CN102093270A - 细胞内银离子检测用二苯代乙烯双光子荧光探针 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种细胞内银离子检测用二苯代乙烯双光子荧光分子探针，该探针通过1,4-二氰基-2-甲基-5-(二乙基磷酰基甲基)苯1,4-二氰基-2-甲基-5-(二乙基磷酰基甲基)苯与4-[N,N-二(2-乙硫基乙基)]氨基苯甲醛缩合而成。790nm的激光激发可避免细胞的光致毒。在pH6.5-12的范围内，探针对银离子有很好的选择性，而钠、钾、钙、镁、锰等金属离子对检测没有干扰，可以检测微摩尔浓度的银离子。探针分子络合银离子后荧光强度下降，可以对银离子含量进行双光子荧光检测。双光子荧光显微成像实验表明这类探针对EC等细胞或组织渗透性好，本身对细胞没有毒副作用，特别适于细胞内银离子浓度变化和银离子分布的检测。

Description

细胞内银离子检测用二苯代乙烯双光子荧光探针

技术领域

  本发明属于精细化工检测设备技术领域，涉及一种细胞内银离子检测用二苯代乙烯双光子荧光分子探针。

背景技术

银离子是对人体和环境具有威胁和毒害作用的重金属离子之一。银离子作为抗菌剂、转录引发剂、耐药性质粒靶标和Cu^2+/+的氧化还原致钝探针而被广泛地应用在生物化学上。除此之外，银离子还能钝化巯基酶，跟各种代谢产物的胺、咪唑和羰基结合，如与胞液组织的大分子蛋白和金属硫因结合。动物长期暴露于银环境中会导致贫血症、心脏扩张、生长缓慢、胚胎毒性和肝硬化。由于银广泛用于如电镀、冶金、军工等工业生产过程，所以对于银离子的检测以及生物过程研究已经成为近年来的研究热点。与其他检测方法相比，荧光检测具有灵敏度高、选择性好、响应迅速、检测快捷方便并可以进行实时区域离子检测等优点，且双光子荧光探针使用800-1100 nm的激光作为激发光源，可以避免单光子荧光探针因使用350-560 nm的激发光而导致的光致毒与光漂白。基于ICT原理的双光子荧光银离子探针络合银离子后，双光子荧光强度降低，因此可以通过监测双光子荧光强度的变化来确定银离子含量的高低，此外，可以借助双光子荧光显微镜对活细胞或生物组织进行银离子生物成像，并对银离子的生理作用与生物过程进行实时动态三维跟踪研究。

目前有效的银离子选择性荧光探针较少，并且还没有开发出适于细胞内银离子检测的双光子荧光探针。已报道的对银离子有选择性的荧光探针主要分两大类：一是单光子荧光银离子探针；二是双光子荧光银离子探针。单光子荧光银离子探针是一种喹啉类氮杂冠醚，因易质子化，不适用于生理环境中检测，激发波长在350-560 nm,不但易使生物本体产生自发荧光干扰，而且短的激发波长还会对细胞产生光致毒，因此这种探针的应用受到了一定的限制。

双光子荧光银离子探针是近年来发展的一类探针，这类探针具有近红外激发、暗场成像、避免荧光漂白和光致毒、定靶激发、高横向分辨率与纵向分辨率、降低生物组织吸光系数及降低组织自发荧光干扰等优点。代表性报道为双苯乙烯基苯类双光子荧光银离子探针，这个探针唯一的缺陷就是不能用于细胞成像。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺点，本发明提供一种适用于活细胞内银离子检测、性能优良的细胞内银离子检测用二苯代乙烯双光子荧光分子探针。

本发明解决其技术问题所采用的技术方法是：一种细胞内银离子检测用二苯代乙烯双光子荧光分子探针，细胞内银离子检测用的二苯代乙烯双光子荧光探针具有下列结构通式I： 

通式I中：R为相同或不相同的R₁₁；R₁₁为H、C_1－12烷基、C_1－12环烷基、C_1－12烷基取代的苯基、C_1－12烷基取代的萘基、F、Cl、Br、I、OR₁₂、N(R₁₂)₂、CN、(CH₂CH₂O)_nH、(CH₂)_mCOOM或(CH₂)_mSO₃M；R₁₂ 为H、C_1-12烷基、C_1－12环烷基、C_1－12烷基取代的苯基、C_1－12烷基取代的萘基、(CH₂CH₂O)_nH、(CH₂)_mCOOM或(CH₂)_mSO₃M；

