CN109761965A - 一种高荧光量子产率双光子Zn2+检测荧光分子探针及其制备方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高荧光量子产率双光子Zn²⁺检测荧光分子探针及其制备方法、应用。该分子探针具体通过以下步骤合成：首先，由2,4‑二羟基苯甲醛、戊烯二酸二乙酯和无水哌啶在乙醇中反应制得产物1，产物1与乙酸酐在无水吡啶中反应得产物2，产物2与四氧化锇、高碘酸钠在四氢呋喃反应得产物3，产物3与无水碳酸钾在甲醇中反应得产物4；最后，将产物4溶解于乙醇中，加入6‑肼基烟酸、冰乙酸回流，重结晶等步骤，即得高荧光量子产率双光子Zn²⁺检测荧光分子探针。适用于细胞、斑马鱼等生物样本中Zn²⁺的定性分析，兼具毒性小、穿透深度深等优点；可应用于分析化学、生命有机分析化学、疾病预诊及医学临床检测等相关领域。

Description

一种高荧光量子产率双光子Zn2+检测荧光分子探针及其制备 方法、应用

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种高荧光量子产率双光子Zn²⁺检测荧光分子探针及其制备方法、应用。

背景技术

锌离子是多种生物过程中的重要组成部分，通常以紧密结合的形式存在于蛋白质中。此外，包括大脑、肠、胰腺和视网膜在内的各种人体组织中也存在可移动的细胞内锌离子。此外，已知锌离子在调节细胞凋亡中发挥作用，并在此过程中从细胞内金属蛋白酶中释放。游离锌代谢紊乱与许多病理状态密切相关，如阿尔兹海默病，癫痫，帕金森病，缺血性脑卒中，婴儿腹泻等。当前，锌离子检测方法主要以荧光分子探针检测为主，所报导的方法虽然各有优点，但总的来说多为单光子激发、短波发射的分子探针，这会导致生物检测中光漂白和组织损伤，同时组织深度的检测会受到限制，也会因生物自荧光的干扰而使结果不准确。这些问题对于生物样本中锌离子的检测是非常受限制的。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述问题，提供一高荧光量子产率双光子锌离子检测荧光分子探针及其制备方法，制备得到的分子探针可应用于双光子生物样本检测，双光子激发可使分子探针在生物样本成像中，受散射影响小，容易穿透样品，对细胞组织毒性小。且双光子激发可使较多的激发光到达焦平面，从而可以穿透更深的样品。探针还具有荧光量子产率高、现象明显易观察和准确度高等优点，设备便捷操作，可实施性强，特别适合大批量样本组合筛选等大数据研究。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

本发明还提供了一种上述制备的高荧光量子产率双光子锌离子检测荧光分子探针，该探针的分子结构为：。

本发明还提供了一种高荧光量子产率双光子Zn²⁺检测荧光分子探针的制备方法，首先，由2,4-二羟基苯甲醛、戊烯二酸二乙酯和无水哌啶在乙醇中反应制得产物1，产物1与乙酸酐在无水吡啶中反应得产物2，产物2与四氧化锇、高碘酸钠在四氢呋喃反应得产物3，产物3与无水碳酸钾在甲醇中反应得产物4；最后，将产物4溶解于乙醇中，加入6-肼基烟酸、冰乙酸回流，经重结晶等步骤，即得高荧光量子产率双光子Zn²⁺检测荧光分子探针。

进一步的，所述的多功能超灵敏锌离子检测荧光分子探针的制备方法具体步骤为：

（1）将2,4-二羟基苯甲醛溶解于乙醇中，溶解浓度0.02～0.06g/mL，然后加入戊烯二酸二乙酯，溶解浓度0.067g/mL，混合均匀后滴加无水哌啶 2～5 mL，回流24h，冷却，析出黄色固体，固体用无水乙醇重结晶，得产物1；

（2）将产物1溶解于无水吡啶中，溶解浓度0.025g/mL，然后加入乙酸酐，加入浓度1mol/L，搅拌0.5h，加入40倍质量的碎冰，搅拌10min后析出灰白色固体，固体用体积比1:5的乙腈-二氯甲烷洗脱剂洗脱，旋蒸，得产物2；

