CN102154005A - 细胞内锌离子检测用二苯代乙烯双光子荧光探针 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种细胞内锌离子检测用二苯代乙烯双光子荧光探针,采用二苯代乙烯双光子荧光分子探针。探针分子单光子与双光子激发分别在390~420nm与790~820nm范围内,并且化学-光稳定性好;探针分子络合锌离子前荧光量子产率较高,可以对锌离子进行单、双光子荧光检测;探针分子对锌离子有很好的选择性;在生理pH范围内,探针分子对pH变化不敏感;在pH5~8的范围内,pH变化对络合物的荧光发射基本上没有影响;探针分子与锌离子之间的解离常数在亚微摩尔级范围内,可以检测亚微摩尔浓度的细胞锌离子;探针分子细胞渗透性好,适于细胞内锌离子浓度变化的检测;可共聚焦激光显微镜得到各类活细胞或组织内锌离子的分布荧光图像或假彩比例荧光图像。
Description
技术领域
本发明属于精细化工领域中的一种细胞内锌离子检测用二苯代乙烯双光子荧光探针。
背景技术
锌是参与细胞生理活动的重要成分。尽管传统的锌离子生物无机化学的研究集中于蛋白质中锌的结构功能与催化功能上,但锌离子的神经生物学研究越来越受到关注。通过对哺乳动物组织,包括前列腺、分泌胰岛的胰腺和海马体微神经元等的化学研究,人们发现前列腺癌、糖尿病和神经组织老化等疾病会导致锌的分布混乱。生物体中锌离子大部分与蛋白质结合在一起,细胞中锌离子含量从亚纳摩尔到300 µM不等。锌离子能调节离子通道的功能,锌离子不但在乙溴醋胺的衰亡中起着至关重要的作用,而乙溴醋胺与神经组织老化疾病有直接关系,而且对神经传导也是极其重要的。由于锌离子有着众多的生理作用,因此锌离子的神经生物学研究仍然是一个感兴趣的课题。与其他检测方法相比,荧光检测具有灵敏度高、选择性好、响应迅速、检测快捷方便并可以进行实时区域离子检测等优点,且双光子荧光探针使用800-1100 nm的激光作为激发光源,双光子激发荧光显微镜远远优于传统的单光子荧光显微镜,它不但能克服单光子荧光显微镜产生的光致毒、光漂白、组织自发荧光干扰,而且能进行单光子荧光显微镜所无法实现的定点激发与深度成像,从而显著提高检测的灵敏度与成像的清晰度。这些优点运用到锌的生理功能的探索方面必将为我们揭示锌的生理作用机制,但这必须配套开发用于生物中锌离子成像的双光子荧光探针。基于PET原理的双光子荧光锌离子探针络合锌离子后,双光子荧光强度升高,因此可以通过监测双光子荧光强度的变化来确定锌离子含量的高低,此外,可以借助双光子荧光显微镜对活细胞或生物组织进行锌离子生物成像,并对锌离子的生理作用与生物过程进行实时动态三维跟踪研究。
已报道的对锌离子有选择性的荧光探针主要分两大类:一是单光子荧光锌离子探针;二是双光子荧光锌离子探针。单光子荧光锌离子探针是如喹啉与荧光素衍生物[(1) Hendrickson, K. M.; Geue,
J. P.; Wyness, O.; Lincoln, S. F.; Ward, A. D. J. Am. Chem. Soc. 2003,
125 (13), 3889–3895; (2) omatsu, K.; Kikuchi, K.; Kojima, H.; Urano Y.; Nagano,
T. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127: 10197-10204],因激发波长在350-560 nm,易产生光致毒与荧光漂白等不利影响,给细胞检测造成干扰较大。双光子荧光锌离子探针是近年来发展的一类探针,这类探针具有近红外激发、暗场成像、避免荧光漂白和光致毒、定靶激发、高横向分辨率与纵向分辨率、降低生物组织吸光系数及降低组织自发荧光干扰等优点。已报道了四个双光子锌离子探针 [(3) Belfield, K.
D.; Bondar, M. V.; Frazer, A.; Morales, A. R.; Kachkovsky, O. D.; Mikhailov, I.
