CN108982447B - 一种用于检测肼的比率式荧光探针的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于检测肼的比率式荧光探针的制备方法及应用。三氯氧磷溶于二氯甲烷中缓慢滴入N,N‑二甲基酰胺中，滴加完毕后，再加入环己酮反应得到化合物1。然后将苯并吲哚与碘乙烷溶于乙腈中加热回流反应得到化合物2。化合物1与化合物2以甲苯与正丁醇为溶剂，加热回流得到荧光探针化合物3。化合物3溶于无水N,N‑二甲基酰胺中,加入醋酸钠在氮气保护条件下反应生成化合物4。将化合物4溶于含有乙酰氯无水二氯甲烷中，加入三乙胺后在氮气保护下常温反应4小时生成探针Ben‑Cy1。该探针在近红外区工作，适用于生物样本中的定性、定量分析，低生物毒性、高选择性；可应用于分析化学、生命有机分析化学等相关领域。

Description

一种用于检测肼的比率式荧光探针的制备方法及应用
技术领域
本发明属于分析化学领域，涉及一种用于检测肼的比率式荧光探针的制备方法及应用。
背景技术
肼（N2H4）因其易燃和可爆特性而被众所周知为各种火箭燃料和低功率单组元推进剂。它在涉及催化剂，摄影用化学品，杀虫剂，各种染料，医药中间体等的化学，医药和农业工业中发挥着重要作用。然而，肼的毒性很高，肼暴露在高浓度水平可能会对肝脏，肺脏，肾脏，特别是对人体神经系统造成严重损害。由此，开发可靠、灵敏的分析手段用于肼的精确检测是非常重要的。肼的常规检测方法有电化学分析法、色谱法以及毛细管电泳法。然而这些检测方法均需要特殊装置，样品制备过程复杂，价格高，且由于组织或细胞的破坏而不利于肼在活细胞中的分析。而荧光分析法因其灵敏度度高、选择性好、经济、操作简便等优势而被大范围地应用在环境监测以及疾病诊断中。目前所报道的相关肼检测用荧光探针仍然有限，发展生理条件下检测活细胞中肼浓度的探针有很大的应用前景。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述问题，提供一种检测肼的比率式荧光探针的制备方法，制备得到的分子探针可应用与生物样本检测，具有低生物毒性、选择性好、现象明显易观察和准确度高等优点，设备便捷操作，可实施性强，特别适合大批量样本组合筛选等大数据研究。
本发明技术方案如下：
一种检测肼的比率式荧光探针的制备方法，采用以下步骤进行制备：
（1）将三氯氧磷溶于二氯甲烷中混合均匀后，滴入无水N,N-二甲基酰胺和二氯甲烷混合溶液中，滴加完毕后，再加入环己酮反应得到化合物1；
（2）将苯并吲哚与碘乙烷溶于乙腈中反应得到化合物2；
（3）将步骤（1）制备的化合物1与将步骤（2）制备的化合物2以甲苯与正丁醇混合溶剂为溶剂，加热回流得到荧光探针化合物3；
（4）将步骤（3）制备的化合物3溶于无水N,N-二甲基酰胺中, 加入乙酸钠在氮气条件下反应生成化合物4；
（5）将步骤（4）生成的化合物4溶于无水二氯甲烷中，加入乙酰氯，在冰浴中滴加三乙胺后在氮气保护下常温反应4小时生成检测肼的比率式荧光探针。
优选地,上述步骤具体的操作方法为：
（1）将40mL无水N,N-二甲基甲酰胺溶于 40mL二氯甲烷，倒入夹套瓶中-10℃冷却并搅拌 20 min得到混合溶液1；将27-47mL三氯氧磷溶于35mL二氯甲烷中，混合均匀后倒入恒压漏斗中, 缓慢滴加到混合溶液1中不断搅拌；滴加完毕后，加入 8-12g环己酮，溶液变为亮黄色时恢复到室温，然后缓慢加热至40℃，加热回流3h；回流结束后将反应液快速加入装有碎冰的烧杯中，冷却到室温后用二氯甲烷萃取，旋蒸得化合物1；