使用二苯代乙烯双光子荧光染料，用叔氮原子连接染料母体和识别受体，使整个分子的吸收和发射红移，染料波长增长。

所述细胞内银离子检测用二苯代乙烯双光子荧光分子探针的特性是：探针分子单光子与双光子激发分别在390～420nm与780～810nm范围内，本身发射在600～640nm范围内，并且化学-光稳定性好；探针分子络合银离子前荧光量子产率较高，络合银离子后荧光量子产率降低，对银离子进行单、双光子荧光检测。

所述细胞内银离子检测用的二苯代乙烯双光子荧光探针的合成方法是采用1，4-二氰基-2-甲基-5- (二乙基磷酰基甲基)苯 （Ⅱ），与4-[N，N-二 (2-乙硫基乙基)]氨基苯甲醛（Ⅲ）反应，经过柱分离得到探针纯品，其反应式是：

所述细胞内银离子检测用的二苯代乙烯双光子荧光探针的使用方法是：将探针分子溶解在生理盐水、缓冲液或是乙腈、丙酮、二甲基亚砜的水溶性有机溶剂中，然后加入含有细胞组织的适当缓冲液中进行测试。

本发明的有益效果是：探针分子单光子与双光子激发分别在390～420nm与780～810nm范围内，本身发射在600～640nm范围内，并且化学-光稳定性好；探针分子络合银离子前荧光量子产率较高，络合银离子后荧光量子产率降低，对银离子进行单、双光子荧光检测；探针分子对银离子有很好的选择性，钠、钾、钙、镁、锰等金属离子对检测没有干扰；探针分子对pH变化不敏感，pK _a值4-5；在pH 6.2-12的范围内，pH变化对荧光发射没有影响；探针分子与银离子之间的解离常数在微摩尔级范围内，可以检测微摩尔浓度的细胞银离子；探针分子细胞渗透性好，对细胞本身没有毒副作用，适于细胞内银离子浓度变化的检测。可共聚焦激光显微镜得到各类活细胞或组织内银离子的分布荧光图像或假彩比例荧光图像。

附图说明

图1是本发明的荧光探针分子I-1对银离子的紫外-可见光滴定及单光子荧光滴定。紫外-可见光滴定及单光子荧光滴定中的荧光探针分子I-1的浓度分别为10 mM和1 mM，箭头表示吸收强度与单光子发射强度随银离子浓度的增加而变化的趋势。横坐标为波长（nm），纵坐标为荧光强度。

图2是本发明的荧光探针分子I-1对银离子的双光子荧光滴定。双光子荧光滴定中的荧光探针分子I-1的浓度为1 mM，箭头表示双光子发射强度随银离子浓度的增加而变化的趋势。横坐标为波长（nm），纵坐标为双光子荧光强度。

图3是本发明的荧光探针分子I-1在不同介质中的双光子激发谱。从上至下三条曲线分别表示荧光探针分子I-1在toluene、MeCN和Ag⁺ + MeCN中的双光子吸收截面随双光子激发波长的变化关系。横坐标为波长（nm），纵坐标为吸收截面（GM, 1 GM ≡ 1 × 10^-50 cm⁴ s photon^-1 molecule^-1）。

图4是本发明的荧光探针分子I-1的双光子荧光滴定中的络合常数拟合曲线图。数据点表示对应于不同银离子浓度的相对双光子荧光强度，对这些数据点进行Sigmoidal拟合得到一条曲线，所得拟合参数即为荧光探针分子I-1的络合常数，以pk表示。横坐标为银离子浓度（mol L^-1），纵坐标为相对双光子荧光强度。

图5是本发明的荧光探针分子I-1对金属离子的单-双光子选择性示意图。横坐标表示荧光强度百分淬灭率，纵坐标为不同的离子。

图6是本发明的荧光探针分子I-1的荧光强度与pH的变化关系。横坐标为pH，纵坐标为相对单光子荧光强度。在pH 2 ~ 6.5对这些数据点进行Sigmoidal拟合，所得拟合参数即为荧光探针分子I-1的酸离解常数，以pk _a表示。荧光探针分子I-1的浓度为1 mM。