A.; Masunov, A. E.; Przhonska, O. V. J. Phys. Chem. B 2010, 114, 9313–9321.(4) Kim, H.
M.; Seo, M. S.; An, M. J.; Hong, J. H.; Tian, Y. S.; Choi, J. H.; Kwon, O.;
Lee, K. J.; Cho, B. R. Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47: 5167–5170. (5) Sumalekshmy,
S.; Henary, M. M.; Siegel, N.; Lawson, P. V.; Wu, Y.; Schmidt, K.; Brédas, J.-L.; Perry, J. W.;
Fahrni, C. J. J. Am. Chem. Soc. 2007, 129: 11888–11889. (6) Bhaskar,
A.; Ramakrishna, G.; Twieg, R. J.; Goodson, T. J. Phys. Chem. C 2007, 111:
14607–14611],但这些探针的双光子吸收截面(δ)均较小,最大的才193 GM。为了提高检测的灵敏度与成像的清晰度,有必要开发更大双光子吸收截面的双光子锌离子探针。
发明内容
为了克服现有的锌离子单、双光子荧光探针结构和性能上的不足,本发明提供一种适用于活细胞内锌离子检测、性能优良的基于二苯代乙烯双光子荧光染料的细胞内锌离子检测用二苯代乙烯双光子荧光探针。
本发明解决其技术问题所采用的技术方法是:一种细胞内锌离子检测用二苯代乙烯双光子荧光探针,采用二苯代乙烯双光子荧光分子探针,该二苯代乙烯荧光探针具有下列结构通式I:
通式I中:R为相同或不相同的R11;R11为H、C1 - 12烷基、C1 - 12环烷基、C1 - 12烷基取代的苯基、C1 - 12烷基取代的萘基、F、Cl、Br、I、OR12、N(R12)2、CN、(CH2CH2O)nH、(CH2)mCOOM或(CH2)mSO3M;R12 为H、C1-12烷基、C1 - 12环烷基、C1 - 12烷基取代的苯基、C1 - 12烷基取代的萘基、(CH2CH2O)nH、(CH2)mCOOM或(CH2)mSO3M。
所述细胞内锌离子检测用二苯代乙烯双光子荧光探针的合成方法是:是将2,5-二氰基-4-甲基-4’-[N,N-二 (2-氯乙基)]氨基二苯乙烯(Ⅱ),与氨甲基吡啶(Ⅲ)反应,经过柱分离得到探针纯品,
所述细胞内锌离子检测用二苯代乙烯双光子荧光探针的用途是:将溶解于水中的细胞内锌离子检测用二苯代乙烯双光子荧光探针加入到被测的含锌离子的细胞的培养液中,使探针浓度在1~10 mM,被测细胞与探针在10 ~ 40 ℃,和含1 ~ 10 % CO2的细胞培养箱中孵育0.1-10.0小时,探针透过细胞膜,与细胞内锌离子络合发生荧光变化,用不含探针和银离子的水溶液或培养液充分洗涤后; 细胞在双光子荧光显微镜下得到锌离子分布的荧光图像,由此得到锌离子的存在、细胞内的区域分布和浓度信息。
本发明的有益效果是:探针分子单光子与双光子激发分别在390~420nm与790~820nm范围内,本身发射在600~640nm范围内,并且化学-光稳定性好;探针分子络合锌离子前荧光量子产率较高,络合锌离子后荧光量子产率降低,可以对锌离子进行单、双光子荧光检测。探针分子对锌离子有很好的选择性,钠、钾、钙、镁、锰等金属离子对检测没有干扰;在生理pH范围内,探针分子对pH变化不敏感;在pH 5-8的范围内,pH变化对络合物的荧光发射基本上没有影响;探针分子与锌离子之间的解离常数在亚微摩尔级范围内,可以检测亚微摩尔浓度的细胞锌离子;探针分子细胞渗透性好,对细胞本身没有毒副作用,适于细胞内锌离子浓度变化的检测;可共聚焦激光显微镜得到各类活细胞或组织内锌离子的分布荧光图像或假彩比例荧光图像。
附图说明