（3）将产物2溶解于四氢呋喃中，溶解浓度0.011 g/mL，然后加入质量分数4%的四氧化锇水溶液，搅拌0.5h，然后加入高碘酸钠，加入浓度0.017g/mL，室温下搅拌5～6天，减压蒸馏除去四氢呋喃加入二氯甲烷100mL，水洗，有机层干燥除水，得到白色固体，固体用体积比为从1:0～5的二氯甲烷-乙腈体系洗脱剂梯度洗脱，旋蒸，得产物3；

（4）将产物3溶解于甲醇中，溶解浓度0.012 g/mL，然后加入无水碳酸钾，溶解浓度0.015 g/mL，室温下搅拌0.5h，TLC分析原料消耗完毕后，加入1当量浓度的盐酸调节pH至3～4，析出黄色固体，过滤，滤饼用水洗涤，真空干燥，得产物4；

（5）将产物4溶解于乙醇中，溶解浓度0.002 g/mL，然后加入6-肼基烟酸，溶解浓度0.002 g/mL，混合均匀后加入2~3滴冰乙酸，回流3.5h，减压蒸馏浓缩溶剂，冷却析出深黄色固体，固体用重结晶的方法纯化后得到金黄色絮状晶体，即得高荧光量子产率双光子Zn²⁺检测荧光分子探针。

进一步的，所述的高荧光量子产率双光子Zn²⁺检测荧光分子探针效果判断指标如下：

反应产物在二甲亚砜中的荧光量子产率：73.99% ；

检测速度：立即反应，反应时间为5秒；

颜色变化：日光灯下表现为由淡黄色变为绿色；紫外灯下表现由微弱荧光变为亮绿色；

双光子吸收截面积：61GM

光学机理指标：PET 机理的锌离子荧光探针。

本发明还提供了一种上述方法制备的高荧光量子产率双光子Zn²⁺检测荧光分子探针的应用，适用于细胞、斑马鱼等生物样品中锌离子的定性分析；其中生物样本包括血清、活细胞、斑马鱼，可应用于分析化学、生命有机分析化学、疾病预诊及医学临床检测相关领域。

进一步的，所述高荧光量子产率双光子Zn²⁺检测荧光分子探针定量分析生物样本中锌离子时，适用于检测血清中锌离子含量；定性检测生物样本中锌离子时，适用于活细胞和斑马鱼内锌离子的检测。

本发明提供的荧光分子探针检测血清中锌离子含量的方法，包括以下步骤：

1）配制溶液

探针储备液：准确称取高荧光量子产率双光子Zn²⁺检测荧光分子探针溶于无水DMSO，配制为浓度100μM的探针储备液；

锌离子储备液：准确称取待测目标物0.0029g硫酸锌溶于10ml蒸馏水中，配制为浓度1000μM的锌离子储备液；

2）定性检测血清-锌离子标准品梯度变化曲线

将步骤1）配制的锌离子储备液用蒸馏水稀释得到梯度浓度为0～20μM的锌离子标准溶液，然后分别取200 μL锌离子标准溶液与100μL步骤1）配制的探针储备液和650μL血清储备液混合后，加入50 μL 浓度为10 mM、 pH 7.42的Tris-HCl缓冲液，充分振荡，使体系混合均匀，在25℃下放置50min，然后经荧光分光光度计检测，验证血清-锌离子标准品梯度变化曲线；

步骤2）中，所述的血清储备液以全血进行低温不抗凝低速离心分离即得。

进一步地，上述方法检测待测血清样品时，以荧光检测的方法对待测物进行多次平行检测（n=10），并用锌离子标准品溶液进行校准，得到荧光检测的最优检测范围，从而根据不同样品所含待测物的浓度范围来选择荧光检测手段进行定量。