（2）将30ml-70ml的苯并吲哚和30mL-70mL的碘乙烷加入到500mL的三口烧瓶中，加入200mL乙腈，加热回流24h；冷却至室温后过滤，过滤沉淀物经石油醚洗涤后放置于烧杯中，沉淀物晾干得化合物2；
（3）将步骤（1）制备的化合物1与步骤（2）制备的化合物2加入到100 mL甲苯-正丁醇混合溶剂中充分溶解，化合物1的溶解浓度为0.017g/mL , 化合物2的溶解浓度为0.037g/mL，除去反应过程中产生的水，加热回流 3-5h，停止反应后溶液在旋转蒸发仪上浓缩旋干；粗产品柱层析色谱进行纯化，洗脱剂选择乙酸乙酯：甲醇＝8:1. (V/V)，得化合物3其中所述的甲苯-正丁醇混合溶剂中甲苯和正丁醇的体积比为3:7；
（4）将步骤（3）制备的化合物3溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺中, 溶解浓度0.025g/mL, 然后加入乙酸钠, 乙酸钠溶解浓度0.006 g/mL；将混合物在60℃-90℃下在氮气保护下过夜反应，然后冷却至室温并用二氯甲烷萃取，反复萃取4-5次，用饱和的碘化钾水溶液洗涤3次后，混合物用无水硫酸钠干燥，然后过滤，滤液真空干燥后进行柱层析,用体积比为从1:0～14:1的二氯甲烷-甲醇体系洗脱剂梯度洗脱，得化合物4；
（5）将步骤（4）制备的化合物4溶于无水二氯甲烷溶液, 溶解浓度0.015g/mL，加入乙酰氯，乙酰氯浓度为0.005g/mL，在氮气保护下在冰浴中滴加三乙胺，三乙胺浓度为0.001g/mL，所得混合物室温搅拌4-6小时，反应完成后，将产物真空干燥后进行柱层析，用体积比为从1:0～4:1的乙酸乙酯-甲醇体系洗脱剂梯度洗脱，得到产物即为检测肼的比率式荧光分子探针。
上述检测肼的比率式荧光分子探针的效果判断指标如下：
检测灵敏度：检测限15.2nmol/L；
检测响应倍率：荧光探针在 825nm处的荧光强度明显地降低，在662nm处的荧光强度显著增加；
颜色变化：日光灯下表现为由绿色变为红色；
光学机理指标：π电子体系的重排检测肼的比率式荧光分子探针。
上述方法检测肼的比率式荧光分子探针在试剂或试剂盒中的应用,该试剂或试剂盒适用于生物样本中肼的定性或定量分析；其中所述生物样本为活细胞、活体和生命有机分析化学中的一种。
上述方法检测肼的比率式荧光分子探针的应用，适用于生物样本中肼的定性或定量分析；其中所述生物样本为活细胞、活体和生命有机分析化学中的一种。
上述检测肼的比率式荧光分子探针定量分析生物样本中肼时，适用于检测水样中肼的量；定性检测生物样本中肼时，适用于在活细胞或活体内肼的检测。
上述检测水样中肼含量的方法，步骤包括：
1）配制溶液
探针储备液：准确称取检测肼的比率式荧光分子探针溶于醋酸盐缓冲液和DMSO，配制为浓度50μM的探针储备液；所述醋酸盐缓冲液的pH为 4.5，浓度为10mM；醋酸盐缓冲液和DMSO的体积比为1:9；
肼储备液：准确称取0.00032g肼溶于10mL去离子水中，配制为浓度1000μM的肼储备液；
2）建立水样-肼标准品的线性方程
将步骤1）配制的肼储备液用蒸馏水稀释得到梯度浓度为0～100μM的肼标准溶液，然后分别取100μL肼标准溶液与100μL步骤1）配制的探针储备液和650μL去离子水储备液混合后，加入50μL浓度为10 mM、 pH 4.5的醋酸盐缓冲液，充分振荡，使体系混合均匀，在25℃下放置不小于60min，然后经荧光分光光度计检测，建立水样-肼浓度与荧光信号强度的线性方程；优选地，体系混合均匀，在25℃下放置60min；
3）荧光检测待测水样中肼的含量
将1000μL待测样品加入到石英比色皿后，在荧光检测仪内进行扫描检测，收集荧光发射位置的强度数据代入水样-肼浓度与荧光信号强度的线性方程，计算得待测水样中肼含量；