图1是本发明的荧光探针分子I-1对锌离子的单光子荧光滴定;单光子荧光滴定中的荧光探针分子I-1的浓度为1 mM,箭头表示单光子发射强度随锌离子浓度的增加而变化的趋势;横坐标为波长(nm),纵坐标为荧光强度。
图2是本发明的荧光探针分子I-1对锌离子的双光子荧光滴定;双光子荧光滴定中的荧光探针分子I-1的浓度为1 mM,箭头表示双光子发射强度随锌离子浓度的增加而变化的趋势;横坐标为波长(nm),纵坐标为双光子荧光强度。
图3是本发明的荧光探针分子I-1与锌离子络合物(Zn2++I-1)在水中的双光子激发谱;曲线表示络合物在水中的双光子发射截面随双光子激发波长的变化关系;横坐标为波长(nm),纵坐标为发射截面(100 GM, 1 GM ≡ 1 × 10-50 cm4
s photon-1 molecule-1)。
图4是本发明的荧光探针分子I-1的双光子荧光滴定中的络合常数拟合曲线图;数据点表示对应于不同锌离子浓度的相对双光子荧光强度,对这些数据点进行Sigmoidal拟合得到一条曲线,所得拟合参数即为荧光探针分子I-1的络合常数,其倒数便是解离常数,以K d表示;横坐标为锌离子浓度(mol L-1),纵坐标为相对双光子荧光强度。
图5是本发明的荧光探针分子I-1对金属离子的单光子选择性示意图;纵坐标表示荧光强度百分增强率,横坐标为不同的离子。
图6是本发明的荧光探针分子I-1的荧光强度与pH的变化关系;横坐标为pH,纵坐标为相对单光子荧光强度;荧光探针分子I-1的浓度为1 mM。
图7是用本发明的荧光探针分子I-1研究小鼠层细胞(Fibroblast)内锌离子的共聚焦双光子荧光显微照片,激发波长为810 nm,收集550 - 650 nm通道的荧光。图7a 是白光下的Fibroblast细胞;图7b 是在Fibroblast细胞培养基中加入1 mM的荧光探针分子I-1,在37 ℃、含5 % CO2的细胞培养箱中孵育0.5小时后的图象;图7c 是在b中加入10 mM SNOC
(S-nitrosocysteine)后的图像;图7d 是在c中加入0.1 mM TPEN (N,N,N',N'-tetrakis(2-pyridyl) ethylenediamine)后的图像;所用仪器是共聚焦激光扫描显微镜,10倍目镜。型号: Zeiss 510 LSM。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
参见图1至图7,一种细胞内锌离子检测用二苯代乙烯双光子荧光探针,采用二苯代乙烯双光子荧光分子探针,该二苯代乙烯荧光探针具有下列结构通式I:
通式I中:R为相同或不相同的R11;R11为H、C1 - 12烷基、C1 - 12环烷基、C1 - 12烷基取代的苯基、C1 - 12烷基取代的萘基、F、Cl、Br、I、OR12、N(R12)2、CN、(CH2CH2O)nH、(CH2)mCOOM或(CH2)mSO3M;R12 为H、C1-12烷基、C1 - 12环烷基、C1 - 12烷基取代的苯基、C1 - 12烷基取代的萘基、(CH2CH2O)nH、(CH2)mCOOM或(CH2)mSO3M。
所述细胞内锌离子检测用二苯代乙烯双光子荧光探针的合成方法是:是将2,5-二氰基-4-甲基-4’-[N,N-二 (2-氯乙基)]氨基二苯乙烯(Ⅱ),与氨甲基吡啶(Ⅲ)反应,经过柱分离得到探针纯品,
所述细胞内锌离子检测用二苯代乙烯双光子荧光探针的用途是:将溶解于水中的细胞内锌离子检测用二苯代乙烯双光子荧光探针加入到被测的含锌离子的细胞的培养液中,使探针浓度在1~10 mM,被测细胞与探针在10 ~ 40 ℃,和含1 ~ 10 % CO2的细胞培养箱中孵育0.1-10.0小时,探针透过细胞膜,与细胞内锌离子络合发生荧光变化,用不含探针和银离子的水溶液或培养液充分洗涤后; 细胞在双光子荧光显微镜下得到锌离子分布的荧光图像,由此得到锌离子的存在、细胞内的区域分布和浓度信息。
研究探针对锌离子选择性的方法是将探针分子I-1分别加到20倍过量的不同金属离子的缓冲液中,在加锌离子与不加锌离子的情况下,分别考察未加离子的探针分子溶液的单光子荧光强度与不同离子溶液的单光子荧光强度的差值对前者的比值即为离子对探针分子荧光强度的百分增强率,作为判断探针分子对该离子的选择性。
