CN103382189B

CN103382189B - 一类菁类化合物、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN103382189B
Application number: CN201210590813.1A
Authority: CN
Inventors: 彭孝军; 姜娜; 樊江莉; 王静云
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2012-12-28
Filing date: 2012-12-28
Publication date: 2015-08-12
Anticipated expiration: 2032-12-28
Also published as: CN103382189A

Abstract

本发明公开一类菁类化合物、其制备方法及应用。所述化合物具有通式Ⅰ的结构。该探针对环境黏度特别敏感，可以作为流体及其生物环境黏度的检测。该探针可以定位于不同亚细胞器，能够通过荧光比例和荧光寿命双模式来检测手段来监测活细胞中亚细胞器内黏度的变化。

Description

一类菁类化合物、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一类适用于精细化工领域中活细胞中亚细胞器内黏度检测的荧光探针化合物。该类化合物可以通过荧光比例和荧光寿命两种方法同时监测活细胞内亚细胞器中的黏度值。

背景技术

细胞内黏度在信号传递，核功能化，染色质定位，单线态氧的定位等生物过程中起着十分重要的作用。细胞内黏度的突然变化会导致相关的功能化缺陷和疾病。线粒体是细胞内的能量制造工厂，它对癌症，老年痴呆症，帕金森综合症等疾病都有着敏感的响应。线粒体膜黏度的降低，电子传输链活性的减弱，活性氧含量的增加，细胞色素c释放量的增加等均可以引起线粒体功能损伤。资料显示老年痴呆症和帕金森综合症的一个早期表现就是线粒体机能障碍。而线粒体机能障碍的一个重要表现就是线粒体黏度的增加。

Theodorakis和Suhling小组均报道了利用分子转子来检测细胞内黏度的荧光探针。彭孝军小组也报道了一种双模式检测细胞内黏度的荧光探针。这些探针都能够检测细胞内黏度变化，但是无法定位到特定亚细胞器上并且检测出其黏度值。例如传统方法中，如果要确定线粒体的黏度值，首先要通过差速离心法将细胞离心粉碎得到含有线粒体的悬浮溶液，紧接着将得到的线粒体悬浮溶液与DPH(1,6-二苯基l-1,3,5-己三烯)进行孵育，在通过荧光偏振显微镜测其荧光偏振度的变化值。最后，通过公式P=Ivv-Ivh/Ivv+Ivh,η=2P/0.46-P来估算出线粒体黏度的数值。很不幸的是，这种传统方法需要将线粒体在细胞中离心分离出来，然后再通过一系列测试计算得到线粒体黏度，并不能实时的监测活细胞内线粒体的黏度。

目前，对于监测细胞内亚细胞器中黏度的荧光探针还很少见，而具有双光子性能，通过比率荧光和荧光寿命两种模式同时监测亚细胞器黏度的荧光探针更为少见，因此研究和开发出能够具有双光子性能，通过双种模式同时监测亚细胞器中的黏度的荧光探针具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有检测技术的不足，提供一类具有双光子性能能够双模式监测亚细胞器黏度的荧光探针的合成及应用。

本发明首先提供一类监测亚细胞器黏度值的菁类化合物，具有通式Ⅰ的结构：

其中，

R₁选自C_1-18烷基、N(R₃)₂、吗啡啉基、取代或未取代的苯基；

R₂选自H、SO₃R₃和COOR₃；

R₃选自H和C_1-18烷基；

Y^-为Cl^-、Br、I^-或OTs^-；

n为0～18的整数

本发明另一方面的目的在于提供上述本发明通式I的化合物的制备方法，其合成路线如下：

（1）将Y取代的R₁化合物与R₂基团取代的2-甲基苯并噻唑在氮气保护下反应2-5h，冷却至室温。待固体完全沉降后，真空抽滤，所得固体用乙醚进行洗涤，最后将固体真空干燥，即得到中间体1a；

（2）在冰水浴条件下，将三氯氧磷滴加到N,N-二甲基甲酰胺溶液内，滴加完毕后，持续0°C继续反应3h后，撤去冰浴，分批次加入溴乙酸，加热回流24h。反应完毕后，将溶液倒入冰水中，分液，用无水硫酸镁将油层干燥后减压蒸馏。所得黄色液体用稀硫酸中和后，氯仿进行萃取，减压蒸馏掉溶剂得到的黄色固体1b；

