CN110885326A - 高水溶性苯基乙酸酯化合物及包含该化合物的羧酸酯酶检测试剂盒 - Google Patents

高水溶性苯基乙酸酯化合物及包含该化合物的羧酸酯酶检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及羧酸酯酶检测技术领域，具体涉及一种高水溶性苯基乙酸酯化合物及该化合物的制备方法。本发明还涉及包含该化合物的羧酸酯酶检测试剂盒以及使用该羧酸酯酶检测试剂盒对待测样品中的羧酸酯酶进行定性和定量检测的方法。本发明的羧酸酯酶检测试剂盒中的苯基乙酸酯化合物具有高水溶性，并具有近红外荧光发射波长，可用荧光光谱法检测，背景信号较低，背景噪音少。本发明的羧酸酯酶检测试剂盒适于检测成分复杂的生物样品中的羧酸酯酶，还适合于监测活体样本中羧酸酯酶的分布。

Description

高水溶性苯基乙酸酯化合物及包含该化合物的羧酸酯酶检测 试剂盒
技术领域
本发明属于羧酸酯酶检测技术领域，具体涉及高水溶性苯基乙酸酯化合物及包含该化合物的羧酸酯酶检测试剂盒。
背景技术
羧酸酯酶(carboxylesterase，CXE)是一类广泛存在于动植物及微生物中具有α/β折叠结构域的水解酶类，能有效地催化酯类和酰胺类化合物水解，与多种药物、环境毒物及致癌物的解毒和代谢有关，并参与脂质运输和代谢。另外，肝微粒体羧酸酯酶与特定致癌物的代谢及肝癌的发生相关。基于羧酸酯酶的重要生理作用，检测羧酸酯酶及其活性对许多动植物生理过程的研究及药物的疗效评价具有非常重要的科学意义和实际应用价值。
目前，用于羧酸酯酶检测的方法有高效液相色谱、质谱与气相色谱联用、化学发光法、荧光法等。荧光法因其具有简便性、较高的灵敏度和高时空分辨能力等特点而得到了广泛的应用。但是，荧光法的建立也存在一些难点，许多生物体及其组织在可见光的激发下自身会发射荧光，严重干扰生物样品的荧光检测和成像，故使得荧光分析的灵敏度和准确性受到了很大的影响，大部分探针存在稳定性差，波长短，无法适应于活体成像等缺点。近红外荧光探针的最大吸收波长和发射波长为600nm～900nm，光渗透组织可达数厘米，具有优良的生物组织穿透能力与抵抗背景干扰能力，能够减少对活体的损伤，在生物样本检测中已显示出其独特的优越性。然而，近红外荧光母体又受到水溶性，稳定性的限制，不能很好的将其应用到活体检测中。因此发展一种高水溶性的近红外荧光探针用于检测羧酸酯酶，进而应用到活体检测具有非常重要的意义。
中国专利申请CN201710199944.X公开了一种用于检测羧酸酯酶的增强型荧光探针及其制备方法和应用，该探针能够避免外界的干扰，提高检测的精确度，但是这种方法波长在可见光波段，很多样品组成较为复杂，尤其是对于生物组织或者活体组织的检测，这种检测荧光探针无法适用。中国专利申请CN201810129535.7公开了一种羧酸酯酶的荧光探针及其制备方法和应用，该探针能够延长细胞和组织中检测羧酸酯酶的激发波长800nm，降低对细胞和组织的光损伤，增加组织的穿透深度和成像深度。但是，所合成探针需要用二甲基亚砜进行溶解，进而进行各种检测，该探针水溶性受到限制。
综上所述，目前本领域急需发展一种高水溶性的近红外荧光探针、以及利用该探针对羧酸酯酶进行检测的新方法。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明以三碳菁IR-783骨架为荧光母体，以4-(氯甲基)苯基乙酸酯作为特异性响应基团，设计合成了一种高水溶性的可在近红外发射波长范围内检测羧酸酯酶的化合物，并利用该化合物实现了羧酸酯酶的有效检测。具体而言，本发明的目的是通过如下方面实现的：
在第一方面，本发明提供了一种式(I)所示的高水溶性苯基乙酸酯化合物，
Figure BDA0002276871930000021
在第二方面，本发明了提供式(I)所示的高水溶性苯基乙酸酯化合物的制备方法，所述方法包括如下步骤：
步骤(A)：在碱存在的条件下，式(IV)所示的化合物与式(V)所示的化合物经取代分解重排反应，得到式(II)所示的化合物；
Figure BDA0002276871930000022
步骤(B)：在碱存在的条件下，式(II)所示的化合物与式(III)所示的化合物发生亲核取代反应，得到式(I)所示高水溶性苯基乙酸酯化合物，
Figure BDA0002276871930000031
在第三方面，本发明提供了一种羧酸酯酶检测试剂盒，所述试剂盒包含试剂储备液a、试剂储备液b、任选的羧酸酯酶标准储备溶液以及用于检测羧酸酯酶的说明书，其中，所述试剂储备液a是pH值为6～8的磷酸盐缓冲液，所述试剂储备液b为式(I)所示高水溶性苯基乙酸酯化合物的溶液。
在第四方面，本发明提供了使用第三方面所述的羧酸酯酶检测试剂盒对待测样品中的羧酸酯酶含量进行定量检测的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)绘制标准曲线
以635nm～690nm作为激发波长，测定一系列不同浓度的羧酸酯酶标准品溶液在发射波长690nm～850nm处的荧光强度，记为F；测定不含羧酸酯酶的空白对照样品在相同发射波长处的荧光强度，记为F0，荧光强度差值ΔF＝F–F0；以羧酸酯酶的浓度C为横坐标，荧光强度差值ΔF为纵坐标，绘制标准曲线；