研究探针对pH响应的方法是将探针分子(分为加锌离子与不加锌离子两种情况)加入离子强度为0.1的水溶液中,调节pH 1.0左右,测定荧光强度后,加入碱液,缓慢增大pH,记录相应的荧光强度变化,以荧光强度变化对pH作图。
探针在细胞内探测锌离子性能的实验方法是将含有探针分子的中性缓冲液加入到培养好的细胞中,在37 ℃、含5 % CO2的细胞培养箱中孵育0.5小时,用上述缓冲溶液或培养液充分洗涤后,用双光子荧光显微镜成像得到空白图像。向上述含探针的细胞培养液中加入AgNO3溶液(最终浓度为1 mM)于37 ℃、含5 % CO2的细胞培养箱中孵育0.5小时,用培养液冲洗后,再进行双光子荧光显微成像得到细胞内锌离子的分布图像,由此得到锌离子的存在、细胞内的区域分布和浓度信息。
探针的应用方法是将溶解于水中的这类探针加入到被测的含锌离子的细胞的培养液中,使探针浓度在1-10 mM,被测细胞与探针在10-40 ℃和含1-10 % CO2气的细胞培养箱中孵育0.1-10.0小时后,探针透过细胞膜,与细胞内锌离子络合发生荧光变化,用不含探针和锌离子的水溶液或培养液充分洗涤后,细胞在双光子荧光显微镜下得到锌离子分布的荧光图像。由此得到锌离子的存在、细胞内的区域分布和浓度信息。最佳孵育条件为:温度为37 ℃,含 5 % CO2的细胞培养箱中孵育0.5-1.0小时。
本发明涉及的探针分子具有极其重要的应用价值。特别是该系列探针分子对生理pH变化不敏感,响应时间极短,检测灵敏度较高,细胞渗透性良好,双光子吸收截面大,对细胞的毒副作用小,使得这类探针作为测定生物体内的锌离子浓度快速变化的试剂是极其有用的。这类探针具有如下特点:
第一,本发明双光子荧光探针分子激发和发射光谱在可见光区,荧光量子产率高,双光子吸收截面大,分子体积小,并且化学/光稳定性好。
第二,本发明荧光探针分子的设计基于分子内光诱导电子转移(PET)原理,探针分子络合锌离子前后荧光强度发生显著的变化,可以检测锌离子含量。双光子荧光探针分子对锌离子有很好的选择性,钠、钾、钙、镁、锰等金属离子对检测没有干扰。另外双光子荧光探针分子对生理pH变化不敏感,在pH 5-8的范围内,pH变化对络合物的荧光发射没有影响。
第三,本发明双光子荧光探针分子与锌离子之间的解离常数在亚微摩尔级范围内,可以检测亚微摩尔浓度的细胞内锌离子。
第四,探针分子细胞渗透性好,对细胞本身毒副作用小,适于细胞内锌离子浓度变化的检测。
实施例1
探针I-1的合成:
(1) 中间体2的合成
用量筒量取二氯甲烷(50 mL),置于150 mL双口圆底烧瓶中,用移液管准确量取对二甲苯(16.96 g,0.16 mol,19.8 mL)滴入到二氯甲烷中,称取单质碘(0.1 g,0.8 mmol)加到混合液中,在烧瓶的其中一个开口装上空气冷凝管并接上尾气回收装置,烧瓶的另一个开口装上恒压加料器,并用移液管准确量取液溴(18 mL)转移到恒压加料器中,并于液溴顶面加一层水(约0.3 ~0.5 cm)以防液溴挥发,再于恒压加料器的顶口加盖塞子。将反应体系的温度控制在12 ℃,在强烈搅拌和避光的条件下,将液溴逐滴滴加到混合液中(滴加时间40~50 min),注意不要把上部的水层滴入反应液中。反应18 h。待反应完毕后,加入40mL w (KOH) =25%的水溶液,再强烈搅拌30 min。将反应混合液转入到分液漏斗中,分出下层有机相,并用水洗涤(2×50 mL) ,加入无水CaCl2 干燥,过滤,减压脱除溶剂,残余物用乙醇(2×300 mL)重结晶,得白色针状晶体,产率96.5% (40.44 g),熔点73.5~75 ℃,与文献值近似。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6
),δ: 7.581 (s, 2H), 2.293 (s,
6H)。MS, m / z: C8H8Br2
(M+)的计算值 (实测值):261.8993 (261.9214)。