图7是用本发明的荧光探针分子I-1研究DC细胞内银离子的共聚焦双光子荧光显微照片，激发波长为790 nm，收集600 ~ 650 nm通道的荧光。图7a 是白光下的DC细胞；图7b 是在 DC细胞培养基中加入1 mM的荧光探针分子I-1，在37 ℃、含5 % CO₂的细胞培养箱中孵育0.5小时后，继续加入1 mM Ag⁺，在37 ℃、含5 % CO₂的细胞培养箱中孵育0.5小时。所用仪器是共聚焦激光扫描显微镜，10倍目镜。型号： Zeiss 510 LSM。

研究探针对银离子选择性的方法是将探针分子I-1分别加到20倍过量的不同金属离子的缓冲液中，未加金属离子的探针分子溶液的单/双光子荧光强度与不同离子溶液的单/双光子荧光强度的差值对前者的比值即为离子对探针分子荧光强度的百分淬灭率，作为判断探针分子对该离子的选择性。

研究探针对pH响应的方法是将探针分子加入离子强度为0.1的水-乙腈混合溶液中，调节pH 1.0左右，测定荧光强度后，加入碱液，缓慢增大pH，记录相应的荧光强度变化，以荧光强度变化对pH作图。

探针在细胞内探测银离子性能的实验方法是将含有探针分子的中性缓冲液加入到培养好的细胞中，在37 ℃、含5 % CO₂的细胞培养箱中孵育0.5小时，用上述缓冲溶液或培养液充分洗涤后，用双光子荧光显微镜成像得到空白图像。向上述含探针的细胞培养液中加入AgNO₃溶液（最终浓度为1 mM）于37 ℃、含5 % CO₂的细胞培养箱中孵育0.5小时，用培养液冲洗后，再进行双光子荧光显微成像得到细胞内银离子的分布图像，由此得到银离子的存在、细胞内的区域分布和浓度信息。

探针的应用方法是将溶解于有机溶剂或有机/水混合溶剂中的这类探针加入到被测的含银离子的细胞的培养液中，使探针浓度在1-10 mM，被测细胞与探针在10-40 ℃和含1-10 % CO₂气氛的细胞培养箱中孵育0.1-10.0小时后，探针透过细胞膜，与细胞内银离子络合发生荧光变化，用不含探针和银离子的水溶液或培养液充分洗涤后，细胞在双光子荧光显微镜下得到银离子分布的荧光图像。由此得到银离子的存在、细胞内的区域分布和浓度信息。最佳孵育条件为：温度为37 ℃，含 5 % CO₂的细胞培养箱中孵育0.5-1.0小时。

本发明涉及的探针分子具有极其重要的应用价值。特别是该系列探针分子对pH变化不敏感，响应时间极短，检测灵敏度较高，细胞渗透性良好，对细胞的毒副作用小，使得这类探针作为测定生物体内的银离子浓度快速变化的试剂是极其有用的。

这类探针具有如下特点：

第一，本发明双光子荧光探针分子激发和发射光谱在可见光区，荧光量子产率高，双光子吸收截面大，分子体积小，并且化学/光稳定性好。

第二，本发明荧光探针分子的设计基于分子内光诱导电荷转移（ICT）原理，探针分子络合银离子前后荧光强度发生显著的变化，可以检测银离子含量。双光子荧光探针分子对银离子有很好的选择性，钠、钾、钙、镁、锰等金属离子对检测没有干扰。另外双光子荧光探针分子对pH变化不敏感，pK _a 5.2，在pH 6.5-12的范围内，pH变化对荧光发射没有影响。

第三，本发明双光子荧光探针分子与银离子之间的络合常数在微摩尔级范围内，可以检测微摩尔浓度的细胞内银离子。

第四，探针分子细胞渗透性好，对细胞本身毒副作用小，适于细胞内银离子浓度变化的检测。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