其中，所述不同浓度的羧酸酯酶标准品溶液是由所述试剂盒中的试剂储备液a、试剂储备液b和羧酸酯酶标准储备溶液配制得到的；
(2)检测羧酸酯酶待测样品中的羧酸酯酶的浓度
将步骤(1)中的羧酸酯酶标准品溶液替换为羧酸酯酶待测样品混合溶液，按照与步骤(1)所述的相同方法检测所述待测样品混合溶液在与步骤(1)相同的发射波长处的荧光强度，记为F’，荧光强度差值记为ΔF’；将ΔF’代入步骤(1)所得标准曲线，进而得到待测样品中羧酸酯酶的浓度；
其中，所述羧酸酯酶待测样品混合溶液是由所述试剂盒中的试剂储备液a、试剂储备液b和所述羧酸酯酶待测样品配制得到的。
在第五方面，本发明还提供了另一种使用第三方面所述的羧酸酯酶检测试剂盒对待测样品中的羧酸酯酶进行定性检测的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)测定对照样品的荧光强度或荧光成像
以635nm～690nm作为激发波长，向对照样品中加入试剂储备液b，孵育预定时间后用试剂储备液a清洗以除去多余的试剂储备液b，获得对照样品体系；然后在发射波长为690nm～850nm处用荧光仪测定所述对照样品体系的荧光强度，或者是用激光共聚焦对所述对照样品体系进行荧光成像；
(ii)测定待测样品的荧光强度或荧光成像
将步骤(i)中的对照样品替换为待测样品，按照与步骤(i)所述的相同的方法获得待测样品体系的荧光强度或者荧光成像，并与步骤(i)测得的所述对照样品体系的荧光强度或荧光成像对比；
当所述待测样品体系的荧光强度大于所述对照样品体系的荧光强度或者所述待测样品体系的荧光成像亮度比所述对照样品体系的荧光成像强时，则说明相对于所述对照样品，所述待测样品中含有羧酸酯酶和/或羧酸酯酶的浓度更高。
有益效果
与现有技术相比，本发明的羧酸酯酶检测试剂盒，具有以下特点：
1.本发明的羧酸酯酶检测试剂盒中试剂储备液b(包含式(I)化合物)本身荧光较弱；而与羧酸酯酶反应后则荧光强度会明显增强，在690nm～750nm的发射波长处产生强吸收，并在706nm的发射波长处荧光显著增强，该荧光发射波段为近红外光区，背景干扰少，因此本发明的羧酸酯酶检测试剂盒具有较高的准确性和灵敏度。
2.本发明的羧酸酯酶检测试剂盒，荧光产生反应速度快，20分钟内即可显色稳定。
3.本发明的羧酸酯酶检测试剂盒，检测灵敏度高，羧酸酯酶浓度在大于0.01U/mL时即有荧光增强信号，荧光强度随羧酸酯酶浓度的增加而增强，在羧酸酯酶浓度在0.01-0.3U/mL之间时，荧光强度与羧酸酯酶浓度，之间呈线性关系，相关度R达到0.99以上。
4.本发明的羧酸酯酶检测试剂盒，羧酸酯酶对荧光的增强反应具有特异性，不受其他常见的氯化钾、氯化钙、氯化镁、葡萄糖、过氧化氢、半胱氨酸、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶等物种的干扰。
5.本发明的羧酸酯酶检测试剂盒中的化合物具有高水溶性，并具有近红外荧光发射波长，可用荧光光谱法检测，背景信号较低，背景噪音少，适于检测成分复杂的生物样品，还适合于监测活体样本中羧酸酯酶的分布。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或数值，这些范围或数值应当理解为包含接近这些范围或数值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
在本发明中，术语“高水溶性”是指在20℃下，物质在100克水里达到饱和状态时所溶解的克数大于10g。本发明的苯基乙酸酯化合物中引入了作为亲水性基团的磺酸基，因此，本发明的苯基乙酸酯化合物具有高水溶性。
在第一种实施方式中，本发明提供了一种式(I)所示的高水溶性苯基乙酸酯化合物，
Figure BDA0002276871930000051
在第二种实施方式中，本发明了提供式(I)所示的高水溶性苯基乙酸酯化合物的制备方法，所述方法包括如下步骤：
步骤(A)：在碱存在的条件下，式(IV)所示的化合物与式(V)所示的化合物经取代分解重排反应，得到式(II)所示的化合物；
Figure BDA0002276871930000061
步骤(B)：在碱存在的条件下，式(II)所示的化合物与式(III)所示的化合物发生亲核取代反应，得到式(I)所示高水溶性苯基乙酸酯化合物，
Figure BDA0002276871930000062
在优选的实施方式中，在所述步骤(A)和步骤(B)中，所述碱均选自有机碱或无机碱；优选地，所述有机碱选自三乙胺、二异丙基乙基胺或吡啶中的至少一种；优选地，所述无机碱选自碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠和碳酸氢钠中的至少一种。
在优选的实施方式中，所述步骤(A)满足如下条件中的一项或多项：
所述式(IV)所示的化合物、式(V)所示的化合物和碱的投料摩尔比为1:(1～5):(0.5～5)、优选1:(2～2.5):(2～2.5)；
