)。

可以看出，本发明能实现对过硫化氢的定性、定量检测，灵敏度高，检测限达26nmol·L^-1，且抗干扰强，并能实现细胞内的过硫化氢的检测。

Claims (8)

1.一种检测过硫化氢的荧光分子探针，其特征在于，结构通式如下：

其中n为取自0–17的任一整数。

2.如权利要求1所述的检测过硫化氢的荧光分子探针，其特征在于，n为1–5的任一整数。

3.如权利要求2所述的检测过硫化氢的荧光分子探针，其特征在于，n为3，荧光分子探针为：

4.合成如权利要求1所述的检测过硫化氢的荧光分子探针的方法，其特征在于，通过如下方法实现：

将化合物2与2-氟-5-硝基苯甲酸在催化剂作用下在有机溶剂中反应，分离纯化后得到最终目标产物探针分子1；其中n为取自0–17的任一整数；

所述有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮中的一种或几种；催化剂为4-二甲氨基吡啶，二环己基碳二亚胺，N,N-二异丙基碳二亚胺，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺中的一种或两种。

5.合成如权利要求3所述的检测过硫化氢的荧光分子探针的方法，其特征在于，通过如下方法实现：

将化合物2与2-氟-5-硝基苯甲酸在含4-二甲氨基吡啶及二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液中室温下反应，减压蒸馏除去溶剂后分离纯化得到探针分子1。

6.如权利要求1-3其中之一所述的检测过硫化氢的荧光分子探针的应用，其特征在于，利用该分子探针对水体、土壤或生物体系中过硫化氢进行定性或定量测定。

7.如权利要求6所述的检测过硫化氢的荧光分子探针的应用，其特征在于，采用荧光检测时，将所述分子探针溶解于含水与乙腈的混合溶液缓冲体系中，对水体、土壤中过硫化氢进行定量检测。

8.如权利要求6所述的检测过硫化氢的荧光分子探针的应用，其特征在于，将探针与细胞培养，定性检测细胞中的过硫化氢。