(2)中间体3的合成
2,5-二溴对二甲苯(30 mmol)与CuCN (8.1 g,90 mmol)于100 mL DMF中在155 ℃下回流反应48 h,冷却后将混合物倒入500 mL w (NH3·H2O) = 15%的氨水中,过滤收集沉淀并分别用500 mL w (NH3·H2O) = 15%的氨水、500 mL水洗涤,固体于真空烘箱中干燥后溶于100 mL 氯仿中,再通过一根短的硅胶柱用氯仿洗脱,脱除溶剂得固体粗品,再用300 mL乙醇重结晶,得白色针状晶体,产率87.4% (4.09 g),熔点210~212 ℃。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6 ),δ: 7.900 (s,2H), 2.474 (s, 6H)。MS, m/z: C10H8N2
(M+)的计算值(实测值):156.0687 (156.0723)。
(3)中间体4的合成
用分析天平准确称取2,5-二甲基对苯二甲腈(1.560 g,10.00 mmol)、偶氮二异丁腈(0.041 g,0.25 mmol)与NBS (1.958 g,11.00 mmol) 置于干燥的100 mL单口圆底烧瓶中,再用量筒量取50 mL 四氯化碳倒入烧瓶中,装上回流冷凝管,抽真空并用氩气保护,将烧瓶置于事先加热到80 ℃以上的油浴中,强力搅拌,并用火焰枪辅助加热使之快速回流,至快速回流后再将反应体系温度调至80 ℃反应2 h。反应完毕后,将反应混合物冷却到室温再过滤,并用CCl4 (3 × 20 mL)洗涤,减压浓缩滤液成棕红色黏滞油状物,加入乙醇(20 mL)稍加热使之溶解,转入到烧杯(100 mL)中,并用乙醇(3 × 10 mL)洗涤烧瓶,将洗液一并倒入到烧杯中,室温搁置至总体积达10 mL或更少时,再抽滤得白色粉末状产品。粗品经硅胶柱色谱分离〔洗脱液:V (正己烷):V (乙酸乙酯) = 12∶1〕,得白色粉末,产率52.0% (1.22 g),熔点126 ~ 127 ℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3),δ: 7.788 (s, 1H), 7.637 (s,
1H), 4.594 (s, 2H), 2.604 (s, 3H). MS, m/z: C10H7BrN2
(M+ )的计算值 (实测值):233.9793 (233.9747)。
(4)中间体5的合成
2-甲基-5-溴甲基对苯二甲腈 (4) (234 mg, 1.0
mmol)和亚磷酸三乙酯 (250 mg, 1.5 mmol)加热到165 ℃反应18 h,减压除去过量的亚磷酸三乙酯,残余物用V (正己烷):V(乙酸乙酯) = 1:1重结晶,得白色晶体,产率72 % (210 mg)。1H NMR (CDCl3,
400 MHz) d: 7.758 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 7.619 (s, 1H), 4.133 (m,
4H), 3.377 (d, J = 22 Hz, 2H), 2.580 (s, 3H), 1.312 (t, J = 7.2
Hz, 6H). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) d: 141.267,
134.723, 134.662, 134.283, 117.416, 116.391, 62.929, 62.861, 32.672, 31.298,
20.102, 16.527, 16.466. MS, m/z: C14H17N2
O3P (M+ )的计算值 (实测值):292.0977 (292.0977)。
(5)中间体7的合成