参见图1至图7，一种细胞内银离子检测用二苯代乙烯双光子荧光分子探针，细胞内银离子检测用的二苯代乙烯双光子荧光探针具有下列结构通式I： 

通式I中：R为相同或不相同的R₁₁；R₁₁为H、C_1－12烷基、C_1－12环烷基、C_1－12烷基取代的苯基、C_1－12烷基取代的萘基、F、Cl、Br、I、OR₁₂、N(R₁₂)₂、CN、(CH₂CH₂O)_nH、(CH₂)_mCOOM或(CH₂)_mSO₃M；R₁₂ 为H、C_1-12烷基、C_1－12环烷基、C_1－12烷基取代的苯基、C_1－12烷基取代的萘基、(CH₂CH₂O)_nH、(CH₂)_mCOOM或(CH₂)_mSO₃M；

使用二苯代乙烯双光子荧光染料，用叔氮原子连接染料母体和识别受体，使整个分子的吸收和发射红移，染料波长增长。

实施例1，探针I-1的合成：

（1） 中间体2的合成

用分析天平准确称取2，5－二甲基对苯二甲腈(1.560 g，10.00 mmol)、偶氮二异丁腈(0.041 g，0.25 mmol)与NBS (1.958 g，11.00 mmol) 置于干燥的100 mL单口圆底烧瓶中，再用量筒量取50 mL 四氯化碳倒入烧瓶中，装上回流冷凝管，抽真空并用氩气保护，将烧瓶置于事先加热到80 ℃以上的油浴中，强力搅拌，并用火焰枪辅助加热使之快速回流，至快速回流后再将反应体系温度调至80 ℃反应2 h。反应完毕后，将反应混合物冷却到室温再过滤，并用CCl₄ (3 × 20 mL)洗涤，减压浓缩滤液成棕红色黏滞油状物，加入乙醇(20 mL)稍加热使之溶解，转入到烧杯(100 mL)中,并用乙醇(3 × 10 mL)洗涤烧瓶，将洗液一并倒入到烧杯中，室温搁置至总体积达10 mL或更少时，再抽滤得白色粉末状产品。粗品经硅胶柱色谱分离〔洗脱液：V (正己烷):V (乙酸乙酯) = 12∶1〕，得白色粉末，产率52.0% (1.22 g)，熔点126 - 127 ℃。¹H NMR (400 MHz， CDCl₃)，δ: 7.788 (s, 1H), 7.637 (s, 1H), 4.594 (s, 2H), 2.604 (s, 3H). MS, m/z: C₁₀H₇BrN₂ (M⁺ )的计算值 (实测值)：233.9793 (233.9747)。

（2）中间体3的合成

2-甲基-5-溴甲基对苯二甲腈 (2) (234 mg, 1.0 mmol)和亚磷酸三乙酯 (250 mg, 1.5 mmol)加热到165 ℃反应18 h，减压除去过量的亚磷酸三乙酯，残余物用V (正己烷):V(乙酸乙酯) = 1:1重结晶，得白色晶体，产率72 % (210 mg)。¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) d: 7.758 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 7.619 (s, 1H), 4.133 (m, 4H), 3.377 (d, J = 22 Hz, 2H), 2.580 (s, 3H), 1.312 (t, J = 7.2 Hz, 6H). ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) d: 141.267, 134.723, 134.662, 134.283, 117.416, 116.391, 62.929, 62.861, 32.672, 31.298, 20.102, 16.527, 16.466. MS, m/z: C₁₄H₁₇N₂ O₃P (M⁺ )的计算值 (实测值)：292.0977 (292.0977)。

（3）中间体5的合成

除水DMF (30.0 g ，411 mmol)加到带干燥管的100mL单口圆底烧瓶中，搅拌冰水浴冷却到0 ℃，撤掉干燥管，插上装有POCl₃ (27.6 g ，181.5 mmol)的恒压加料器，于0℃下搅拌逐滴滴加POCl₃，滴加完后于0℃继续反应45 min，再于0℃下一次性加入N,N-二羟乙基苯胺 (10.0 g ，55mmol)的DMF (10.0 g ，137 mmol)溶液，然后慢慢升至110 ℃再继续反应2 h，冷却后倒入0.5 L冰水中，搅拌滴加1M NaOH溶液调pH至7附近，过滤水洗 (3 × 100 mL)，将固体粗品用乙醇 (2 × 300 mL)重结晶，得白色针状晶体。产率96 % (12.9 g)。¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 9.774 (s, CHO, 1H)，7.767 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 6.745 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 3.843 (t, J ₁ = J ₂ = 6.8 Hz, 2CH ₂ Cl, 4H), 3.684 (t, J ₁ = J ₂ = 6.8 Hz, N(CH ₂ ) ₂ , 4H)。¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ: 190.296，151.089, 132.385, 126.760, 111.389, 53.319, 40.157。MS, m/z: C₁₁H₁₃Cl₂NO (M⁺)的计算值(实测值)：245.0374 (245.0371)。