（3）将中间体1a溶解于乙醇中，加入1b以及微量吡啶，加热回流即有染料I生成。在反应结束后，蒸去溶剂。优选用二氯甲烷/甲醇作为洗脱液进行色谱柱分离提纯产物。

上述本发明所提供的结构通式I的中位醛基取代的五甲川菁类化合物在乙醇内有410nm和610nm两组吸收峰，405nm激发时有456nm和660nm两组荧光发射峰。不仅660nm处荧光强度与456nm处荧光强度的比值与溶液的黏度有很好的线性关系，660nm处荧光寿命也有溶液黏度很好的符合公式。由于单纯的基于荧光强度的变化来测试溶液黏度值的变化容易受到溶液光学性质（如极性）、染料的浓度、实验条件和仪器等因素的影响。尤其在生物环境（细胞内）染料的不均匀分布，使得黏度的测试结果更加不准确。比例荧光探针能排除以上因素对实验的干扰，提高实验结果的准确性。对于荧光寿命探针来说，不仅可以像比例荧光探针那样能排除一些外来因素的干扰，并且荧光寿命探针本身不需要有两个发射峰，甚至不需要计算比例值，只需要做一些简单的系统矫正就能做到超灵敏检测。因此同时采用比例荧光成像和荧光寿命成像这种双模式的黏度荧光探针来研究细胞内的黏度，可大大提高检测结果的准确性和可靠性，使其具有更为广泛的应用领域。而上述本发明的通式I的化合物即可用于这种双模式的应用。

因此，本发明另一方面的目的在于提供上述化合物在制备用于监测活细胞内亚细胞器内黏度值的试剂中的应用。

具体实施方式

本发明所述的用于监测亚细胞器黏度值的菁类化合物，具有通式Ⅰ的结构：

其中，

通式I中，R₁选自C_1-18烷基、N(R₃)₂、吗啡啉基、取代或未取代的苯基；优选C_1-18烷基或苄基；更优选苄基；最为优选的是，R₁为苄基，直接连接于N上，即n=0。

通式I中，R₂选自H、SO₃R₃和COOR₃，其中R₃选自H和C_1-18烷基；优选R₂为H。

Y^-为Cl^-、Br、I^-或OTs^-；

n为0～18的整数。

最为具体地，本发明所述的中位醛基取代的中位醛基取代的五甲川菁类化合物为BFT：

即通式I的化合物中，R₁为苄基，R₂为H，n=0，Y^-为Br^-。

申请人相信，本领域技术人员可以根据现有技术信息设计本发明通式I的化合物的合成路线。比如：

更为具体地，本发明提供所述BFT的合成方法，其合成路线如下：

（1）将苄基溴与2-甲基苯并噻唑在氮气保护下反应2-5h，冷却至室温。待固体完全沉降后，真空抽滤，所得固体用乙醚进行洗涤，最后将固体真空干燥，即得到白色中间体1a；

该步骤中，2-甲基苯并噻唑与苄基溴反应时不需要溶剂；

该步骤优选在惰性气体保护下进行反应，这样可以使产率更高；

该反应时间优选65°C，反应时间优选3小时；

该反应2-甲基苯并噻唑与苄基溴的投料比为1:1.2~5；

（2）在冰水浴条件下，将三氯氧磷慢慢滴加到N,N-二甲基甲酰胺溶液内，滴加完毕后，持续0°C继续反应3h后，撤去冰浴，分批次加入溴乙酸，加热回流24h。反应完毕后，将溶液倒入冰水中，分液，用无水硫酸镁将油层干燥后减压蒸馏。所得黄色液体用稀硫酸中和后，氯仿进行萃取，减压蒸馏掉溶剂得到的黄色固体即为缩合剂丁三醛（1b）。

