CN110590801A - 谷氨酰胺酶小分子荧光探针及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了具有通式(I)谷氨酰胺酶小分子荧光探针及其制备方法和用途。该类探针的结构模块包括：谷氨酰胺酶结合基团、连接链和荧光报告基团。本发明的谷氨酰胺酶小分子荧光探针可用于谷氨酰胺酶抑制剂的高通量筛选，指导谷氨酰胺酶抑制剂的发现及结构优化。以此类结构的探针作为工具分子，可以快速、准确地确证小分子化合物与靶标蛋白的结合情况。

Description

谷氨酰胺酶小分子荧光探针及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及荧光探针及其制备方法和用途，特别涉及谷氨酰胺酶小分子荧光探针及其制备方法和用途。
背景技术
癌细胞的代谢与正常细胞的代谢有显著的差别。在正常细胞中，葡萄糖主要都被转化为丙酮酸，进入线粒体的TCA循环产生能量。但是，肿瘤细胞由于Warburg效应，将大部分的葡萄糖转变为乳酸排出细胞，不能用于TCA循环。作为补偿，肿瘤细胞将谷氨酰胺酶(glutaminase，GLS1)的水平升高，这样肿瘤细胞能够将谷氨酰胺作为能源，通过GLS以及谷氨酸脱氢酶的催化，进入TCA产生能量。因此靶向抑制GLS1可选择性的抑制肿瘤生长而不抑制正常细胞的生长，是治疗癌症的有效策略。近几年来，科学家们一直致力于开发一种可以治疗癌症的GLS1小分子抑制剂。到目前为止，只有唯一的一个小分子GLS1抑制剂CB839，处于临床II期研究中。体外抑制活性测试方法以及高通量筛选方法对GLS1小分子抑制剂的发展至关重要。准确、稳定、可靠的活性测试方法有助于发现结构新颖的先导化合物，指导先导化合物的结构优化以及获得活性更优的候选药物分子，为靶向GLS1的肿瘤疾病的治疗药物的开发奠定基础。
目前已有的GLS1活性测定方法主要包含两大类，第一大类是基于GLS1酶催化活性的测试方法，有以下几种：
(1)Nessler试剂检测法
该检测方法的原理是，谷氨酰胺酶将谷氨酰胺催化为谷氨酸的同时伴随铵离子的产生，后者可以与Nessler试剂反应生成橙色的络合物，该络合物的色度与铵氮的含量成正比，可在450nm波长检测其吸光度以定量反应谷氨酰胺酶的活性。
(2)两步谷氨酰胺酶测定法
谷氨酰胺酶可以催化谷氨酰胺水解成谷氨酸，谷氨酸可以通过谷氨酸脱氢酶的氧化脱氨作用进一步转化为α-KG和NADH/NADPH。在该过程中，使用肼与α-KG反应形成酰肼以完全氧化谷氨酸。通过测量NADH/NADPH在340nm处的吸光度可以定量地反映谷氨酰胺酶的活性。该方法的缺点是使用了相对较短和非特定的吸收波长，许多其它有机化合物在这个波长下也会有吸收。
(3)谷氨酸氧化酶偶联测定法
该方法也采用谷氨酰胺可水解成谷氨酸的原理。首先谷氨酰胺被水解成谷氨酸和氨。然后通过谷氨酸氧化酶的氧化，谷氨酸转化为α-KG、氨和过氧化氢(H2O2)。最后，在辣根过氧化物酶(HRP)存在下，H2O2与Amplex Red试剂(10-乙酰基-3，7-二羟基吩恶嗪)以1∶1的化学计量反应，产生高荧光产物试卤灵。基于试卤灵的荧光强度(在530-560nm激发，在590nm处检测发射)，可以定量测量各种化合物对谷氨酰胺酶的抑制活性。这种方法的优点是大多数生物样品的自发荧光对试卤灵的发射荧光几乎没有干扰。但是能与H2O2发生反应的抑制剂将会产生假阳性的结果，如用该方法测定依布硒啉对GLS1的抑制活性，IC50约为9nM，从而认为依布硒啉是有效的GLS1抑制剂。但有研究证明，依布硒啉不抑制谷氨酰胺酶，而是与反应中生成的H2O2发生反应，造成了实验数据的假阳性。
(4)放射性标记的谷氨酰胺测定