进一步的，所述荧光检测范围优选为，0-20μM。

本发明所述的高荧光量子产率双光子Zn²⁺检测荧光分子探针定性检测生物样本中锌离子时，适用于血清样本、活细胞和斑马鱼内锌离子的检测。

本发明利用探针进行血清样品中锌离子的检测时，方法为：待测血清样品与无水DMSO按体积比5:1混合后，5000 rpm离心20min，取出上清液过透析膜进行处理，然后取200μL透析后上清液依次加入100μL探针储备液和200 μL锌离子储备液，用pH 7.42的Tris-HCl缓冲液定容至1000μL后，室温下（20℃），根据颜色判断血清样品中是否含有锌离子，判断标准为：紫外灯下为绿色荧光则血清样品中含有锌离子。

本发明利用探针进行活细胞内锌离子的检测时，方法为：将待测活细胞样品在培养基中培育18～26h，待测活细胞接种量为2×10⁷～9×10⁷个/mL，然后加入高量子产率双光子Zn²⁺检测荧光分子探针，探针浓度为10μM，于25 ℃培育10～12h，以pH 7.42的Tris-HCl缓冲液洗多次，然后于双光子激光共聚焦显微镜下观察细胞成像，根据发光情况判断待测活细胞中是否含有锌离子，判断标准为：紫外灯下为绿色则活细胞样品中含有锌离子；所述的活细胞优选为海拉细胞，培养基优选为DMEM培养基。

本发明利用探针进行斑马鱼内锌离子的检测时，方法为：将在水中自然生长72h的斑马鱼放入培养水中，分两组，每组10条。加入高荧光量子产率双光子Zn²⁺检测荧光分子探针，探针浓度为10μM，培育2h，以去离子水冲洗多次，然后向第二组中加入20μM锌离子。将两组鱼分别置于双光子激光共聚焦显微镜下成像，根据发光情况判断荧光是否是探针与锌离子反应产物激发的。判断标准为：视野下有强绿色荧光的斑马鱼含有锌离子；微弱或无荧光的斑马鱼是仅有探针的斑马鱼。所述的斑马鱼为72h的斑马鱼，培养水优选为适宜斑马鱼生长的培养水。

本发明成功合成一个新型高荧光量子产率、双光子性质的荧光探针，用于检测锌离子，并且系统地在试管、细胞和斑马鱼体内进行研究。探针设计思路为合成7-羟基香豆素（7-hydroxycoumarin）作为基础母体环，先后引入醛基并接6-肼基烟酸（6-Hydrazinonicotinic acid），构成高荧光量子产率双光子Zn²⁺检测荧光探针分子 HN-Zn（(E)-6-(2-((7-hydroxy-2-oxo-2H-chromen-3-yl)methylene)hydrazinyl)nicotinicacid）。实施检测时，加入待测物锌离子后，探针分子HN-Zn的氮迅速与锌配位，释放荧光。该探针呈现出优秀的特异性、灵敏度、准确性，同时该探针具有双光子性质，可以进行高分辨荧光成像和双光子成像。此外，该探针可以应用于锌离子在细胞环境以及斑马鱼中动态检测。这些特征都使所得该分子探针成为探索生命体系锌离子代谢过程的重要工具。

本发明制备的高荧光量子产率双光子Zn²⁺检测荧光分子探针检测机理（如图1所示）：

利用羟基的供吸电子能力使HN-Zn的荧光发生变化，利用氮与金属锌的快速配位，产物的羟基变为供电子基，从而增强荧光信号并提高灵敏度。

本发明技术方案有益效果为：1）荧光量子产率高，提高了检测的准确度；2）在不加任何其他附加材料的条件下，提高了检测灵敏性，并且避免了填加附加材料，减少附加材料的消耗以及减少了在检测中的误差来源；3）生物样品成像多种多样化：本发明在检测中成功检测了待测物在血清、活细胞和斑马鱼中双光子成像，这种方法是在之前的方法中没有能够做到的。双光子成像的实现对于锌离子这一生物标志物的深入研究起到很大的推动作用。