反应在惰性气体、优选氮气或氩气中进行；
反应时间为1小时～24小时、优选5小时～24小时；
反应温度为30℃～60℃、优选40℃～50℃；以及
反应溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和乙腈中的至少一种。
在本发明中，所述步骤(A)的反应时间根据投料量的不同为1小时～24小时，随着投料量的增加，反应时间相应地延长。
在优选的实施方式中，所述步骤(B)满足如下条件中的一项或多项：
所述式(II)所示的化合物、式(III)所示的化合物和碱的投料摩尔比为1:(1～2):(1.5～2)、优选1:(1.5～2):(1.5～2)；
反应在惰性气体、优选氮气或氩气中进行；
反应时间为2小时～4小时、优选3小时～4小时；
反应温度为20℃～60℃、优选40℃～50℃；以及
反应溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺和乙腈中的至少一种。
在本发明中，所述步骤(B)需严格控制反应时间，隔时进行薄层色谱TLC检测反应进程，所述步骤(B)的反应时间根据投料量的不同为2小时～4小时，随着投料量的增加，反应时间相应地延长。
在本发明的所述步骤(A)和步骤(B)中，反应溶剂的用量以完全溶解反应物为准，无需特别限定其用量。
本发明高水溶性苯基乙酸酯化合物(I)的制备方法，简便易行，后处理简单，易于规模化生产。
在第三种实施方式中，本发明提供了一种羧酸酯酶检测试剂盒，所述试剂盒包含试剂储备液a、试剂储备液b、任选的羧酸酯酶标准储备溶液以及用于检测羧酸酯酶的说明书，其中，所述试剂储备液a是pH值为6～8的磷酸盐缓冲液，所述试剂储备液b为式(I)所示高水溶性苯基乙酸酯化合物的溶液。
在优选的实施方式中，所述试剂储备液a满足如下条件中的一项或多项：
所述试剂储备液a中的磷酸盐选自Na2HPO4、NaH2PO4和KH2PO4中的至少一种；
所述试剂储备液a中的磷酸盐的摩尔浓度为5mM～15mM，优选10mM～15mM；以及
所述试剂储备液a的pH值为6～8、优选7.4～8。
在本发明中，所述试剂储备液a中的磷酸盐的摩尔浓度是指Na2HPO4、NaH2PO4和/或KH2PO4中的磷酸盐的总摩尔浓度。
在优选的实施方式中，所述试剂储备液b满足如下条件中的一项或多项：
所述试剂储备液b中的式(I)所示高水溶性苯基乙酸酯化合物的浓度为0.01mM～1.5mM、优选0.01mM～1mM；以及
所述试剂盒中的所述试剂储备液a和所述试剂储备液b的体积比为(190～210)/1、优选(200～210)/1。
本发明所述的羧酸酯酶检测试剂盒的检测原理为：试剂储备液b中的高水溶性苯基乙酸酯化合物(I)作为探针，其本身的荧光强度较低，羧酸酯酶可导致化合物(I)中的高水溶性苯基乙酸酯水解、电子发生重排，最终重新释放具有强荧光团的化合物(II)，该化合物的荧光在690nm～750nm的发射波长处显著增强，在706nm的发射波长处具有最强荧光，因此可将此性质用于羧酸酯酶检测；荧光强度的变化与羧酸酯酶的浓度呈比例，通过测定相关荧光信号的变化可测定羧酸酯酶的含量。反应过程如下：
Figure BDA0002276871930000081
在第四种实施方式中，本发明提供了使用第三种实施方式所述的羧酸酯酶检测试剂盒对待测样品中的羧酸酯酶含量进行定量检测的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)绘制标准曲线
以635nm～690nm作为激发波长，测定一系列不同浓度的羧酸酯酶标准品溶液在发射波长690nm～850nm处的荧光强度，记为F；测定不含羧酸酯酶的空白对照样品在相同发射波长处的荧光强度，记为F0，荧光强度差值ΔF＝F–F0；以羧酸酯酶的浓度C为横坐标，荧光强度差值ΔF为纵坐标，绘制标准曲线；
其中，所述不同浓度的羧酸酯酶标准品溶液是由所述试剂盒中的试剂储备液a、试剂储备液b和羧酸酯酶标准储备溶液配制得到的；
(2)检测羧酸酯酶待测样品中的羧酸酯酶的浓度
将步骤(1)中的羧酸酯酶标准品溶液替换为羧酸酯酶待测样品混合溶液，按照与步骤(1)所述的相同方法检测所述待测样品混合溶液在与步骤(1)相同的发射波长处的荧光强度，记为F’，荧光强度差值记为ΔF’；将ΔF’代入步骤(1)所得标准曲线，进而得到待测样品中羧酸酯酶的浓度；
其中，所述羧酸酯酶待测样品混合溶液是由所述试剂盒中的试剂储备液a、试剂储备液b和所述羧酸酯酶待测样品配制得到的。
在本发明中，使用所述的试剂盒时，其中，所述一系列不同浓度的羧酸酯酶标准品溶液由试剂盒中的试剂储备液a、试剂储备液b和羧酸酯酶标准储备溶液配制而得，所述过羧酸酯酶标准储备溶液中，试剂储备液b添加量均相等，溶剂主要为试剂储备液a。
在优选的实施方式中，在所述步骤(1)中，在荧光强度的测定之前，使所述一系列不同浓度的羧酸酯酶标准品溶液在35～38℃、优选35～37℃下孵育15～30min、优选20～30min。
在优选的实施方式中，在所述步骤(1)中，所述一系列不同浓度的羧酸酯酶标准品溶液满足如下中的一项或多项：
体积均为2～4mL、优选2～3mL；