该反应往冰水中倾倒时，冰水量越多，越有益于丁三醛的析出。当冰水大约1L时，直接有丁三醛固体析出，带沉淀沉降后，直接减压抽滤得到丁三醛固体。

（3）将中间体1a溶解于乙醇中，加入丁三醛以及微量吡啶，加热回流即有蓝色染料BFT生成。在反应结束后，蒸去溶剂。优选用二氯甲烷/甲醇作为洗脱液进行色谱柱分离提纯产物。产物通过核磁和高分辨质谱进行表征。n=0，R₁为苯基，R₂为H：¹H NMR(400MHz,DMSO-d⁶):9.76(s,0.5H,CHO),8.19(d, J=7.9Hz,1H),7.96(d,J=14.3Hz,1H),7.92(d,J=8.4Hz,1H),7.71–7.58(m,2H),7.54(t,J=7.7Hz,1H),7.42–7.37(m,2H),7.33(t,J=6.3Hz,3H),5.87(s,2H,CH2)；¹³C NMR(101MHz,CDCl₃):δ195.60,137.40,123.98,122.67,121.29,116.29,93.76,82.22,80.91,28.35,26.27,19.50；HRMS-ESI:m/z calcd M⁺forC₃₄H₂₇N₂OS₂ ⁺,543.1559;found,543.1548。

该步骤优选在惰性气体保护下进行反应，这样可以使产率更高。

该步骤中微量吡啶的加入可以加快反应速度。

所得荧光染料可通过本领域公知的分离和纯化技术回收，以达到需要的纯度。

本发明中使用的各种原料均可市售获得，或者可通过本领域技术人员公知的方法或现有技术中公开的方法由本领域公知的原料简单地制备得到。

附图说明

本发明附图14幅：

图1是对本发明的荧光探针化合物BFT在不同溶剂里的双光子吸收截面测试。探针化合物BFT的浓度为100μM。

图2是本发明的荧光探针化合物BFT在不同比例的水-甘油混合溶液里面的紫外吸收谱图（图2a）；荧光发射谱图（图2b）和荧光强度的比率与溶液黏度值的线性谱图（图2c）。该荧光探针化合物BFT的浓度为1.0μM，激发波长为410nm。

图3是对本发明的荧光探针化合物BFT在不同水-甘油混合溶液里面的荧光寿命的测试。图3a为本发明的荧光探针BFT在658nm处的荧光寿命，图3b为pH为本发明的荧光探针BFT在658nm处荧光寿命与溶液黏度值的线性关系图。荧光探针化合物BFT的浓度是1.0μM，激发波长是405nm。

图4是考察本发明荧光探针化合物BFT对溶液极性干扰的测试。本测试是在不同比例的水-1,4-二氧六环溶液里面进行，激发波长是410nm。

图5是考察本发明的探针化合物BFT对牛血清蛋白和小牛胸腺DNA的干扰测试。图5a，5b分别为荧光探针化合物BFT与不同浓度的牛血清蛋白相互作用时的紫外吸收剂图谱图和荧光发射谱图；图5c，5d分别为荧光探针化合物BFT与不同浓度的小牛胸腺DNA相互作用时的紫外吸收剂图谱图和荧光发射谱图。荧光探针化合物BFT的浓度是1.0μM，激发波长是410nm。

图6是考察本发明的探针化合物BFT对兔免疫球蛋白和人血纤维蛋白的荧光寿命干扰测试。左图（6a）为荧光探针化合物BFT与不同浓度的兔免疫球蛋白相互作用时的荧光寿命变化柱形图；右图（6b）为荧光探针化合物BFT与不同浓度的人血纤维蛋白相互作用时的荧光寿命变化柱形图。荧光探针化合物BFT的浓度是1.0μM，激发波长是405nm。

图7是本发明的探针化合物BFT在人乳腺癌细胞MCF-7细胞内的比率荧光成像。荧光探针化合物BFT的浓度是0.8μM，激发波长是405nm。

图8是本发明的探针化合物BFT在人宫颈癌细胞HeLa细胞内的荧光寿命成像。荧光探针化合物BFT的浓度是0.8μM，激发波长是800nm。

图9是本发明的探针化合物BFT在人宫颈癌细胞HeLa细胞内的双光子激发荧光比率成像。荧光探针化合物BFT的浓度是0.8μM，激发波长是840nm。

图10是本发明的探针化合物BFT与商品化染料Mito Tracker Green FM在人宫颈癌细胞HeLa细胞内的复染实验。荧光探针化合物BFT的浓度是0.8μM，Mito Tracker Green FM的浓度是2.0μM。