附图说明

图1为本发明制备的高荧光量子产率双光子Zn²⁺检测荧光分子探针的合成路线；

图2 为本发明制备的高荧光量子产率双光子Zn²⁺检测荧光分子探针的H谱；

图3为本发明制备的高荧光量子产率双光子Zn²⁺检测荧光分子探针的C谱；

图4为本发明制备的高荧光量子产率双光子Zn²⁺检测荧光分子探针的高分辨质谱；

图5为探针对待测物锌离子梯度浓度的荧光响应图（锌离子浓度：0～20μM）；

图6为双光子细胞成像实验；

图7为双光子斑马鱼成像实验；

图8为探针（10μM）与锌离子（10μM）在pH范围为2.47~12.10内的荧光响应（缓冲液为Tris-HCl、pH为7.42、反应时间为10s）

图9为温度对荧光探针（10μM）与锌离子（10μM）反应的荧光信号影响（缓冲液为Tris-HCl、pH为7.42、反应时间为10s）；

图10为探针对待测物锌离子及其他物质选择性对照试验（其他物质）。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明技术方案，在围绕本发明所描述技术思想情况下，根据一般的技术知识和通常用的技术手段研究的多种方式替换或变更，都属于本发明的范围内。

本发明下述实施例中：

荧光检测是利用日立Hitachi F-7000荧光光谱仪来进行，激发波长为430nm，发射波长为480nm，激发和发射狭缝宽度均为 10.0 nm，电压400V，扫描速度2400纳米/分；

荧光成像观测是通过LSM/880NLO双光子激光共聚焦显微镜来进行；

化合物的分离提纯是采用薄层色谱硅胶柱来实现。

实施例1：制备高荧光量子产率双光子Zn²⁺检测探针

（1）将2,4-二羟基苯甲醛溶解于乙醇中，溶解浓度0.02～0.06g/mL，然后加入戊烯二酸二乙酯，溶解浓度0.067g/mL，混合均匀后滴加无水哌啶 2～5 mL，回流24h，冷却，析出黄色固体，固体用无水乙醇重结晶，得产物1；

（2）将产物1溶解于无水吡啶中，溶解浓度0.025g/mL，然后加入乙酸酐，加入浓度1mol/L，搅拌0.5h，加入40倍质量的碎冰，搅拌10min后析出灰白色固体，固体用体积比1:5的乙腈-二氯甲烷洗脱剂洗脱，旋蒸，得产物2；

（3）将产物2溶解于四氢呋喃中，溶解浓度0.011 g/mL，然后加入质量分数4%的四氧化锇水溶液，搅拌0.5h，然后加入高碘酸钠，加入浓度0.017g/mL，室温下搅拌5～6天，减压蒸馏除去四氢呋喃加入二氯甲烷100mL，水洗，有机层干燥除水，得到白色固体，固体用体积比为从1:0～5的二氯甲烷-乙腈体系洗脱剂梯度洗脱，旋蒸，得产物3；

（4）将产物3溶解于甲醇中，溶解浓度0.012 g/mL，然后加入无水碳酸钾，溶解浓度0.015 g/mL，室温下搅拌0.5h，TLC分析原料消耗完毕后，加入1当量浓度的盐酸调节pH至3～4，析出黄色固体，过滤，滤饼用水洗涤，真空干燥，得产物4；

（5）将产物4溶解于乙醇中，溶解浓度0.002 g/mL，然后加入6-肼基烟酸，溶解浓度0.002 g/mL，混合均匀后加入2~3滴冰乙酸，回流3.5h，减压蒸馏浓缩溶剂，冷却析出深黄色固体，固体用重结晶的方法纯化后得到金黄色絮状晶体，即得高荧光量子产率双光子Zn²⁺检测荧光分子探针。