上述方法的检测肼的比率式荧光分子探针的应用，检测待测水样品时，以荧光检测的方法对待测物进行平行检测，用肼标准品溶液进行校准，得到荧光检测的检测范围，根据不同样品所含待测物的浓度范围来选择荧光检测手段进行定量。
上述方法的检测肼的比率式荧光分子探针的应用，所述活细胞内肼的检测方法为：将待测活细胞样品在培养基中培育18～26h，待测活细胞接种量为2×107～9×107个/mL，加入检测肼的比率式荧光分子探针，探针浓度为5μM，分别加入0μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM的N2H4，根据所测得荧光探针的荧光发射，选择激发发射波长，在共聚焦激光扫描显微镜上来获取细胞的荧光图像，根据发光情况判断活细胞中是否能用探针检测肼，判断标准为：荧光在 825nm处的荧光强度明显地降低，而在662nm处的荧光强度显著增加；所述的活细胞优选为肝癌细胞，培养基优选为DMEM培养基。
上述方法的检测肼的比率式荧光分子探针的应用，活体内肼的检测方法为：在醋酸盐缓冲液和DMSO混合物中给予小鼠腹腔注射25μL，50μM Cy7A和随后的腹腔注射25μL，500μM N2H4，在分别孵育0,0.5,1,1.5,2和2.5小时后拍摄图像，根据发光情况判断在活体中是否能用探针检测肼，判断标准为：随着时间的增加，荧光在通道1处的荧光强度明显地降低，而在通道2处的荧光强度显著增加；其中所述醋酸盐缓冲液的pH为 4.5，浓度为10mM；醋酸盐缓冲液和DMSO混合物中醋酸盐缓冲液和DMSO的体积比为1:9；所述通道1：760-840 nm，λex=740nm；通道2：600-700 nm，λex= 530nm。
本发明成功合成一个新型高准确度、高选择性多功能荧光探针，并用于检测肼，并且系统地在试管中和细胞体内及活体进行研究。探针设计思路为合成苯并花菁（Benzocaine）作为基础母体环，先后引入乙酸酯基（Acetate），构成多功能超灵敏荧光探针分子BenCy1（2-((E)-2((E)-2-acetoxy-3-((E)-2-(3-ethyl-1,1-dimetyhyl-1H-benzo[e]indol-2(3H)-ylidene)ethylidence)cyclohex-1-en-1-yl)vinyl-3-ethyl-1,1-dimethyl-1H-benzo[e]indol-3-ium iodide）。实施检测时，加入待测物肼后，探针分子BenCy1的乙酸酯部分将被选择性地肼解，荧光信号发生改变。该探针呈现出优秀的特异性、准确性，同时该探针具有低生物毒性，可以在生理条件下检测活细胞中及活体内肼浓度。这些特征都使所得分子探针成功应用于生命体系中肼的精确检测。
本发明制备的比率式荧光分子探检测机理（如图1所示）：加入肼后，Ben-Cy1的乙酸酯部分将被选择性地肼解以留下Ben-Cy2的烯醇形式，其进一步经历互变异构以形成其相应的酮形式，从而荧光发生变化。
有益效果
本发明技术方案有益效果为：1）在不加任何其他附加材料的条件下，提高了检测准确性，并且避免了填加附加材料，减少附加材料的消耗以及减少了在检测中的误差来源；2）生物样品成像多种多样化：本发明在检测中成功检测了待测物在活细胞、小鼠中荧光成像，这种方法是在之前的方法中没有能够做到的。双光子成像的实现对于肼的深入研究起到很大的推动作用。
附图说明
图1为本发明制备的比率式荧光分子探针的合成路线；
图2为本发明实施例1制备的比率式荧光分子探针的H谱；
图3为本发明实施例1制备的比率式荧光分子探针的C谱；
