CN109776564A - 一种氧杂蒽结构的亚铁离子荧光探针及其合成方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测活细胞内亚铁离子的荧光探针，该荧光探针为氧杂蒽衍生物，其化学结构式为。本发明的荧光探针可经化学合成获得，合成工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低，且具有高特异性，可快速检测活细胞内亚铁离子，检测过程基本不会受其他组分的干扰，具有广阔的应用前景。

Description

一种氧杂蒽结构的亚铁离子荧光探针及其合成方法和应用

技术领域

本发明属于有机小分子荧光探针领域，具体涉及一种基于氧杂蒽结构的检测细胞内亚铁离子荧光探针及其合成方法。

背景技术

铁是生物体所必须的微量元素之一，以多种形式在体内保持着动态平衡，是几乎所有生物细胞正常生长所必需的金属元素。铁在人体内有两种形式，一类为功能性铁，主要以血红蛋白的形式存在于循环的红细胞内；另一类为储存铁，以铁蛋白和含铁血黄素形式存在于肝脏、网状内皮细胞和骨髓内。这些铁可以参与血红蛋白，细胞色素及各种酶的合成。很多含铁酶控制着重要的氧化、水解和转化过程，因此与组织吸收、氧化磷酸化、淋巴细胞与粒细胞功能、躯体与神经组织的发育有关。铁是血红蛋白、肌红蛋白和细胞色素的组成部分，可以维持人体的新陈代谢，它直接参与氧的运输与储存。血红蛋白中的铁呈亚铁离子状态时，可与氧发生可逆反应结合（生成氧合血红蛋白），具有载氧能力。氧化为三价铁离子后，血红蛋白就失去了载氧能力，需要通过还原剂药物调。此外，铁在神经系统中也起着非常重要的作用，它不正常的代谢与神经系统的疾病紧密相关。因此，检测生物体系内的铁离子具有非常重要的意义。

荧光成像分析法具有灵敏度高、选择性好、响应迅速、操作简单等优点，并且对生物样品基本没有损伤，已广泛用于各种生物体内的小分子和各种离子的检测。因此开发新的具有高选择性、高灵敏度、光稳定性及透膜性好，能够实时快速检测细胞内亚铁离子的荧光探针具有重要的意义。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种新型检测活细胞内亚铁离子的荧光探针。

本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针的合成方法，原料易得、合成步骤简单、收率高。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种检测细胞内亚铁离子的荧光探针，结构式如式（I）所示：

式（I）。

一种上述荧光探针的合成方法，包括以下步骤：

（1）将醋酸酐的二氯甲烷溶液滴加至化合物1与三乙胺的二氯甲烷溶液中反应，分离提纯得化合物2：

；

（2）化合物2、间氯过氧苯甲酸、NaHCO₃于乙酸乙酯中，室温反应，分离纯化得化合物Racy：

。

步骤（1）中，所述化合物1与醋酸酐的物质的量比为8:1。

步骤（1）中，所述反应时间为12h。

步骤（1）中，所述分离提纯步骤为将反应液去除溶剂后进行柱层析，洗脱液为二氯甲烷:甲醇（V/V）=30:1。

步骤（2）中，所述化合物2、间氯过氧苯甲酸，NaHCO₃的摩尔比为1:1.50:1.52。

步骤（2）中，所述反应时间为2h。

步骤（2）中，所述分离纯化步骤为将反应液进行柱层析，洗脱液为二氯甲烷:甲醇（V/V）=10:1。

一种上述荧光探针在检测细胞内亚铁离子的应用。

所述应用中，检测条件为激发波长580 nm，在590-800 nm之间进行荧光发射光谱的检测。

本发明的作用机理：

本发明所述的荧光探针可应用于细胞内亚铁离子的检测评价。该探针作为亚铁离子的特异性探针，在亚铁离子存在的环境下，可以将N-氧化合物还原为羟基，并通过细胞内酯酶的水解生成具有高荧光发射能力的荧光物质，此时荧光探针可以发射氧杂蒽衍生物染料的绿荧光（峰值约为630 nm）。检测条件为激发波长为580 nm，在590-800 nm之间进行荧光发射光谱的检测。通过检测响应前和响应后的荧光强度来测定亚铁离子浓度。

本发明的有益效果：

本发明所述的检测内质网亚铁离子的荧光探针可经化学合成获得，合成工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低，易于推广；且具有高特异性，在进行相应亚铁离子检测过程中基本不受其他组分的干扰；灵敏度高，具有良好的荧光发射光谱特性。因此，可以实现对细胞中的亚铁离子快速准确检测的目的。