制备得到的高荧光量子产率双光子Zn²⁺检测荧光分子探针的H谱、C谱及高分辨质谱图见图2、图3和图4，效果判断指标如下：

反应产物在二甲亚砜中的荧光量子产率：73.99% ；

检测速度：立即反应，反应时间为5秒；

颜色变化：日光灯下表现为由淡黄色变为绿色；紫外灯下表现由微弱荧光变为亮绿色；

双光子吸收截面积：61GM

光学机理指标：PET 机理的锌离子荧光探针。

实施例1制备的探针与锌离子反应可行性验证：取0.01g高荧光量子产率双光子Zn²⁺检测荧光分子探针溶于10mL DMSO中，向其中加入2倍当量锌离子并在室温下搅拌10min，得产物。

对比例1

步骤（1）-（4）同实施例1；

步骤（5）：将产物4溶解于乙醇中，溶解浓度0.002 g/mL，然后加入2，4-二硝基苯肼，溶解浓度0.002 g/mL，混合均匀后加入2~3滴冰乙酸，回流4~5h，减压蒸馏浓缩溶剂，冷却析出深黄色固体，固体用重结晶的方法纯化后得到产物。

该产物仅能检测次氯酸根，并不能与锌离子作用。

效果实施例（一）

实施例1制备的高荧光量子产率双光子Zn²⁺检测荧光分子探针定量分析生物样本中锌离子：检测血清中锌离子含量

1）配制溶液

探针储备液：准确称取高荧光量子产率双光子Zn²⁺检测荧光分子探针溶于无水DMSO，配制为浓度100μM的探针储备液；

锌离子储备液：准确称取待测目标物0.0029g硫酸锌溶于10ml蒸馏水中，配制为浓度1000μM的锌离子储备液；

2）定性检测血清-锌离子标准品梯度变化曲线

将步骤1）配制的锌离子储备液用蒸馏水稀释得到梯度浓度为0～20μM的锌离子标准溶液，然后分别取200 μL锌离子标准溶液与100μL步骤1）配制的探针储备液和650μL血清储备液混合后，加入50 μL 浓度为10 mM、 pH 7.42的Tris-盐酸缓冲液，充分振荡，使体系混合均匀，在25℃下放置50min，然后经荧光分光光度计检测，验证血清-锌离子标准品梯度变化曲线（图5）；

效果实施例（二）

定性检测活细胞中锌离子

活细胞内锌离子的检测，方法为：将待测活细胞样品在培养基中培育18～26h，待测活细胞接种量为2×10⁷～9×10⁷个/mL，然后加入高量子产率双光子Zn²⁺检测荧光分子探针，探针浓度为10μM，于25 ℃培育10～12h，以pH 7.42的Tris-HCl缓冲液洗多次，然后于双光子激光共聚焦显微镜下观察细胞成像，根据发光情况判断待测活细胞中是否含有锌离子，判断标准为：紫外灯下为绿色则活细胞样品中含有锌离子；所述的活细胞优选为海拉细胞，培养基优选为DMEM培养基。

图6-1是探针在细胞内的双光子成像，图6-2、6-3分别是加入锌离子低浓度、高浓度成像，图6-4是先后加入锌离子、锌离子强配位剂(TPEN)、探针成像。该图中a、b、c分别是眀场图、400nm-600nm收集光区图和叠加图。

对比试验分析：在800nm激发下，肝癌细胞与探针 (10μM)培育后，进行检测，并未检测出荧光发射, 这表明探针对于细胞中的各种物质对荧光没有造成干扰。而后，分别加入1倍、10倍量的待测物锌离子，检测出明显的发射效果，绿色荧光的成像得以顺利观察到。最后利用消除锌离子的方法验证探针在细胞层面检测锌离子的可行性，这说明探针可以应用于细胞成像方面。

效果实施例（三）

定性检测斑马鱼中的锌离子

斑马鱼中锌离子的检测，方法为：将在水中自然生长72h的斑马鱼放入培养水中，分两组，每组10条。加入高荧光量子产率双光子Zn²⁺检测荧光分子探针，探针浓度为10μM，培育2h，以去离子水冲洗多次，然后向第二组中加入20μM锌离子。将两组鱼分别置于双光子激光共聚焦显微镜下成像，根据发光情况判断荧光是否是探针与锌离子反应产物激发的。判断标准为：视野下有强绿色荧光的斑马鱼含有锌离子；微弱或无荧光的斑马鱼是仅有探针的斑马鱼。所述的斑马鱼为72h的斑马鱼，培养水优选为适宜斑马鱼生长的培养水。