图4为荧光定量的线性方程；
图5为细胞成像实验；
图6为对比试验细胞图；
图7为小鼠成像实验图；
图8为比率式荧光分子探针（5μM）与肼（100μM）在90min内的荧光响应图；
图9为探针对待测目标物肼梯度浓度的荧光响应图（肼浓度：0～100μM）；
图10为探针对待测物肼及其他物质选择性对照试验（其他物质）图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明技术方案，在围绕本发明所描述技术思想情况下，根据一般的技术知识和通常用的技术手段研究的多种方式替换或变更，都属于本发明的范围内。
本发明下述实施例中：
荧光检测是利用日立HitachiF-7000荧光光谱仪来进行，激发波长为740nm，发射波长为825nm，激发和发射狭缝宽度均为10.0nm，电压400V，扫描速度2400纳米/分；
荧光成像观测是通过Olympus, FV1100(Japan) 荧光共聚焦显微镜来进行；
化合物的分离提纯是采用薄层色谱硅胶柱来实现。
实施例1：制备比率式荧光分子探针
（1）40mL无水N,N-二甲基甲酰胺溶于 40mL二氯甲烷, 倒入夹套瓶中-10℃冷却并搅拌 20 min得到混合溶液1。将37mL三氯氧磷溶于35mL二氯甲烷中,混合均匀后倒入恒压漏斗中, 缓慢滴加到混合溶液1中，并用磁搅拌仪不断搅拌；滴加完毕后，将 10g环己酮粉末缓慢加入夹套瓶内，溶液变为亮黄色时恢复到室温再缓慢加热至40℃，加热回流 3h；回流结束后将反应液快速加入装有碎冰的烧杯中，冷却后用二氯甲烷萃取，旋蒸得化合物1；
（2）将50ml的苯并吲哚和50mL的碘乙烷加入到500mL的三口烧瓶中，加入200mL乙腈，加热回流24 h；冷却至室温后过滤，过滤沉淀物经石油醚洗涤后放置于烧杯中，沉淀物晾干得化合物2；
（3）将步骤（1）制备的化合物1与步骤（2）制备的化合物2加入到100 mL以甲苯-正丁醇混合溶剂中充分溶解，化合物1的溶解浓度为0.017g/mL , 化合物2的溶解浓度为0.037g/mL，除去反应过程中产生的水，加热回流 3h，停止反应后溶液在旋转蒸发仪上浓缩旋干；粗产品柱层析色谱进行纯化，洗脱剂选择乙酸乙酯：甲醇＝8:1. (V/V)，得化合物3；其中所述的甲苯-正丁醇混合溶剂中甲苯和正丁醇的体积比为3:7；
（4）将步骤（3）制备的化合物3溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺中, 溶解浓度0.025g/mL, 然后加入乙酸钠, 乙酸钠溶解浓度0.006 g/mL；将混合物在60℃-90℃下在氮气保护下过夜反应，然后冷却至室温并用二氯甲烷萃取，反复萃取几次。用饱和的碘化钾水溶液洗涤3次后，混合物用无水硫酸钠干燥，然后过滤,空干燥溶剂，粗产物进行柱层析用体积比为从1:0～14:1的二氯甲烷-甲醇体系洗脱剂梯度洗脱，得化合物4；
（5）将步骤（4）制备的化合物4溶于无水二氯甲烷溶液, 溶解浓度0.015g/mL，加入乙酰氯，乙酰氯浓度为0.005g/mL,在氮气保护下在冰浴中滴加三乙胺，三乙胺浓度为0.001g/mL，所得混合物室温搅拌5小时，反应完成后，将溶剂真空干燥，粗产物进行柱层析，用体积比为从1:0～4:1的乙酸乙酯-甲醇体系洗脱剂梯度洗脱，得到产物即为检测肼的比率式荧光分子探针。
制备得到的多比率式荧光分子探针的C谱及H谱图见图2和图3，效果判断指标如下：
检测灵敏度：检测限15.2nmol/L；
检测响应倍率：荧光探针在 825nm处的荧光强度明显地降低，在662nm处的荧光强度显著增加；
颜色变化：日光灯下表现为由绿色变为红色；