（4）中间体6的合成

Na (184 mg, 8 mmol) 在氮气保护下溶于EtOH (50 mL) ，在室温和搅拌下，于1 h内将乙硫醇 (443 mg, 7 mmol) 逐滴滴加到乙醇混合液中， 滴加完后于此温度下继续反应1 h，加热至回流温度，将N，N-二 (2-氯乙基)苯甲醛 (5) (735 mg, 3 mmol)的 EtOH (10 mL)溶液在2 h内逐滴加到反应液中，滴加完后回流反应24 h。反应完后，真空脱除溶剂，于残留物中加入100 mL 水，水溶液用100 mL CHCl₃萃取，用无水硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩，粗品用硅胶柱色谱分离〔洗脱液: V (二氯甲烷)∶V (丙酮) = 5∶1〕，得红棕色油状液体，产率58.5 % (521 mg)。¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) d: 9.728 (s, 1H), 7.731 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.695 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 3.634 (t, J ₁ = J ₂ = 7.6 Hz, 4H), 2.757 (t, J ₁ = J ₂ = 7.6 Hz, 4H), 2.612 (m, 4H), 1.286 (t, J ₁ = J ₂ = 7.2 Hz, 6H). ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) d: 189.825, 151.377, 132.135, 125.538, 110.774, 51.262, 28.528, 26.190, 14.834. MS, m/z: C₁₅H₂₃NOS₂ (M⁺)的计算值(实测值)：297.1221 (297.4808)。

（5）探针I-1的合成

4-[N，N-二 (2-乙硫基乙基)]氨基苯甲醛 (6)(339 mg, 1.14 mmol)， NaH (55 mg 2.28 mmol) 置于装有THF (3 mL)的25 mL圆底烧瓶中，将烧瓶置于冰水浴中冷却到 0 °C，在氮气保护和搅拌下，将溶于THF (10 mL)的1，4-二氰基-2-甲基-5- (二乙基磷酰基甲基)苯 (3)(333 mg, 1.14 mmol) 的溶液逐滴滴加到反应液中，滴加结束后，再于此温度下继续搅拌反应 12 h. 反应终了后，加入5 mL 水，产品用乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，过滤真空脱除溶剂， 粗品用柱色谱分离，先用V (正己烷):V (CH₂Cl₂) = 20-0 % 、后用V (乙酸乙酯):V (CH₂Cl₂) = 0-20%  进行洗脱，丙酮重结晶，得黄色粉末，产率58% (288 mg)，熔点225-228 ℃。IR (KBr，cm^-1)：2236 (C≡N)，1654 (C=C)。¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) d: 7.964 (s, 1H), 7.536 (s, 1H), 7.466(d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.191 (d, J = 16.4 Hz, 1H), 7.119 (d, J = 16 Hz, 1H), 6.675 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 3.594 (t, J ₁ = J ₂ = 7.6 Hz, 4H), 2.752 (t, J ₁ = J ₂ = 7.6 Hz, 4H), 2.629 (m, 4H), 2.545 (s, 3H), 1.290 (t, J ₁ = J ₂ = 7.6 Hz, 6H). ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) d: 147.754, 139.851, 139.129, 134.745, 134.352, 129.258, 128.740, 124.066, 117.419, 117.351, 117.021, 116.930, 113.883, 111.847, 51.592, 28.956, 26.477, 20.041, 15.122. MS, m/z: C₂₅H₂₉N₃S₂ (M⁺)的计算值 (实测值)：435.1803 (435.1808)。 