图7-1为探针在斑马鱼中的双光子成像，图7-2为探针、锌离子先后孵育的双光子成像。该图中a、b、c分别是眀场图、400nm-600nm收集光区图和叠加图。

对比试验分析：在800nm激发下，斑马鱼与探针 (10μM)培育后，进行检测，检测出微弱荧光发射, 这表明探针对于斑马鱼中的微量锌离子作用。而后，加入2倍量的待测物锌离子，检测出明显的发射效果，绿色荧光的成像得以顺利观察到。该方法验证探针在斑马鱼层面检测锌离子的可行性，这说明探针可以应用于斑马鱼成像方面。

本发明多功能超灵敏Zn²⁺检测荧光分子探针各项技术指标的实验验证，具体如下：

本发明技术方案实验条件优化试验

1、反应体系pH值的优化

一般而言，pH 值影响有机分子探针的荧光性质，因而在反应中一般利用缓冲溶液加以调节pH从而适应实验的要求。针对本发明要探测的锌离子本身特点，研究了在生理环境下可能达到的pH值（2.47~12.10）。从图8中可见，由于锌离子与酸碱的作用，在生理环境范围内pH值的波动对于目标锌离子与探针的混合溶液所表现的荧光强度响应产生了一定的影响。因此，在一般的生物环境体系中，当 pH值为7.42时，探针与锌离子的反应达到最优化。

2、反应温度的优化

在化学反应中，温度的影响是非常重要，对于本发明所研究的生物样本如活细胞、组织体系更是如此。不同温度下探针对待测目标物有较好的反应是整个实验成败的关键。如下图9所示，对温度在20.5～45.5 ℃范围的反应具有的荧光响应进行了研究。由实验很容易发现，本发明所研究的探针在所取的温度范围内与待测物反应都具有比较好的荧光反应，因此，可以认为温度对体系影响可以忽略

3、探针分子检测锌离子的选择性分析

下述物质储备液配制方法：分别用蒸馏水溶解Br^-、Cl^-、F^-、SO₄ ^2-、SO₃ ^2-、HCO₃ ^-、NO₂ ^-、NO₃ ^-、SCN^-、ClO₃ ^-、CO₃ ^2-、Zn²⁺、Na⁺、Cu²⁺、PO₄ ^3-、H₂PO₄ ^-、HPO₄ ^2-、Ca²⁺、Mg²⁺、Ag⁺、Cd²⁺、K⁺、Al³⁺、Fe²⁺、Fe³⁺，得到上述各种离子的储备液（上述各物质溶液依次对应图10中标号1-25），结果如图10所示。

首先，相比较待测物锌离子而言，探针对其他各种离子未表现出响应，这是由于锌离子具有不同于其他离子的结构所导致的。其次，通过pH滴定实验发现，在pH值为2.47～12.10的区间范围，荧光的强度在6.41与7.42时达到最强，这表明该探针在生物环境即pH为7.42时是完全适用的。同时，温度实验证实了本发明的探针非常适用于生物样品。

Claims (8)

1.一种高荧光量子产率双光子Zn²⁺检测荧光分子探针，其特征在于，该探针的分子结构为：。

2.一种如权利要求1所述的高荧光量子产率双光子Zn²⁺检测荧光分子探针的制备方法，其特征在于，具体步骤为：由2,4-二羟基苯甲醛、戊烯二酸二乙酯和无水哌啶在乙醇中反应制得产物1，产物1与乙酸酐在无水吡啶中反应得产物2，产物2与四氧化锇、高碘酸钠在四氢呋喃反应得产物3，产物3与无水碳酸钾在甲醇中反应得产物4；最后，将产物4溶解于乙醇中，加入6-肼基烟酸、冰乙酸回流，经重结晶等步骤，即得高荧光量子产率双光子Zn²⁺检测荧光分子探针。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，具体步骤为：