图11是本发明的探针化合物BFT和商品化染料Mito Tracker Deep Red的MTT细胞毒性测试。

图12是本发明的探针化合物BFT和商品化染料Mito Tracker Green FM，Mito Tracker Red FM的线粒体膜电位干扰测试。

图13是本发明的探针化合物BFT通过荧光比率成像方法监测HeLa细胞在凋亡过程中的黏度变化过程。荧光探针化合物BFT的浓度是0.8μM，激发波长是405nm。

图14是本发明的探针化合物BFT通过荧光寿命成像方法监测HeLa细胞在凋亡过程中的黏度变化过程。荧光探针化合物BFT的浓度是0.8μM，激发波长是800nm。

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1.荧光探针化合物BFT的合成：

荧光探针化合物BFT的合成：

将中间体1（6.4g,20.0mmol）加入装有20mL干燥的乙醇500mL单口烧瓶中然后加入中间体2（1.1g,11.0mmol），加入1-3mL吡啶，氮气保护，加热回流，反应过程中取样点板，待蓝色发红色荧光物质生产量最多时停止反应，减压蒸除溶剂。色谱柱分离得到蓝色固体BFT。¹H NMR(400MHz,DMSO-d⁶):9.76(s,0.5H,CHO),8.19(d,J=7.9Hz,1H),7.96(d,J=14.3Hz,1H),7.92(d,J=8.4Hz,1H),7.71–7.58(m,2H),7.54(t,J=7.7Hz,1H),7.42–7.37(m,2H),7.33(t,J=6.3Hz,3H),5.87(s,2H,CH₂).

¹³C NMR(101MHz,CDCl₃):δ195.60,137.40,123.98,122.67,121.29,116.29,93.76,82.22,80.91,28.35,26.27,19.50.

HRMS-ESI:m/z calcd M+for C₃₄H₂₇N₂OS₂+,543.1559;found,543.1548.

实施例2.荧光探针化合物BFT双光子吸收截面的测试：

将本发明的荧光探针化合物BFT溶解于四氢呋喃，二甲基亚砜，水/甘油（1:1）等溶剂里，然后进行双光子吸收截面测试。探针化合物BFT的浓度为100μM，结果如图1所示。

实施例3.荧光探针化合物BFT对溶液黏度值的响应：

使用上述合成的化合物BFT评价对溶液黏度值的响应。将0.8μM的化合物BFT加到不同水-甘油比例的混合溶液中，410nm进行激发，收集420nm-750nm的荧光强度，测试结果显示于图2中。从图中可以看到，荧光探针化合物BFT对溶液的黏度值有很好的线性响应。随着溶液黏度的增加，467nm和660nm处的荧光强度均增加，而658nm处荧光强度增加倍数更大。而660nm与467nm处荧光强度的比值与溶液的黏度值呈现很好的线性关系，符合公式。

实施例4.荧光探针化合物BFT对溶液黏度值的响应：

使用上述合成的化合物BFT评价对溶液黏度值的响应。将0.8μM的化合物BFT 加到不同水-甘油比例的混合溶液中，405nm进行激发，收集658nm处的荧光寿命，测试结果显示于图3中。从图中可以看到，荧光探针化合物BFT对溶液的黏度值有很好的线性响应。随着溶液黏度的增加，658nm处的荧光寿命不断增加，并且与溶液的黏度值呈现很好的线性关系，符合公式。

实施例4.荧光探针化合物BFT检测溶液黏度值时极性干扰测试：

使用上述合成的化合物BFT评价溶液极性对测试溶液黏度值的干扰影响。将0.8μM的化合物BFT加到不同水-1，4二氧六环比例的混合溶液中，410nm进行激发，测试结果显示于图4中。从图中可以看到，荧光探针化合物BFT测试溶液的黏度值几乎不受溶液的极性影响。