除了确定水解产物的方法外，放射性标记的谷氨酰胺测定方法还可以直接测定酶活性。该方法使用放射性标记的谷氨酰胺，[3H]-谷氨酰胺作为底物来测定谷氨酰胺酶抑制剂的活性。在将[3H]-谷氨酰胺、抑制剂和谷氨酰胺酶一起孵育后，通过填充有强阴离子交换树脂的96孔旋转柱分离底物和反应产物。用咪唑缓冲液洗涤未反应的[3H]-谷氨酰胺。然后用HCl洗脱反应产物[3H]-谷氨酸，并分析放射性，以反映抑制剂对谷氨酰胺酶的抑制活性。
比较这几种方法，使用通过偶联谷氨酸脱氢酶介导的NADH产生来定量谷氨酸的原理的两步或三步谷氨酰胺酶测定方法是测量GLS1抑制活性最常用的方法。与其他的几种方法相比，根据对测定的干扰因素，放射性测定法具有产生较少假阳性的优点。
第二大类是基于GLS1酶亲和力的测试方法。目前主要包括以下几种：
(1)基于生物薄膜干涉(BLI)的测定
平衡解离常数Kd是反映结合强度的最直接的参数。因此，可以确定Kd并精确测量直接结合的测定法可用于评价GLS1抑制剂。BLI是结合动力学测定方法的常用技术，可以实时监测结合和解离过程，并获得结合速率常数Kon和解离速率常数Koff。Zhu等人使用BLI作为严格表征的检测方法，开发了用于KGA直接动力学结合测定的方法。使用具有超级链霉亲和素(SSA)生物传感器的ForteBio K2仪器对与生物素化的GLS1蛋白结合的化合物进行生物分子相互作用的分析。人KGA显示出与其底物Gln(Kd 4μM)和变构抑制剂BPTES(Kd 0.2μM)剂量依赖性的直接结合。在基于BLI的测定中，如果Kd＜100nM，则小分子将被鉴定为有效且强的结合剂。
(2)基于微尺度热泳(MST)的测定
MST法是检测GLS1和抑制剂的结合亲和力的另一种技术。该方法是通过检测热泳过程中荧光的变化来确定蛋白质-蛋白质的相互作用或蛋白质-小分子相互作用之间的结合亲和力。Chen等使用标记的蛋白来测试抑制剂和纯化的GLS1的结合能力。
(3)基于荧光共振能量转移(FRET)的测定方法。
对于变构抑制剂，还建立了基于荧光共振能量转移(FRET)的测定方法。FRET是一种从最初吸收能量的供体分子到随后转移能量的受体分子之间的无辐射传输。这种能量转移的效率与供体和受体之间距离的六次方成反比。该特征使得FRET方法对距离的微小变化敏感，这可以适应于检测GLS1从二聚体到四聚体转变的距离。
Cerione等开发了一种FRET分析方法，以实时监测变构抑制剂对GAC四聚体形成的影响。向FRET标记的GAC中加入变构抑制剂，增加了的FRET读数，表明在抑制剂结合后四聚体的快速形成。
如今，运用小分子荧光探针作为辅助工具，多种小分子与生物大分子的作用模式被确定，这些信息对合理药物设计具有十分重要的意义。比如新的药物靶点的发现，或者对一个已知蛋白的功能做新的阐述，这对于分子水平阐明疾病的发生、发展和治疗尤其重要。以小分子荧光探针作为辅助工具，这些靶点可被发展为高效的高通量筛选模型，并在短时间内随机筛选大量的活性化合物，发现活性更高的小分子化合物作为先导物用于进一步的药物研发。
发明内容
发明目的：本发明目的是提供一种谷氨酰胺酶小分子荧光探针。
本发明的另一目的是提供所述谷氨酰胺酶小分子荧光探针的制备方法。
本发明的最后一目的是提供所述谷氨酰胺酶小分子荧光探针在测定化合物对谷氨酰胺酶的抑制活性中的用途。
技术方案：本发明提供一种谷氨酰胺酶小分子荧光探针，包括谷氨酰胺酶抑制剂A、连接链L2和荧光报告基团B，
其中，
L1为：CH2SCH2、CH2CH2、CH2CH2CH2、CH2、CH2S、SCH2、CH2NHCH2、CH＝CH；
X1和X2分别为：S、O或CH＝CH，其中，CH中的任何一个氢都可以被烷基取代；
R1和R2分别独立地代表：H、烷基、烷氧基、羟基；
R3为烷烃、取代的烷烃、芳香烃、芳香烷烃、氰基、环烷烃、环芳香烷烃、氢、卤素、卤素取代的烷烃、杂原子芳香烃、杂原子芳香烷烃或杂原子环烷烃；
L2为4～10个原子长度的连接链，该连接链含有碳、氮或氧原子；
B为荧光报告基团。
进一步地，所述荧光报告基团为异硫氰酸荧光素FITC或7-硝基-2，1，3-苯并氧杂噁二唑NBD，