其中含有的羧酸酯酶浓度依次为0、0.01、0.025、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.6和1U/mL；以及
其中含有的高水溶性苯基乙酸酯化合物的浓度均为0.1～15μM、优选0.1～10μM。
利用本发明的方法检测荧光强度后，发现所测体系的羧酸酯酶浓度在0.01-0.3U/mL之间时，浓度与荧光强度之间呈线性关系，相关度R达到0.99以上，可进行定量检测。使用本发明中所述试剂盒时，激发波长可选630nm～690nm波长段。在一些实施方式中，选择激发波长635nm；在另一些实施方式中，选择激发波长670nm。
使用本发明中所述试剂盒时，在优选的实施方式中，在所述步骤(1)中，所述发射波长可选690nm～750nm波长段。在一些实施方式中，在所述步骤(1)中，选择发射波长708nm；在另一些实施方式中，在所述步骤(1)中，选择发射波长700nm。
在第五种实施方式中，本发明还提供了另一种使用第三种实施方式所述的羧酸酯酶检测试剂盒对待测样品中的羧酸酯酶进行定性检测的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)测定对照样品的荧光强度或荧光成像
以635nm～690nm作为激发波长，向对照样品中加入试剂储备液b，孵育预定时间后用试剂储备液a清洗以除去多余的试剂储备液b，获得对照样品体系；然后在发射波长为690nm～850nm处用荧光仪测定所述对照样品体系的荧光强度，或者是用激光共聚焦对所述对照样品体系进行荧光成像；
(ii)测定待测样品的荧光强度或荧光成像
将步骤(i)中的对照样品替换为待测样品，按照与步骤(i)所述的相同的方法获得待测样品体系的荧光强度或者荧光成像，并与步骤(i)测得的所述对照样品体系的荧光强度或荧光成像对比；
当所述待测样品体系的荧光强度大于所述对照样品体系的荧光强度或者所述待测样品体系的荧光成像亮度比所述对照样品体系的荧光成像强时，则说明相对于所述对照样品，所述待测样品中含有羧酸酯酶和/或羧酸酯酶的浓度更高。
在优选的实施方式中，在所述步骤(i)中，所述对照样品不含羧酸酯酶。由于对照样品不含羧酸酯酶，因此当所述待测样品体系的荧光强度大于所述对照样品体系的荧光强度或者所述待测样品体系的荧光成像亮度比所述对照样品体系的荧光成像强时，说明待测样品体系中含有羧酸酯酶。
在优选的实施方式中，在所述步骤(i)中，所述对照样品为经羧酸酯酶抑制剂处理后的样品。
在优选的实施方式中，在所述步骤(i)中，所述孵育的预定时间为15～30min、优选20～30min；优选地，所述孵育的温度为35～38℃、优选35～37℃。
在优选的实施方式中，在所述步骤(i)中，所述发射波长可选690nm～750nm波长段。在一些实施方式中，在所述步骤(i)中，选择发射波长708nm；在另一些实施方式中，在所述步骤(i)中，选择发射波长700nm。
附图说明
图1为本发明的试剂盒与一系列不同浓度的羧酸酯酶标准品溶液中的羧酸酯酶反应所获得的荧光发射光谱。
图2为在一系列不同浓度的羧酸酯酶标准品溶液中的羧酸酯酶浓度(C)与利用本发明的方法获得的对应的荧光强度差值(ΔF＝F–F0)之间建立的标准曲线。
图3为本发明的试剂盒用于与各种干扰物质反应所获得的荧光发射光谱。
图4为本发明的试剂盒检测Hela细胞中羧酸酯酶的荧光强度变化。
图5为本发明的试剂盒检测斑马鱼中羧酸酯酶荧光强度变化。
实施例
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。所属领域的技术人员将认识到：本发明所描述的化学反应可以用来合适地制备许多本发明的其他化合物，例如，根据本发明反应条件做一些常规的修改，用于制备本发明的化合物的其它方法都被认为是在本发明的范围之内。
实施例中无特殊说明，反应均在氮气氛下进行；氮气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氮气气球或钢釜；说明书中无特殊说明，室温为20℃～30℃，实施例中所描述的温度误差为±5℃。实施例中的反应进程的监测采用薄层色谱法(TLC)反应所使用的展开剂的体系有：石油醚和乙酸乙酯体系，二氯甲烷和甲醇体系，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节。柱层析一般使用青岛海洋化工200目～300目硅胶为载体。实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂如IR-783碘代物和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，或者可以采用或者按照本领域已知的方法来合成。