光学机理指标：π电子体系的重排检测肼的比率式荧光分子探针。
实施例1制备的探针与肼反应可行性验证：取0.1克比率式荧光分子探针溶于80mLDMSO中，向其中加入2倍当量肼并在室温下搅拌10min，得产物。
实施实例2：实施例1制备的比率式荧光分子探针定量分析生物样本中肼：检测水样中肼含量
1）配制溶液
探针储备液：准确称取检测肼的比率式荧光分子探针溶于醋酸盐缓冲液和DMSO，配制为浓度50μM的探针储备液；所述醋酸盐缓冲液的pH为 4.5，浓度为10mM；醋酸盐缓冲液和DMSO的体积比为1:9；
肼储备液：准确称取0.00032g肼溶于10mL去离子水中，配制为浓度1000μM的肼储备液；
2）建立水样-肼标准品的线性方程
将步骤1）配制的肼储备液用蒸馏水稀释得到梯度浓度为0～100μM的肼标准溶液，然后分别取100μL肼标准溶液与100μL步骤1）配制的探针储备液和650μL去离子水储备液混合后，加入50μL浓度为10 mM、 pH 4.5的醋酸盐缓冲液，充分振荡，使体系混合均匀，在25℃下放置60min，然后经荧光分光光度计检测，建立水样-肼浓度与荧光信号强度的荧光光谱及其线性拟合曲线。（图4-A）探针 Ben-Cy1（5μM）对不同浓度的 N2H4的荧光强度变化的比率，（图4-B）探针 Ben-Cy1（5μM）对不同浓度的 N2H4的荧光强度线性拟合曲线。
3）荧光检测待测水样中肼的含量
将1000μL待测样品加入到石英比色皿后，在荧光检测仪内进行扫描检测，收集荧光发射位置的强度数据代入水样-肼浓度与荧光信号强度的线性方程，计算得水样中肼含量；
将检测待测血清样品，以荧光检测的方法对待测物进行10次平行检测，并用肼标准品溶液进行校准，得到荧光检测的最优检测范围，从而根据不同样品所含待测物的浓度范围来选择荧光检测手段进行定量。
实施实例3：肝癌细胞内肼的检测，方法为：将肝癌细胞置入DMEM培养基中培育24h，等到肝癌细胞在培养基中接种量为2×107～9×107个/ mL，然后加入检测肼的比率式荧光分子探针，探针浓度为5μM，分别加入0μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM的N2H4，根据所测得荧光探针的荧光发射，选择不同的激发发射波长，在共聚焦激光扫描显微镜上来获取细胞的荧光图像，探针荧光在红色通道处的荧光强度明显地降低，而在绿色通道处的荧光强度显著增加，可判断能用探针在活细胞中检测肼。（红色通道700-800 nm（λex=635nm）,绿色通道 600-700 nm（λex= 559 nm））。
图5a-图5e分别是分别随着时间的增加，用于红色通道 a）的荧光收集窗口：红色色通道 b）700-800 nm（λex=635nm）,绿色通道 b)600-700 nm（λex= 559 nm）荧光强度的变化；图c)（a和b）荧光比（F Green / F Red）图像；图d)：流式细胞仪分析图a中细胞；图e)：流式细胞仪分析图b中细胞。
对比试验分析：肝癌细胞分别与空白探针 (5μM)和肼(100μM)共培育后，进行检测，并未检测出荧光发射, 这表明探针对于细胞中的各种物质对荧光没有造成干扰。而后，加入10倍量的待测物肼，荧光比率变化得以顺利观察到。这说明探针可以应用于细胞成像方面。
图6a-图6b是肝癌细胞分别与空白探针 (5μM)和肼(100μM) 共培育60min后用于通道 1）的荧光收集窗口：通道 1）700-800 nm（λex=635nm）,通道 2)600-700 nm（λex= 559nm）荧光强度的变化；图6c为（图6a）中加为入10倍量的待测物肼，共培育60min后用于通道1）的荧光收集窗口：通道 1）700-800 nm（λex=635nm）,通道 2)600-700 nm（λex= 559 nm）荧光强度的变化。