实施例2，探针I-1对银离子选择性：

    使用上述合成的化合物I-1评价对银离子的选择性。将1 mM的化合物I-1加到20倍过量的各种金属离子的pH 7.4的Tris-盐酸缓冲液中(乙腈/水 =  9/1, V/V)，探针单、双光子激发波长分别为400 nm与790 nm，发射波长为620 nm，测试结果显示于图5中。从图中可以看到，探针I-1对银离子具有很高的选择性，银离子的加入产生很大的荧光淬灭，另外钠、钾、钙、镁、锰等金属离子对检测没有干扰。

实施例3，探针I-1对pH的不敏感性：

使用上述合成的化合物I-1评价对pH的响应，对于化合物I-1在离子强度为0.1的水溶液中调节pH值为1.0左右，测定荧光强度后，加入碱液，使pH值缓慢增大，记录相应的荧光强度变化，测试结果显示于图3中。从图中可以看出探针I-1有较低的pK _a 值，在pH好6.5-12的范围内，pH变化对荧光发射基本没有影响。因此探针I-1可用于大pH范围内的细胞内银离子的检测。

实施例4，细胞培养：

DC细胞由DEME (Invitrogen)培养液培养，成像的前一天，细胞放于平底表面皿中，成像时细胞放于含有5 ％ CO₂和1 mM的探针I-1缓冲液于37 ℃、含5 % CO₂的细胞培养箱中孵育0.5-1.0小时，用中性缓冲溶液或培养液充分洗涤后（洗涤三遍以上），用双光子荧光显微镜成像得到空白图像（图7a）。向上述含探针的细胞培养液中加入AgNO₃溶液（最终浓度为1 mM）在37 ℃、含5 % CO₂的细胞培养箱中孵化0.5小时，用培养液冲洗三遍后，再进行双光子荧光显微成像得到细胞内银离子的分布图像（图7b）。其中图7a 是在DC细胞培养基中加入1 mM的荧光探针分子I-1孵育1小时后（未加入银离子）；图7b是在 DC细胞培养基中加入荧光探针分子I-1孵育0.5小时后，继续加入1 mM AgNO₃孵育0.5小时。所用仪器是共聚焦双光子激光扫描显微镜，10倍目镜，型号：Zeiss 510 LSM。

Claims (4)

1.一种细胞内银离子检测用二苯代乙烯双光子荧光分子探针，其特征是：细胞内银离子检测用的二苯代乙烯双光子荧光探针具有下列结构通式I： 

通式I中：R为相同或不相同的R₁₁；R₁₁为H、C_1－12烷基、C_1－12环烷基、C_1－12烷基取代的苯基、C_1－12烷基取代的萘基、F、Cl、Br、I、OR₁₂、N(R₁₂)₂、CN、(CH₂CH₂O)_nH、(CH₂)_mCOOM或(CH₂)_mSO₃M；R₁₂ 为H、C_1-12烷基、C_1－12环烷基、C_1－12烷基取代的苯基、C_1－12烷基取代的萘基、(CH₂CH₂O)_nH、(CH₂)_mCOOM或(CH₂)_mSO₃M；

使用二苯代乙烯双光子荧光染料，用叔氮原子连接染料母体和识别受体，使整个分子的吸收和发射红移，染料波长增长。

2.如权利要求1所述的细胞内银离子检测用二苯代乙烯双光子荧光分子探针，其特征是：探针分子单光子与双光子激发分别在390～420nm与780～810nm范围内，本身发射在600～640nm范围内，并且化学-光稳定性好；探针分子络合银离子前荧光量子产率较高，络合银离子后荧光量子产率降低，对银离子进行单、双光子荧光检测。

3.如权利要求1或2所述的细胞内银离子检测用二苯代乙烯双光子荧光分子探针的合成方法，其特征是：采用1，4-二氰基-2-甲基-5- (二乙基磷酰基甲基)苯 （Ⅱ），与4-[N，N-二 (2-乙硫基乙基)]氨基苯甲醛（Ⅲ）反应，经过柱分离得到探针纯品，其反应式是：

。

4.如权利要求1或2所述的细胞内银离子检测用二苯代乙烯双光子荧光分子探针的使用方法，其特征是：将探针分子溶解在生理盐水、缓冲液或是乙腈、丙酮、二甲基亚砜的水溶性有机溶剂中，然后加入含有细胞组织的适当缓冲液中进行测试。

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