化合物的结构是通过核磁共振(1H-NMR、13C-NMR)来确定的。1H-NMR、13C-NMR化学位移(δ)以百万分之一(ppm)的单位给出。1H-NMR、13C-NMR的测定是用Bruker Avance III HD600核磁共振谱仪，测定溶剂为氘代甲醇(CD3OD)。用TMS(0ppm)或氯仿(7.25ppm)作为参照标准。当出现多重峰的时候，将使用下面的缩写：s(singlet，单峰)，d(doublet，双峰)，t(triplet，三重峰)，m(multiplet，多重峰)，br(broadened，宽峰)，dd(doublet ofdoublets，双二重峰)，brs(broadened singlet，宽单峰)。偶合常数，用赫兹(Hz)表示。
实施例1：式(I)高水溶性苯基乙酸酯化合物的制备
(1-1)化合物(II)的制备
Figure BDA0002276871930000121
将间苯二酚(110.0mg，1mmol)和碳酸钾(138mg，1mmol)溶解于乙腈(20mL)中，在室温及氮气保护下搅拌10分钟，然后将溶解于乙腈(1mL)中的化合物(IV)(即IR-783碘代物，374.5mg，0.5mmol)加入到体系中。将反应混合物在50℃下反应5小时，反应完毕，减压蒸除溶剂，得粗产品。用硅胶柱层析纯化粗产品，以二氯甲烷/甲醇(20：1，v/v)作洗脱剂，得到产物为蓝绿色粉末。
(1-2)化合物(I)的制备
Figure BDA0002276871930000122
将化合物(II)(375mg，0.5mmol)和碳酸钾(103.5mg，0.75mmol)溶解于乙腈(4mL)中，在室温及氮气保护下搅拌10分钟，然后将溶解于乙腈(1mL)中的化合物(III)(180mg，1.0mmol)加入到混合溶液中，将反应混合物在50℃反应3小时。反应完毕，减压蒸除溶剂，得粗产品。用硅胶柱层析提纯粗产品，二氯甲烷/甲醇＝10：1，得到产物为深蓝色固体。
化合物(I)的结构表征数据结果如下：
氢谱：1H NMR(600MHz，CD3OD)δ8.75(d，J＝14.8Hz，1H)，7.68-7.63(m，1H)，7.59(d，J＝8.0Hz，1H)，7.52(t，J＝8.5Hz，3H)，7.49-7.43(m，2H)，7.36(s，1H)，7.16(d，J＝8.5Hz，2H)，7.08(d，J＝2.1Hz，1H)，7.04(dd，J＝8.6，2.3Hz，1H)，6.56(d，J＝14.9Hz，1H)，5.27(s，2H)，4.39(t，J＝7.5Hz，2H)，2.91(t，J＝7.2Hz，2H)，2.81-2.71(m，4H)，2.28(s，3H)，2.07(d，J＝7.0Hz，2H)，2.00-1.90(m，4H)，1.82(s，6H).
碳谱：13C NMR(151MHz，CD3OD)δ169.72，162.30，161.74，154.52，150.79，145.90，142.27，141.73，134.26，133.50，129.57，128.88，128.71，128.43，127.40，126.97，122.34，121.64，116.13，114.63，113.87，112.61，103.66，101.30，69.85，50.63，50.18，44.55，28.91，28.70，27.01，26.14，23.67，22.11，20.26，19.52.
实施例2：式(I)所示荧光探针与不同浓度羧酸酯酶反应的光谱性质
先配制10mM PH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)，按照本领域常规操作方法配制磷酸盐浓度为10mM，pH为7.4的磷酸盐缓冲液，PBS配制使用NaHPO4-KH2PO4体系，因此磷酸盐浓度指的是NaHPO4和KH2PO4的总浓度，然后，所配制的溶液作为试剂储备液a。将实施例1制备得到的高水溶性苯基乙酸酯化合物(I)配制成浓度为1mM的溶液作为试剂储备液b。试剂盒中的试剂储备液a和试剂储备液b的体积比为200/1。
取试剂储备液b(1mM，20μL)溶于试剂储备液a(10mM，pH 7.4)中，再向其中加入不同体积的羧酸酯酶标准储备溶液(1mM)，用试剂储备液a定容到2mL，从而配制得到一系列不同浓度的羧酸酯酶标准品溶液。此时，一系列不同浓度的羧酸酯酶标准品溶液中含有的高水溶性苯基乙酸酯化合物(I)(即探针)的浓度均为10μM；其中含有的羧酸酯酶的浓度依次为0、0.01、0.025、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.6和1U/mL。所得的混合溶液在37℃下孵育20min，荧光仪F-4600测量其荧光激发光谱和荧光发射光谱，激发和发射的狭缝宽度为10nm。荧光发射光谱测定时以670nm为激发波长，测定一系列不同浓度的羧酸酯酶标准品溶液在发射波长690-850nm处的荧光强度，得到不同浓度的羧酸酯酶标准品溶液的发射光谱如图1所示。
将一系列不同浓度的羧酸酯酶标准品溶液的荧光强度记为F，不含羧酸酯酶的空白对照样品的荧光强度记为F0(即羧酸酯酶的浓度为0U/mL的上述羧酸酯酶标准品溶液)，荧光强度差值ΔF＝F–F0；以羧酸酯酶的浓度C为横坐标，荧光强度差值ΔF为纵坐标，绘制标准曲线(见图2)。