实施实例4：小鼠活体内肼的检测，方法为：在醋酸盐缓冲液（pH 4.5,10mM）和DMSO（1/9，v / v）混合物中给予小鼠皮肤流注注射Ben-Cy1（25μL，50μM）和随后的皮肤流注注射N2H4（25μL，500μM））。在分别孵育0,0.5,1,1.5,2和2.5小时后拍摄图像。随着时间的增加,探针荧光在通道1处的荧光强度明显地降低，而在通道2处的荧光强度显著增加，可判断能用探针在小鼠体内中检测肼。（通道1：760-840 nm，λex= 740 nm。通道2：600-700 nm，λex=530 nm。）
图7a-图7e分别随着时间的增加，小鼠体内荧光强度的变化。（通道 1：760-840nm，λex= 740nm。通道 2：600-700 nm，λex= 530 nm。）
对比试验分析：小鼠体内分别腹腔注射空白探针 (50μM)和肼(500μM)共培育后，进行检测，并未检测出荧光发射, 这表明探针对于细胞中的各种物质对荧光没有造成干扰。而后，加入10倍量的待测物肼，荧光的比率变化得以顺利观察到。这说明探针可以应用于小鼠成像方面。
上述实施例2-实施例4所述的探针的检测肼的方法，同样适合于包含该探针的试剂或试剂盒在检测肼中的应用，检测方法同实施例2-实施例4。
本发明比率式荧光分子探针各项技术指标的实验验证，具体如下：
本发明技术方案实验条件优化试验
1、反应体系时间的优化
一般而言，反应时间影响有机分子探针的荧光性质，针对本发明要探测的肼本身特点，研究了在一定时间段的荧光变化。从图8中可见，当反应时间为60min已经达到最大反应程度此后达到平台达到最优化。
2光学性质与机理验证
探针对待测目标物肼梯度浓度0～100M的荧光响应如图9示。
4、探针分子检测肼分析
下述物质储备液配制方法：分别用蒸馏水溶解N2H4（100μM）或其他离子后，Ben-Cy1（5μM）在662nm和825nm（F 662nm / F 825nm）的荧光强度比。（Na +，Ca2 +，Mg2 +，Cd2 +，Pb2 +，Ni2 +，Cu2+，Al3 +，Co3 +，HPO42-，ClO4-，CO32-，Cl-，(均为200μM）。在室温下，在乙酸盐缓冲液（pH4.5,10mM）和DMSO（1/9，v / v）的混合物中反应60分钟后记录数值。其中图10中1-14分别为N2H4，Na +，Ca2 +，Mg2 +，Cd2 +，Pb2 +，Ni2 +，Cu2+，Al3 +，Co3 +，HPO42-，ClO4-，CO32-，Cl-荧光强度比。
首先，相比较待测物肼而言，探针对其他各种离子未表现出响应，这是由于肼具有不同于其他离子的结构所导致的。其次，动力学曲线可以看出，当反应时间为60min已经达到最大反应程度此后达到平台达到最优化。

Claims (11)

1.一种检测肼的比率式荧光探针的制备方法，其特征在于，采用以下步骤进行制备：
（1）将三氯氧磷溶于二氯甲烷中混合均匀后，滴入无水N,N-二甲基酰胺和二氯甲烷混合溶液中，滴加完毕后，再加入环己酮反应得到化合物1；
（2）将苯并吲哚与碘乙烷溶于乙腈中反应得到化合物2；
（3）将步骤（1）制备的化合物1与将步骤（2）制备的化合物2以甲苯与正丁醇混合溶剂为溶剂，加热回流得到荧光探针化合物3；
（4）将步骤（3）制备的化合物3溶于无水N,N-二甲基酰胺中, 加入乙酸钠在氮气条件下反应生成化合物4；