附图说明

图1是荧光探针的¹H NMR图谱；

图2是荧光探针在0.5U/mL酯酶和不同浓度亚铁离子的荧光光谱；

图3是荧光探针荧光强度与亚铁离子浓度的相关性；

图4是荧光探针在0.5U/mL酯酶条件下和不同物质反应后的荧光光谱；

图5是荧光探针在活细胞中的成像应用。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 荧光探针的制备

1、化合物1（130mg，0.296mmol），三乙胺（200mg，1.98mmol）溶于25ml 二氯甲烷中并室温搅拌溶解，将醋酸酐（240mg，2.35mmol）溶于5mL二氯甲烷并逐滴滴加至反应液中，然后室温搅拌12小时，后除去溶剂并以二氯甲烷:甲醇（V/V）=30:1为洗脱剂分离提纯得到化合物2（121.5mg，85.6%）：

。

2、化合物2（112mg，0.235mmol），间氯过氧苯甲酸（61mg，0.353mmol），NaHCO₃（30mg，0.357mmol）溶于25mL乙酸乙酯中，在25℃恒温搅拌2小时，反应完成后，以二氯甲烷:甲醇（V/V）=10:1为洗脱液，进行柱层析，分离得到化合物RAcy（85.6mg，73.5%）。¹H NMR图谱见图1：

。

实施例2 荧光探针在不同亚铁离子浓度下的荧光光谱

采用亚铁离子在水溶液中供应亚铁离子。预先准备12份5mL的5 μM实施例1所得荧光探针的Hepes缓冲溶液（含5%甲醇，pH=7.4），并向配制好的探针溶液中加入酶活为10U/mL的酯酶10μL，并将其置于37℃水浴恒温30min，后别加入的亚铁离子浓度为0、20、40、60、70、90、120、130、160、180、190、220、250、300 μM。然后进行荧光检测（λ_Ex=580 nm）；计算各体系中荧光强度；通过分析630 nm处的荧光强度（I₆₃₀）与亚铁离子浓度的关系，评估该探针对亚铁离子的响应性能，如图2和图3。图2和图3可知，随着亚铁离子浓度的增大，溶液的荧光强度（I₆₃₀）逐渐增强。

实施例3 荧光探针与不同物质反应后的荧光光谱

预先准备11份5mL的5 μM实施例1所得荧光探针Hepes缓冲溶液(含5%甲醇，pH = 7.4)，并向配制好的探针溶液中加入酶活为10U/mL的酯酶10μL，并将其置于37℃水浴恒温30min，然后分别向该体系中依次加入50 μL浓度为200 μM的Hcys、Na₂S、Na₂SO₃、NO、H₂O₂、HClO₄、Cys、GSH、NaNO₂、VC和亚铁离子的Hepes溶液。然后进行荧光检测（λ_Ex=580 nm），计算各体系中荧光强度（I₆₃₀），如图4所示，由图4可知，当然荧光探针溶液中加入Hcys、Na₂S、Na₂SO₃、NO、H₂O₂、HClO₄、GSH、NaNO₂、VC和亚铁离子时，只有亚铁离子可以导致溶液产生显著的荧光变化，而加入其他小分子时溶液的荧光基本没有变化，这表示该探针只对亚铁离子有响应，基本不受其他小分子的干扰。

实施例4 荧光探针在活细胞中的成像应用

将HepG2细胞放在培养基（DMEM培养液和10%胎牛血清）中，置于37℃、5% CO₂和20% O₂的培养箱中培养24h。用微量进样器吸取10μL实施例1所得荧光探针（浓度为10 μM）注入含有HepG2细胞的培养基中，继续在培养箱中培养30 min。之后用PBS溶液（pH=7.4）冲洗培养细胞3次，进行荧光成像。然后再加入100 μM亚铁离子，进行荧光成像，结果见图5。由图5可以看出，只加入荧光探针时，细胞基本无荧光；加入100 μM亚铁离子之后，细胞的红色荧光增强，这表示该探针可用于检测细胞中的亚铁离子。

Claims (7)

1.一种检测细胞内亚铁离子的荧光探针，其结构式如式（I）所示：

式（I）。

2.一种如权利要求1所述的荧光探针的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将醋酸酐的二氯甲烷溶液滴加至化合物1与三乙胺的二氯甲烷溶液中反应，分离提纯得化合物2

；

（2）化合物2、间氯过氧苯甲酸、NaHCO₃于乙酸乙酯中，室温反应，分离纯化得荧光探针：

。

3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述化合物1与醋酸酐的物质的量比为8:1；步骤（2）中，所述化合物2、间氯过氧苯甲酸、NaHCO₃的摩尔比为1:1.50:1.52。

4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）中，所述反应时间为12h；步骤（2）中，所述反应时间为2h。

5.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）中，所述分离提纯步骤为将反应液去除溶剂后进行柱层析，洗脱液为二氯甲烷:甲醇（V/V）=30:1；步骤（2）中，所述分离纯化步骤为将反应液进行柱层析，洗脱液为二氯甲烷:甲醇（V/V）=10:1。

6.一种如权利要求1所述的荧光探针在检测细胞内亚铁离子的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用中检测条件为激发波长580 nm，在590-800 nm之间进行荧光发射光谱的检测。