实施例5.荧光探针化合物BFT检测溶液黏度值时牛血清蛋白和小牛胸腺DNA干扰测试：

使用上述合成的化合物BFT评价牛血清蛋白和小牛胸腺DNA对测试溶液黏度值的干扰影响。分别将0-2.0mg/mL的牛血清蛋白加入到0.8μM的化合物BFT的PBS溶液内，然后测试其紫外吸收和荧光发射，所得结果如图5a和图5b所示。分别将0-31.4mM的小牛胸腺DNA加入到0.8μM的化合物BFT的PBS溶液内，然后测试其紫外吸收和荧光发射，所得结果如图5c和图5d所示。从图中可以看到，牛血清蛋白和小牛胸腺DNA几乎不干扰荧光探针化合物BFT检测溶液的黏度值。

实施例6.荧光探针化合物BFT检测溶液黏度值时Rabbit Ig G(H+L)和人血纤维蛋白干扰测试：

使用上述合成的化合物BFT评价Rabbit Ig G(H+L)和人血纤维蛋白对测试溶液黏度值的干扰影响。分别将0-50.4μg/mL的Rabbit Ig G(H+L)或0-21.0μg/mL的人血纤维蛋白加入到0.8μM的化合物BFT的PBS溶液内，然后测试其荧光寿命的变化，所得结果如图6a和图6b所示。从图中可以看到，Rabbit Ig G(H+L)和人血纤维蛋白对荧光探针化合物BFT检测溶液的黏度值的干扰很小，在实际应用过程中可以接受。

实施例7.荧光探针化合物BFT在活细胞内比率成像：

MCF-7细胞在DEME（invitrogen）中用10%的FCS（invitrogen）培养。共聚焦荧光成像实验前一天，细胞种在专用的细胞共聚焦培养皿中。第二天，向其中加入0.8μM的探针化合物BFT，保持在37°C及5%CO₂条件下，孵育15分钟，然后用磷酸缓冲溶液冲洗3遍后，进行共聚焦成像。

细胞的培养密度为2×105cells/mL。成像所用仪器为Olympus FV1000-IX81倒置显微镜，100倍油镜。激发光为405nm激发，分别收集450-500nm和630-675nm波段。

图7a，7b分别是接收绿通道、红通道的荧光成像图，图7c是图7b/7a的荧光比率图。可以看到染料BFT可以通过荧光比率方法表现活细胞内的黏度分布。

实施例8.荧光探针化合物BFT在活细胞内荧光寿命成像：

HeLa细胞在DEME（invitrogen）中用10%的FCS（invitrogen）培养。共聚焦荧光成像实验前一天，细胞种在专用的细胞共聚焦培养皿中。第二天，向其中加入0.8μM的探针化合物BFT，保持在37°C及5%CO2条件下，孵育15分钟，然后用磷酸缓冲溶液冲洗3遍后，进行共聚焦成像。

细胞的培养密度为2×105cells/mL。成像所用仪器为TCSPC FLIM显微镜，100倍油镜。激发光为800nm激发，结果见图8。可以看到染料BFT可以通过荧光寿命方法表现活细胞内的黏度分布。

实施例9.荧光探针化合物BFT在活细胞内双光子激发荧光成像：

HeLa细胞在DEME（invitrogen）中用10%的FCS（invitrogen）培养。共聚焦荧光成像实验前一天，细胞种在专用的细胞共聚焦培养皿中。第二天，向其中加入0.8μM的探针化合物BFT，保持在37°C及5%CO₂条件下，孵育15分钟，然后用磷酸缓冲溶液冲洗3遍后，进行共聚焦成像。

细胞的培养密度为2×105cells/mL。成像所用仪器为Olympus FV1000-IX81倒置显微镜，100倍油镜。激发光为840nm激发，分别收集450-500nm和630-675nm波段。