（5）将步骤（4）生成的化合物4溶于无水二氯甲烷中，加入乙酰氯，在冰浴中滴加三乙胺后在氮气保护下常温反应4小时生成检测肼的比率式荧光探针；
步骤（5）生成检测肼的比率式荧光探针的结构为
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
2.根据权利要求1所述的检测肼的比率式荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤具体的操作方法为：
（1）将40mL无水N,N-二甲基甲酰胺溶于 40mL二氯甲烷, 倒入夹套瓶中-10℃冷却并搅拌 20 min得到混合溶液1；将27-47mL三氯氧磷溶于35mL二氯甲烷中，混合均匀后倒入恒压漏斗中, 缓慢滴加到混合溶液1中不断搅拌；滴加完毕后，加入 8-12g环己酮，溶液变为亮黄色时恢复到室温，然后缓慢加热至40℃，加热回流3h；回流结束后将反应液快速加入装有碎冰的烧杯中，冷却到室温后用二氯甲烷萃取，旋蒸得化合物1；
（2）将30ml-70ml的苯并吲哚和30mL-70mL的碘乙烷加入到500mL的三口烧瓶中，加入200mL乙腈，加热回流24h；冷却至室温后过滤，过滤沉淀物经石油醚洗涤后放置于烧杯中，沉淀物晾干得化合物2；
（3）将步骤（1）制备的化合物1与步骤（2）制备的化合物2加入到100 mL甲苯-正丁醇混合溶剂中充分溶解，化合物1的溶解浓度为0.017g/mL , 化合物2的溶解浓度为0.037g/mL，除去反应过程中产生的水，加热回流 3-5h，停止反应后溶液在旋转蒸发仪上浓缩旋干；粗产品柱层析色谱进行纯化，洗脱剂选择乙酸乙酯：甲醇＝8:1. (V/V)，得化合物3其中所述的甲苯-正丁醇混合溶剂中甲苯和正丁醇的体积比为3:7；
（4）将步骤（3）制备的化合物3溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺中, 溶解浓度0.025g/mL,然后加入乙酸钠, 乙酸钠溶解浓度0.006 g/mL；将混合物在60℃-90℃下在氮气保护下过夜反应，然后冷却至室温并用二氯甲烷萃取，反复萃取4-5次，用饱和的碘化钾水溶液洗涤3次后，混合物用无水硫酸钠干燥，然后过滤，滤液真空干燥后进行柱层析,用体积比为从1:0～14:1的二氯甲烷-甲醇体系洗脱剂梯度洗脱，得化合物4；
（5）将步骤（4）制备的化合物4溶于无水二氯甲烷溶液, 溶解浓度0.015g/mL，加入乙酰氯，乙酰氯浓度为0.005g/mL，在氮气保护下在冰浴中滴加三乙胺，三乙胺浓度为0.001g/mL，所得混合物室温搅拌4-6小时，反应完成后，将产物真空干燥后进行柱层析，用体积比为从1:0～4:1的乙酸乙酯-甲醇体系洗脱剂梯度洗脱，得到产物即为检测肼的比率式荧光分子探针。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述检测肼的比率式荧光分子探针的效果判断指标如下：
检测灵敏度：检测限15.2nmol/L；
检测响应倍率：荧光探针在 825nm处的荧光强度明显地降低，在662nm处的荧光强度显著增加；
颜色变化：日光灯下表现为由绿色变为红色；
光学机理指标：π电子体系的重排检测肼的比率式荧光分子探针。
4.一种权利要求1或2所述的方法制备得到的检测肼的比率式荧光分子探针的应用，其特征在于：适用于生物样本中肼的定性或定量分析；其中所述生物样本为活细胞、活体和生命有机分析化学中的一种。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于： 所述检测肼的比率式荧光分子探针定量分析生物样本中肼时，适用于检测水样中肼的量；定性检测生物样本中肼时，适用于在活细胞或活体内肼的检测。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述检测水样中肼含量的方法，步骤包括：