本实施例中的磷酸盐缓冲溶液按照本领域常规的PBS配制方法配制，试剂储备液a中的磷酸盐选自Na2HPO4、NaH2PO4和KH2PO4中的至少一种，磷酸盐的摩尔浓度可以为5mM～15mM；试剂储备液b中式(I)所示荧光探针的浓度可以为0.01mM～1mM。常用的试剂储备液a为浓度10mM，pH为7.4的PBS缓冲液，试剂储备液b为浓度1mM的溶液(溶剂为pH 7.4的PBS缓冲液)。
上述实验结果表明，本发明中的荧光探针高水溶性苯基乙酸酯化合物(I)具有以下特点：
1.如图1所示，荧光探针高水溶性苯基乙酸酯化合物(I)在溶液中荧光信号极低，背景信号较低；但随着羧酸酯酶的加入，化合物(I)与羧酸酯酶反应后则荧光强度会明显增强，在690nm～750nm的发射波长处产生强吸收，并在706nm处荧光最强，该荧光发射波段为近红外光区，背景干扰少，此探针具有较高的准确性和灵敏度。
2.荧光探针高水溶性苯基乙酸酯化合物(I)荧光产生反应速度快，20分钟内即可反应稳定。
3.如图2所示，荧光探针高水溶性苯基乙酸酯化合物(I)在羧酸酯酶浓度在大于0.01U/mL时即有荧光增强信号，荧光强度随过羧酸酯酶浓度的增加而增强，羧酸酯酶浓度在0.01-0.3U/mL之间时，浓度与荧光强度之间呈线性关系，可进行羧酸酯酶的定量检测。
实施例3：含有荧光探针(I)的试剂盒与其他离子的反应情况(选择性研究)
将试剂储备液b(1mM，20μL)溶于试剂储备液a(10mM，pH 7.4)中，再向其中分别加入各种常见干扰物质，如氯化钾、氯化钙、氯化镁、葡萄糖、过氧化氢、丝氨酸、精氨酸、半胱氨酸、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶等物种(即多个干扰组)和羧酸酯酶(作为实验对照组)，用试剂储备液a定容到2mL，从而配制得到多个干扰样品溶液和羧酸酯酶实验对照溶液。其中，多个干扰样品溶液和羧酸酯酶实验对照溶液中的荧光探针浓度均为10μM，多个干扰样品溶液中的干扰物质的浓度各自分别为氯化钾150mM、氯化钙2.5mM、氯化镁2.5mM、葡萄糖10mM、过氧化氢10μM、丝氨酸5mM、精氨酸1mM、半胱氨酸1mM、人血清白蛋白0.5mg/mL、牛血清白蛋白0.5mg/mL、乙酰胆碱酶0.1μg/L、丁酰胆碱酶20U/L，羧酸酯酶实验对照溶液中羧酸酯酶浓度为1U/mL。
将试剂储备液b(1mM，20μL)溶于2mL试剂储备液a(10mM，pH 7.4)中，从而配制得到空白对照溶液(作为空白对照组)，所述空白对照溶液中的荧光探针(即高水溶性苯基乙酸酯化合物)的浓度为10μM。
使干扰样品溶液、羧酸酯酶实验对照溶液和空白对照溶液分别在37℃下孵育20min后，使用荧光仪F-6000分别测量其在发射波长690-850nm处荧光发射光谱。荧光发射光谱测定时以670nm为激发波长；激发和发射的狭缝宽度为10nm。
实验结果如图3所示，图3为试剂盒用于与各种干扰物质反应所获得的荧光发射光谱。
实验结果表明，只有羧酸酯酶可引起荧光探针产生明显的光信号显著变化响应，证明该荧光探针对羧酸酯酶具有高度的选择性；其他常见的无机盐、氧化活性物种干扰作用不明显。
实施例4：含有荧光探针(I)的羧酸酯酶检测试剂盒检测Hela细胞中羧酸酯酶的荧光强度变化
Hela细胞于玻璃培养皿中贴壁生长；培养液为DMEM培养液，其中含10％胎牛血清、100mg/mL青霉素和100mg/mL链霉素；培养条件为37℃，5％CO2；培养时间为12～24小时。
在进行细胞内羧酸酯酶的荧光成像前，一组细胞作为空白对照，一组细胞用10μM探针溶液在37℃下孵育20min，用试剂储备液a(浓度为10mM、pH为7.4)清洗三次。其余两组Hela细胞分别用不同浓度羧酸酯酶的抑制剂4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐(AEBSF)进行预处理30min，随后用10μM探针溶液在37℃下孵育20min，用试剂储备液a(浓度为10mM、pH为7.4)清洗三次。试剂储备液b与羧酸酯酶反应后荧光反应强度大，在生物样品检测时，使用较低浓度即可达到明显的检测效果，因此，一般稀释成10μM左右的浓度使用。
用激光共聚焦显微镜TCS SP5在635nm的激发波长下在690nm～750nm的发射波长处的荧光成像。实验结果如图4所示，图4为试剂盒检测Hela细胞中羧酸酯酶的荧光强度变化。
图4中图4A为未用试剂储备液b处理过的空白对照的荧光成像，图4B为只用试剂储备液b处理后的细胞的荧光成像，图4C和图4D为羧酸酯酶抑制剂预处理，加入试剂储备液b后的荧光成像。图4E～图4H为图4A～图4D对应的明场细胞图。
由图4中的图4A和图4B对比可知：首先，Hela细胞本身的背景荧光很微弱，几乎可以忽略不计，而孵育10μM探针后则可观察到明显的荧光。接着，我们通过使用羧酸酯酶的抑制剂AEBSF对细胞进行前处理，从而展开深入研究。用羧酸酯酶抑制剂(0.5mM)前处理30min的细胞荧光较弱，而增加羧酸酯酶抑制剂浓度至1.0mM，细胞的荧光强度会进一步降低。
由于图4B、图4C和图4D的荧光成像亮度比图4A的荧光成像强，说明测试样品中含有羧酸酯酶。由于图4C和图4D中添加了羧酸酯酶抑制剂，所以图4B的荧光成像亮度比图4C和图4D的荧光成像强度强(即图4B样品中的羧酸酯酶浓度更高)，说明羧酸酯酶的荧光探针适合于成分复杂的生物样品中的羧酸酯酶的检测。