图9a，9b，9c分别是接收绿通道、红通道的荧光成像图及白光图，图9d是图9b/9a的荧光比率图。可以看到染料BFT可以通过双光子激发在细胞内进行比率荧光成像。

实施例10.荧光显微镜下观察探针化合物BFT与Mito Tracker Green FM在活细胞的复染：

Mito Tracker Green FM是一种商品化线粒体绿色荧光探针，可以用于活细胞内线粒体特异性荧光染色。将探针化合物BFT与Mito Tracker Green FM分别对HeLa细胞进行活细胞染色，比较它们对活细胞的染色位置，能够进一步确定BFT对线粒体的特异性荧光标记。

HeLa细胞在DEME（invitrogen）中用10%的FCS（invitrogen）培养。共聚焦荧光成像实验前一天，细胞种在专用的细胞共聚焦培养皿中。第二天，向其中加入0.8μM的探针化合物BFT，保持在37°C及5%CO₂条件下，孵育15分钟，然后用磷酸缓冲溶液冲洗3遍。再加入2μM的市售染料Mito Tracker Green FM，保持在37°C及5%CO₂条件下，孵育15分钟，然后用磷酸缓冲溶液冲洗3遍后，进行共聚焦成像。

细胞的培养密度为2×105cells/mL。成像所用仪器为Olympus FV1000-IX81倒置显微镜，100倍油镜。BFT的激发光为635nm激发，收集630-675nm波段；Mito Tracker Green FM的激发波长为488nm，收集495-515nm波段。

从图10中可以看出，在HeLa细胞中，探针化合物BFT和Mito Tracker Green FM的染色位置基本吻合，表明BFT很好地定位于线粒体亚细胞器中。

实施例11.探针化合物BFT的细胞毒性测试

将要检测的MCF-7细胞用0.25%胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液配成单个细胞悬液，以每孔103～104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200μL；将培养板移入孵育箱中，37℃，5%CO₂及饱和湿度下培育24小时后，加入染料浓度为2μM，继续培养2小时；每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20μL，孵育4小时，终止培养，小心吸掉孔内培养上清液。然后，每孔加入150μL的DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分溶解；在酶标仪上测定各孔550nm处的吸光度，计算细胞存活率：试验组光吸光度/对照组吸光度值×100%。

从图11中可以看出，探针化合物BFT对MCF-7细胞无明显细胞毒性，孵育2小时后，细胞存活率可以达到96%以上。

实施例12.探针化合物BFT的线粒体膜电位干扰测试

MCF-7细胞在DEME（invitrogen）中用10%的FCS（invitrogen）培养。共聚焦荧光成像实验前一天，细胞种在专用的细胞共聚焦培养皿中。第二天，向其中分别加入2.0μM的Mito Tracker Green FM，2.0μM的Mito Tracker Red FM和0.8μM的探针化合物BFT，保持在37°C及5%CO₂条件下，孵育15分钟，然后用磷酸缓冲溶液冲洗3遍后，进行共聚焦成像；先向培养皿内加入10.0μM的CCCP，保持在37°C及5%CO₂条件下，孵育30分钟，然后用磷酸缓冲溶液冲洗3遍后，加入DEME（invitrogen）培养基，再其中分别加入2.0μM的Mito Tracker Green FM，2.0μM的Mito Tracker Red FM和0.8μM的探针化合物BFT，保持在37°C及5%CO₂条件下，孵育15分钟，然后用磷酸缓冲溶液冲洗3遍后，进行共聚焦成像。

细胞的培养密度为2×105cells/mL。成像所用仪器为Olympus FV1000-IX81倒置显微镜，100倍油镜。激发光分别为488nm、488nm和405nm激发，分别收集450-500nm、450-500nm和630-675nm波段，结果见图12。

图12a,b,c分别为未加CCCP孵育前，Mito Tracker Green FM，Mito Tracker Red FM和探针化合物BFT的荧光成像图，图12d,e,f分别为使用CCCP孵育后，MitoTracker Green FM，Mito Tracker Red FM和探针化合物BFT染色后的荧光成像图。商品化染料Mito Tracker Green FM不受线粒体膜电位干扰，因此其荧光强度没有明显的变弱；而Mito Tracker Red FM受线粒体膜电位干扰，因此其荧光强度有比较明显的变弱。从结果中可以看出，在CCCP孵育的前后，探针化合物BFT的染色强度没有明显的变弱，因此探针化合物BFT不受线粒体膜电位干扰。