1）配制溶液
探针储备液：准确称取检测肼的比率式荧光分子探针溶于醋酸盐缓冲液和DMSO，配制为浓度50μM的探针储备液；所述醋酸盐缓冲液的pH为 4.5，浓度为10mM；醋酸盐缓冲液和DMSO的体积比为1:9；
肼储备液：准确称取0.00032g肼溶于10mL去离子水中，配制为浓度1000μM的肼储备液；
2）建立水样-肼标准品的线性方程
将步骤1）配制的肼储备液用蒸馏水稀释得到梯度浓度为0～100μM的肼标准溶液，然后分别取100μL肼标准溶液与100μL步骤1）配制的探针储备液和650μL去离子水储备液混合后，加入50μL浓度为10 mM、 pH 4.5的醋酸盐缓冲液，充分振荡，使体系混合均匀，在25℃下放置60min，然后经荧光分光光度计检测，建立水样-肼浓度与荧光信号强度的线性方程；
3）荧光检测待测水样中肼的含量
将1000μL待测样品加入到石英比色皿后，在荧光检测仪内进行扫描检测，收集荧光发射位置的强度数据代入水样-肼浓度与荧光信号强度的线性方程，计算得待测水样中肼含量。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：检测待测水样品时，以荧光检测的方法对待测物进行平行检测，用肼标准品溶液进行校准，得到荧光检测的检测范围，根据不同样品所含待测物的浓度范围来选择荧光检测手段进行定量。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：荧光检测范围为0-100μM。
9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述活细胞内肼的检测方法为：将待测活细胞样品在培养基中培育18～26h，待测活细胞接种量为2×107～9×107个/mL，加入检测肼的比率式荧光分子探针，探针浓度为5μM，分别加入0μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM的N2H4，根据所测得荧光探针的荧光发射，选择激发发射波长，在共聚焦激光扫描显微镜上来获取细胞的荧光图像，根据发光情况判断活细胞中是否能用探针检测肼，判断标准为：荧光在 825nm处的荧光强度明显地降低，而在662nm处的荧光强度显著增加。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的活细胞为肝癌细胞，培养基为DMEM培养基。
11. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：活体内肼的检测方法为：在醋酸盐缓冲液和DMSO混合物中给予小鼠腹腔注射25μL，50μM Cy7A和随后的腹腔注射25μL，500μM N2H4，在分别孵育0,0.5,1,1.5,2和2.5小时后拍摄图像，根据发光情况判断在活体中是否能用探针检测肼，判断标准为：随着时间的增加，荧光在通道1处的荧光强度明显地降低，而在通道2处的荧光强度显著增加；其中所述醋酸盐缓冲液的pH为 4.5，浓度为10mM；醋酸盐缓冲液和DMSO混合物中醋酸盐缓冲液和DMSO的体积比为1:9；所述通道1：760-840 nm，λex=740nm；通道2：600-700 nm，λex= 530nm。
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