除水DMF (30.0 g ,411 mmol)加到带干燥管的100mL单口圆底烧瓶中,搅拌冰水浴冷却到0 ℃,撤掉干燥管,插上装有POCl3 (27.6 g ,181.5 mmol)的恒压加料器,于0℃下搅拌逐滴滴加POCl3,滴加完后于0℃继续反应45 min,再于0℃下一次性加入N,N-二羟乙基苯胺 (10.0 g ,55mmol)的DMF (10.0 g ,137 mmol)溶液,然后慢慢升至110 ℃再继续反应2 h,冷却后倒入0.5L冰水中,搅拌滴加1M NaOH溶液调pH至7附近,过滤水洗 (3×100 mL),将固体粗品用乙醇 (2×300 mL)重结晶,得白色针状晶体。产率96% (12.9 g)。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 9.774 (s, CHO,
1H),7.767 (d, J = 9.2
Hz, 2H), 6.745 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 3.843 (t, J 1 =
J 2 = 6.8 Hz, 2CH2 Cl, 4H), 3.684 (t, J 1
= J 2 = 6.8 Hz, N(CH2)2 , 4H)。13C NMR (CDCl3,
100 MHz) δ: 190.296,151.089, 132.385, 126.760,
111.389, 53.319, 40.157。MS, m/z: C11H13Cl2NO (M+)的计算值(实测值):245.0374 (245.0371)。
(6)中间体8的合成
将N,N-二 (2-氯乙基)苯甲醛 (7) (1.25 g, 5.1
mmol)置于25 mL圆底单口烧瓶中,再加入3 mL THF和NaH (130 mg, 5.4 mmol),抽真空充氩气保护,于冰水浴下边搅拌边滴加1,4-二氰基-2-甲基-5- (二乙基磷酰基甲基)苯 (5) (1.46 g,5.0 mmol)的THF (9mL)溶液。滴加完后再于冰水浴下反应1h,撤去冰水浴于室温下反应12h。并于室温下继续反应一夜。旋干,用CH2Cl2
(4×10 mL)洗提,CH2Cl2洗提液用H2O (2×10 mL)洗涤后加无水Na2SO4干燥,过滤旋干并用硅胶柱层析[洗脱液:v (CH2Cl2):v
(石油醚)=4:1]分离,得黄色粉末,产率78% (1.49 g)。IR (KBr,cm-1):2223 (C≡N),1655 (C=C)。1H NMR (CDCl3,
400 MHz) d: 7.975 (s, 1H), 7.555 (s, 1H), 7.491 (d, J = 8.8 Hz,
2H), 7.201 (d, J = 16.4 Hz, 1H), 7.146 (d, J = 16.4 Hz, 1H),
6.706 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 3.778 (t, J 1 = J 2
= 6.8 Hz, 4H), 3.685 (t, J 1 = J 2 = 6.4 Hz,
4H), 2.556 (s, 3H)。13C NMR (CDCl3, 100 MHz) d: 147.132, 139.688,
139.505, 134.521, 134.435, 129.335, 128.909, 125.196, 118.227, 117.509,
116.980, 116.907, 114.119, 112.159, 53.530, 40.474, 20.109。MS, m/z: C21H19Cl2N3
(M+)的计算值 (实测值):383.0956 (383.0952)。
(5)探针I-1的合成
化合物 8 (383 mg, 1 mmol), 氨甲基吡中啶 (162 mg, 1.5 mmol), KI (10 mg) 和无水K2CO3 (414
mg, 3 mmol) 溶解在乙腈(25 mL)中, 然后混合物在氮气保护下搅拌回流7 d。 反应终了后过滤混合物,滤液减压脱去溶剂得粘稠状液体。粗品经柱层析(丙酮/二氯甲烷)纯化得棕黄色固体251 mg (0.600 mmol, 60%)。经甲醇进一步重结晶得针型固体( m. p.
245−246 ℃).