实施例5：含有荧光探针(I)的羧酸酯酶检测试剂盒检测斑马鱼中羧酸酯酶的荧光强度变化
斑马鱼培养于E3胚胎培养液中(15mM氯化钠，0.5mM氯化钾，1mM硫酸镁，1mM氯化钙，0.15mM磷酸二氢钠，0.05mM磷酸氢二钠，0.7mM碳酸氢钠，5～10％的亚甲蓝，pH 7.5)，用生长1天的斑马鱼进行荧光呈像。
在进行羧酸酯酶成像前，一组斑马鱼作为空白对照，一组斑马鱼用10μM探针溶液(在37℃下孵育20min，用试剂储备液a(浓度为10mM、pH为7.4)清洗三次。其余两组斑马鱼分别用不同浓度羧酸酯酶的抑制剂4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐(AEBSF)进行预处理20min，随后用10μM探针溶液在37℃下孵育30min，用试剂储备液a(浓度为10mM、pH为7.4)清洗三次，以洗掉多余探针。处理完成后的斑马鱼用活体成像仪进行荧光成像，激发波长为635nm，发射波长为690nm～750nm。
图5中的图5A为未用试剂储备液b处理过的空白对照的荧光成像，图5B为只用试剂储备液b处理后的细胞的荧光成像，图5C和图5D为羧酸酯酶抑制剂预处理，加入试剂储备液b后的荧光成像。图5E～图5H为图5A～图5D对应的明场斑马鱼图。
由图5中的图5A和图5B对比可知：首先，斑马鱼本身的背景荧光很微弱，几乎可以忽略不计，而孵育10μM探针后则可观察到明显的红色荧光。接着，我们通过使用羧酸酯酶的抑制剂AEBSF对细胞进行前处理，从而展开深入研究。用羧酸酯酶抑制剂(0.4mM)前处理30min的细胞荧光较弱，而增加羧酸酯酶抑制剂浓度至1.0mM，斑马鱼的荧光强度会进一步降低。
由于图5B、图5C和图5D的荧光成像亮度比图5A的荧光成像强，说明测试样品中含有羧酸酯酶。由于图5C和图5D中添加了羧酸酯酶抑制剂，所以图5B的荧光成像亮度比图5C和图5D的荧光成像强度强(即图5B样品中的羧酸酯酶浓度更高)，说明羧酸酯酶的荧光探针适合于检测活体样本中的羧酸酯酶的分布。
实施例6：含有荧光探针(I)的羧酸酯酶检测试剂盒检测番茄样品中羧酸酯酶的荧光强度变化
(1)样品溶液制备：取新鲜的番茄，洗净晾干，于搅拌机中打碎10min，再在冰浴状态下用研钵研磨至泥状。称取一定量的番茄泥，按1:2的料液比加入样品提取液(0.05mol/LPBS缓冲液)，在4℃高速离心机中以5000r/min的转速进行离心30min，取上清液作为样本溶液进行分析。
(2)通过上述前处理的方法提取获得富集羧酸酯酶的番茄样本溶液，然后在120℃下对样本溶液进行超高温加热处理，致使样本溶液中的羧酸酯酶失活，待其冷却至室温。
在高温处理过的样品溶液中加入20μL 1mM高水溶性苯基乙酸酯化合物(I)，再向其中加入不同体积的羧酸酯酶标准品液(1mM)，用试剂储备液a定容到2mL，使其中的羧酸酯酶浓度分别为0、0.01、0.025、0.05、0.1、0.15、0.2和0.3U/mL，将各浓度样品分别制备样品五份作为样品溶液。
所得的样品溶液在37℃下孵育20min，荧光仪F-4600测量其荧光激发光谱和荧光发射光谱，激发和发射的狭缝宽度为10nm，荧光发射光谱荧光强度测定时以670nm为激发波长，以690-850nm为发射波长。结果见表1。可以看出，番茄样品中羧酸酯酶的添加回收率在90～103％之间。
表1番茄样品中羧酸酯酶添加回收实验
Figure BDA0002276871930000181
以上实施例4、实施例5和实施例6很好的验证了，应用含有本发明式(I)所示的高水溶性苯基乙酸酯化合物的试剂盒可以通过对比荧光强度或荧光成像的方式，直观地判断待测生物样品是否含有羧酸酯酶，从而完成羧酸酯酶定性或定量检测，不仅适用于普通生物样本(细胞)，对于复杂生物活体样本和植物样本同样适用，并且在检测羧酸酯酶方面，本发明所提供的试剂盒反应迅速，灵敏程度高，操作简单，适于广泛应用。
综上所述，本发明的羧酸酯酶试剂盒是一种性能优良、使用方便的羧酸酯酶检测设备，在医药、活体生物成像等领域中有着巨大的应用前景。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种式(I)所示的高水溶性苯基乙酸酯化合物，
Figure FDA0002276871920000011
2.式(I)所示的高水溶性苯基乙酸酯化合物的制备方法，所述方法包括如下步骤：
步骤(A)：在碱存在的条件下，式(IV)所示的化合物与式(V)所示的化合物经取代分解重排反应，得到式(II)所示的化合物；
Figure FDA0002276871920000012
步骤(B)：在碱存在的条件下，式(II)所示的化合物与式(III)所示的化合物发生亲核取代反应，得到式(I)所示高水溶性苯基乙酸酯化合物，
Figure FDA0002276871920000013
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(A)和步骤(B)中，所述碱为有机碱或无机碱；