（1）将2,4-二羟基苯甲醛溶解于乙醇中，溶解浓度0.02～0.06g/mL，然后加入戊烯二酸二乙酯，溶解浓度0.067g/mL，混合均匀后滴加无水哌啶 2～5 mL，回流24h，冷却，析出黄色固体，固体用无水乙醇重结晶，得产物1；

（2）将产物1溶解于无水吡啶中，溶解浓度0.025g/mL，然后加入乙酸酐，加入浓度1mol/L，搅拌0.5h，加入40倍质量的碎冰，搅拌10min后析出灰白色固体，固体用体积比1:5的乙腈-二氯甲烷洗脱剂洗脱，旋蒸，得产物2；

（3）将产物2溶解于四氢呋喃中，溶解浓度0.011 g/mL，然后加入质量分数4%的四氧化锇水溶液，搅拌0.5h，然后加入高碘酸钠，加入浓度0.017g/mL，室温下搅拌5～6天，减压蒸馏除去四氢呋喃加入二氯甲烷100mL，水洗，有机层干燥除水，得到白色固体，固体用体积比为从1:0～5的二氯甲烷-乙腈体系洗脱剂梯度洗脱，旋蒸，得产物3；

（4）将产物3溶解于甲醇中，溶解浓度0.012 g/mL，然后加入无水碳酸钾，溶解浓度0.015 g/mL，室温下搅拌0.5h，TLC分析原料消耗完毕后，加入1当量浓度的盐酸调节pH至3～4，析出黄色固体，过滤，滤饼用水洗涤，真空干燥，得产物4；

（5）将产物4溶解于乙醇中，溶解浓度0.002 g/mL，然后加入6-肼基烟酸，溶解浓度0.002 g/mL，混合均匀后加入2~3滴冰乙酸，回流3.5h，减压蒸馏浓缩溶剂，冷却析出深黄色固体，固体用重结晶的方法纯化后得到金黄色絮状晶体，即得高荧光量子产率双光子Zn²⁺检测荧光分子探针。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述Zn²⁺检测荧光分子探针具荧光量子产率高、双光子检测的效果判断指标如下：

反应产物在二甲亚砜中的荧光量子产率：73.99% ；

检测速度：立即反应，反应时间为5秒；

颜色变化：日光灯下表现为由淡黄色变为绿色；紫外灯下表现由微弱荧光变为亮绿色；

双光子吸收截面积：61GM

光学机理指标：PET 机理的锌离子荧光探针。

5.一种如权利要求2-4任一项制备方法制备的高荧光量子产率双光子Zn²⁺检测荧光分子探针的应用，其特征在于，适用于生物样品中锌离子的定性分析。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：定性检测生物样品中锌离子时，所述生物样品为血清，具体步骤包括：

1）配制溶液

探针储备液：准确称取高荧光量子产率双光子Zn²⁺检测荧光分子探针溶于无水DMSO，配制为浓度100μM的探针储备液；

锌离子储备液：准确称取待测目标物0.0029g硫酸锌溶于10ml蒸馏水中，配制为浓度1000μM的锌离子储备液；

2）定性检测血清-锌离子标准品梯度变化曲线

将步骤1）配制的锌离子储备液用蒸馏水稀释得到梯度浓度为0～20μM的锌离子标准溶液，然后分别取200 μL锌离子标准溶液与100μL步骤1）配制的探针储备液和650μL血清储备液混合后，加入50 μL 浓度为10 mM、 pH 7.42的Tris-HCl缓冲液，充分振荡，使体系混合均匀，在25℃下放置50min，然后经荧光分光光度计检测，验证血清-锌离子标准品梯度变化曲线。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：检测待测血清样品时，以荧光检测的方法对待测物进行多次平行检测，并用锌离子标准品溶液进行校准，得到荧光检测的最优检测范围，从而根据不同样品所含待测物的浓度范围来选择荧光检测手段进行定量。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：荧光检测范围为，0-20μM。