(KBr, cm-1): 3425 (OH), 2223 (C≡N), 1621 (C=C). 1H NMR
(CDCl3, 400 MHz) d: 8.593 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 7.967
(s, 1H), 7.680 (t, J 1 = J 2 = 7.6 Hz, 1H),
7.546 (s, 1H), 7.472 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.450 (d, J = 8.8 Hz,
1H), 7.210 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.199 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.161
(d, J = 16.4 Hz, 1H), 6.906 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 3.741 (s, 2H),
3.328 (t, J 1 = 4.8 Hz, J 2 = 5.2 Hz, 4H),
2.694 (t, J 1 = 4.8 Hz, J 2 = 5.2 Hz, 4H),
2.552 (s, 3H). 13C NMR (CDCl3, 400 MHz) d:
158.217, 152.038, 149.548, 139.726, 139.467, 136.659, 134,807, 134.412,
128.909, 128.734, 126.343, 123.519, 122.381, 118.441, 117.492, 116.968,
116.892, 115.397, 114.122, 64.690, 53.205, 48.218, 29.856, 20.079. HRMS (EI) m
/ z: 419.2113 (calcd for C27H25N5:
419.2110). Anal. Calcd for C27H25N5:C, 77.30; H, 6.01; N,
16.69. Found:C, 77.18; H, 6.08; N,
16.73.
实施例2
探针I-1对锌离子选择性:
使用上述合成的化合物I-1评价对锌离子的选择性。将1 mM的化合物I-1加到20倍过量的各种金属离子的pH 7.2的MOPS缓冲液中(100 mM KCl, 10 mM EGTA,
pH 7.2. EGTA = ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether) N,N,N',N'-tetraacetic
acid, and MOPS = 3-(morpholino)propanesulfonic acid)(分为加1 mM锌离子与不加锌离子两种情况),探针单光子激发波长为403 nm,发射波长为610 nm,测试结果显示于图5中。从图中可以看到,探针I-1对锌离子具有很高的选择性,锌离子的加入产生很大的荧光淬灭,另外钠、钾、钙、镁、锰等金属离子对检测没有干扰。
实施例3
探针I-1对pH的不敏感性:
使用上述合成的化合物I-1评价对pH的响应,对于化合物I-1在离子强度为0.1的水溶液中调节pH值为1.0左右,测定荧光强度后,加入碱液,使pH值缓慢增大,记录相应的荧光强度变化,测试结果显示于图6中。从图中可以看出探针I-1在生理pH范围内,pH变化对荧光发射基本没有影响。因此探针I-1可用于大pH范围内的细胞内锌离子的检测。
实施例4
细胞培养:
Fibroblast细胞由DEME (Invitrogen)培养液培养,成像的前一天,细胞放于平底表面皿中,成像时细胞放于含有5 % CO2和1 mM的探针I-1缓冲液于37 ℃、含5 % CO2的细胞培养箱中孵育0.5-1.0小时,用中性缓冲溶液或培养液充分洗涤后(洗涤三遍以上),图7a是白光下的图像,图7 b是双光子荧光显微镜下得到的图像。向上述含探针的细胞培养液中加入SNOC溶液(最终浓度为10 mM)在37 ℃、含5 % CO2的细胞培养箱中孵化0.5小时,用培养液冲洗三遍后,再进行双光子荧光显微成像得到细胞内锌离子的分布图像(图7c);在c中的溶液中加入TPEN (最终浓度为0.1 mM),在显微镜下观察到图7d。其中图7a 是在Fibroblast细胞培养基中加入1 mM的荧光探针分子I-1孵育1小时后在白光下观察到的图像,图7b是在Fibroblast细胞培养基中加入荧光探针分子I-1孵育1小时后在激光显微镜下观察到的图像,图7c是在b中加入SNOC后观察到的图像,图7d是在c中加入TPEN后观察到的图像。所用仪器是共聚焦双光子激光扫描显微镜,10倍目镜,型号:Zeiss 510 LSM。
Claims (3)
3.应用如权利要求1所述的细胞内锌离子检测用二苯代乙烯双光子荧光探针的方法,其特征是:将溶解于水中的细胞内锌离子检测用二苯代乙烯双光子荧光探针加入到被测的含锌离子的细胞的培养液中,使探针浓度在1~10 mM,被测细胞与探针在10 ~ 40 ℃,和含1 ~ 10 % CO2的细胞培养箱中孵育0.1-10.0小时,探针透过细胞膜,与细胞内锌离子络合发生荧光变化,用不含探针和银离子的水溶液或培养液充分洗涤后;
细胞在双光子荧光显微镜下得到锌离子分布的荧光图像,由此得到锌离子的存在、细胞内的区域分布和浓度信息。
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