优选地，所述有机碱选自三乙胺、二异丙基乙基胺和吡啶中的至少一种；
优选地，所述无机碱选自碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠和碳酸氢钠中的至少一种。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(A)满足如下条件中的一项或多项：
所述式(IV)所示的化合物、式(V)所示的化合物和碱的投料摩尔比为1:(1～5):(0.5～5)、优选1:(2～2.5):(2～2.5)；
反应在惰性气体、优选氮气或氩气中进行；
反应时间为1小时～24小时、优选5小时～24小时；
反应温度为30℃～60℃、优选40℃～50℃；以及
反应溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和乙腈中的至少一种。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(B)满足如下条件中的一项或多项：
所述式(II)所示的化合物、式(III)所示的化合物和碱的投料摩尔比为1:(1～2):(1.5～2)、优选1:(1.5～2):(1.5～2)；
反应在惰性气体、优选氮气或氩气中进行；
反应时间为2小时～4小时、优选3小时～4小时；
反应温度为20℃～60℃、优选40℃～50℃；以及
反应溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺和乙腈中的至少一种。
6.一种羧酸酯酶检测试剂盒，所述试剂盒包含试剂储备液a、试剂储备液b、任选的羧酸酯酶标准储备溶液以及用于检测羧酸酯酶的说明书，其中，所述试剂储备液a是pH值为6～8的磷酸盐缓冲液，所述试剂储备液b为权利要求1所述的式(I)所示的高水溶性苯基乙酸酯化合物的溶液。
7.根据权利要求6所述的羧酸酯酶检测试剂盒，其特征在于，所述试剂储备液a满足如下条件中的一项或多项：
所述试剂储备液a中的磷酸盐选自Na2HPO4、NaH2PO4和KH2PO4中的至少一种；
所述试剂储备液a中的磷酸盐的摩尔浓度为5mM～15mM、优选10mM～15mM；以及
所述试剂储备液a的pH值为6～8、优选7.4～8。
8.根据权利要求6或7所述的羧酸酯酶检测试剂盒，其特征在于，所述试剂储备液b满足如下条件中的一项或多项：
所述试剂储备液b中的式(I)所示高水溶性苯基乙酸酯化合物的浓度为0.01mM～1.5mM、优选0.01mM～1mM；以及
所述试剂盒中的所述试剂储备液a和所述试剂储备液b的体积比为(190～210)/1、优选(200～210)/1。
9.使用权利要求6-8中任一项所述的羧酸酯酶检测试剂盒对待测样品中的羧酸酯酶含量进行定量检测的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)绘制标准曲线
以635nm～690nm作为激发波长，测定一系列不同浓度的羧酸酯酶标准品溶液在发射波长690nm～850nm处的荧光强度，记为F；测定不含羧酸酯酶的空白对照样品在相同发射波长处的荧光强度，记为F0，荧光强度差值ΔF＝F–F0；以羧酸酯酶的浓度C为横坐标，荧光强度差值ΔF为纵坐标，绘制标准曲线；
其中，所述不同浓度的羧酸酯酶标准品溶液是由所述试剂盒中的试剂储备液a、试剂储备液b和羧酸酯酶标准储备溶液配制得到的；
(2)检测羧酸酯酶待测样品中的羧酸酯酶的浓度
将步骤(1)中的羧酸酯酶标准品溶液替换为羧酸酯酶待测样品混合溶液，按照与步骤(1)所述的相同方法检测所述待测样品混合溶液在与步骤(1)相同的发射波长处的荧光强度，记为F’，荧光强度差值记为ΔF’；将ΔF’代入步骤(1)所得标准曲线，进而得到待测样品中羧酸酯酶的浓度；
其中，所述羧酸酯酶待测样品混合溶液是由所述试剂盒中的试剂储备液a、试剂储备液b和所述羧酸酯酶待测样品配制得到的。
10.使用权利要求6-8中任一项所述的羧酸酯酶检测试剂盒对待测样品中的羧酸酯酶进行定性检测的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)测定对照样品的荧光强度或荧光成像
以635nm～690nm作为激发波长，向对照样品中加入试剂储备液b，孵育预定时间后用试剂储备液a清洗以除去多余的试剂储备液b，获得对照样品体系；然后在发射波长为690nm～850nm处用荧光仪测定所述对照样品体系的荧光强度，或者是用激光共聚焦对所述对照样品体系进行荧光成像；
(ii)测定待测样品的荧光强度或荧光成像
将步骤(i)中的对照样品替换为待测样品，按照与步骤(i)所述的相同的方法获得待测样品体系的荧光强度或者荧光成像，并与步骤(i)测得的所述对照样品体系的荧光强度或荧光成像对比；
当所述待测样品体系的荧光强度大于所述对照样品体系的荧光强度或者所述待测样品体系的荧光成像亮度比所述对照样品体系的荧光成像强时，则说明相对于所述对照样品，所述待测样品中含有羧酸酯酶和/或羧酸酯酶的浓度更高。
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