实施例13.探针化合物BFT通过荧光比率方法监测线粒体黏度变化

线粒体的化学组分主要包括水、蛋白质和脂质，此外还含有少量的辅酶等小分子及核酸。而在细胞凋亡过程中，线粒体将会表现出黏度增加等现象，因此检测线粒体黏度具有重要意义。HeLa细胞在DEME（invitrogen）中用10%的FCS（invitrogen）培养。共聚焦荧光成像实验前一天，细胞种在专用的细胞共聚焦培养皿中。第二天，向其中加入0.8μM的探针化合物BFT，保持在37°C及5%CO₂条件下，孵育15分钟，然后用磷酸缓冲溶液冲洗3遍，进行共聚焦成像。为了加速细胞凋亡过程，共聚焦成像过程中加入细胞凋亡剂依托泊苷。

细胞的培养密度为2×105cells/mL。成像所用仪器为Olympus FV1000-IX81倒置显微镜，100倍油镜。BFT的激发光为405nm激发，分别收集450-500nm和630-675nm波段，所得结果如图14所示。

从图13中可以看出，当细胞处于正常状态时，在线粒体中代表低粘度的绿色区域处于主导地位，而随时细胞凋亡程度的增加，代表高黏度的紫红色区域越来越多。可以看出，随着细胞凋亡程度的增加，线粒体从一开始的10.1cP增加到最后的210cP。本发明所述的染料BFT不仅可以监测线粒体黏度的变化，还可以估算出线粒体不同阶段的黏度值。

实施例14.探针化合物BFT通过荧光寿命方法监测线粒体黏度变化

HeLa细胞在DEME（invitrogen）中用10%的FCS（invitrogen）培养。共聚焦荧光成像实验前一天，细胞种在专用的细胞共聚焦培养皿中。第二天，向其中加入0.8μM的探针化合物BFT，保持在37°C及5%CO₂条件下，孵育15分钟，然后用磷酸缓冲溶液冲洗3遍，进行共聚焦成像。为了加速细胞凋亡过程，共聚焦成像过程中加入细胞凋亡剂依托泊苷。

细胞的培养密度为2×105cells/mL。成像所用仪器为TCSPC FLIM显微镜，100倍油镜。BFT使用800nm的激发光激发，所得结果如图14所示。

从图14中可以看出，当细胞处于正常状态时，在线粒体中代表短荧光寿命的的绿色区域处于主导地位，而随时细胞凋亡程度的增加，代表长荧光寿命的桔色区域越来越多。而短荧光寿命时对应低黏度值，长荧光寿命对应高黏度值，因此可以看出，随着细胞凋亡程度的增加，线粒体黏度不断增加。本发明所述的染料BFT可以通过荧光寿命方法监测线粒体黏度的变化。

Claims

1.一类菁类化合物，具有通式Ⅰ的结构：

其中，R₁为苄基，R₂为H，n＝0，Y^-为Br^-。

2.权利要求1所述的化合物的制备方法，其合成路线如下：

其中，R₁为苄基，R₂为H，n＝0，Y^-为Br^-

(1)将Y取代的R₁化合物与R₂基团取代的2-甲基苯并噻唑在氮气保护下反应2-5h，冷却至室温，待固体完全沉降后，真空抽滤，所得固体用乙醚进行洗涤，最后将固体真空干燥，即得到中间体1a；

(2)在冰水浴条件下，将三氯氧磷滴加到N,N-二甲基甲酰胺溶液内，滴加完毕后，持续0℃继续反应3h后，撤去冰浴，分批次加入溴乙酸，加热回流24h，反应完毕后，将溶液倒入冰水中，分液，用无水硫酸镁将油层干燥后减压蒸馏；所得黄色液体用稀硫酸中和后，氯仿进行萃取，减压蒸馏掉溶剂得到的黄色固体1b；

(3)将中间体1a溶解于乙醇中，加入1b以及微量吡啶，加热回流即有染料I生成，在反应结束后，蒸去溶剂，提纯产物。

3.权利要求1所述的化合物在制备用于监测活细胞内亚细胞器内黏度值的试剂中的应用。