进一步地，所述L2为如下结构式中任意一种：
进一步地，所述L1代表CH2CH2。
进一步地，所述X1为S，X2为CH＝CH。
进一步地，所述的具有通式(I)的谷氨酰胺酶小分子荧光探针，为如下任一种：
N1-(2-(3-(3′，6′-二羟基-3-氧代-3H-螺[异苯并呋喃-1，9′-呫吨]-6-基硫脲基乙基)-N5-(6-(4-(5-(2-(吡啶-2-基)乙酰氨基)-1，3，4-噻二唑-2-基)丁基)哒嗪-3-基)戊二酰胺、
N1-(2-((7-硝基苯并[1，2，5]恶二唑-4-基)氨基)乙基)-N5-(6-(4-(5-(2-(吡啶-2-基基)乙酰氨基)-1，3，4-噻二唑-2-基)丁基(哒嗪-3-基)戊二酰胺、
N1-(2-(3-(3′，6′-二羟基-3-氧代-3H-螺[异苯并呋喃-1，9′-呫吨]-6-基)硫脲基)乙基)-N5-(5-(4-(5-(2-苯基乙酰氨基)-1，3，4-噻二唑-2-基)丁基)-1，3，4-噻二唑-2-基)戊二酰胺、
N1-(2-((7-硝基苯并[1，2，5]恶二唑-4-基)氨基)乙基)-N5-(5-(4-(5-(2-苯基乙酰氨基)-1，1，3，4-噻二唑-2-基)丁基)-1，3，4-噻二唑-2-基)戊二酰胺、
N1-(2-(3-(3′，6′-二羟基-3-氧代-3H-螺[异苯并呋喃-1，9′-呫吨]-6-基)硫脲基)乙基)-N5-(6-(4-((5-(2-(吡啶-2-基)乙酰氨基)-1，3，4-噻二唑-2-基)氨基)哌啶-1-基)哒嗪-3-基)戊二酰胺、
N1-(2-((7-硝基苯并[1，2，5]恶二唑-4-基)氨基)乙基)-N5-(6-(4-((5-(2-(吡啶-2-基)乙酰氨基)-1，3，4-噻二唑-2-基)氨基)哌啶-1-基)哒嗪-3-基)戊二酰胺。
所述的具有通式(I)的谷氨酰胺酶小分子荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
化合物II先与戊二酸III发生缩合反应，生成中间体IV，反应温度优选30-50℃，反应时间优选10-12h，反应溶剂为DMF、氯仿或DMSO；中间体IV和单Boc-乙二胺缩合生成中间体V，反应温度为25-50℃，反应时间为8-12h，反应溶剂为DMF、DMSO、甲醇或四氢呋喃；中间体V在酸性条件下水解，脱去Boc保护基生成中间体VI，反应温度为25-60℃，反应时间为8-15h，反应溶剂为二氯甲烷、甲醇或四氢呋喃；中间体IV、VI分别和NBD、FITC反应，生成通式(I)的谷氨酰胺酶小分子荧光探针。
反应温度为50-100℃，反应时间优选8-15h，反应溶剂优选DMF、二氯甲烷、甲醇或四氢呋喃。
所述的具有通式(I)的谷氨酰胺酶小分子荧光探针在测定化合物对谷氨酰胺酶的抑制活性中的用途。
进一步地，所述谷氨酰胺酶抑制活性测定方法为将待测化合物、具有通式(I)的谷氨酰胺酶小分子荧光探针和谷氨酰胺酶在缓冲体系中共孵育，在偏振光激发波长为485nm条件下，采用荧光偏振酶标仪记录发射波长为535nm条件下的偏振光信号值，计算即得。
有益效果：为了突破目前GLS1酶抑制活性测试方法的局限性，本发明采用目前正处于临床研究的CB839作为GLS1的结合片段，通过进一步引入荧光基团，得到一类基于GLS1抑制剂设计的小分子荧光探针，基于本发明小分子荧光探针建立的活性测定方法，测试体系简单，快捷，受时间、溶剂影响小，可用于GLS1抑制剂的高通量筛选，同时可指导谷氨酰胺酶抑制剂的发现及结构优化，适应于指导发现治疗与谷氨酰胺酶密切相关的肿瘤疾病的小分子药物。
附图说明
图1为Probe 1(25nM)和不同浓度的GLS1蛋白结合曲线；实验用的缓冲液为：10mMTris pH＝8.5and 150mM NaCl；
图2为CB839、BPTES对GLS1的荧光偏振抑制试验；
图3为荧光探针probe 1与GLS1蛋白结合时，DMSO对于荧光偏振实验的影响；
图4为荧光探针probe 1与GLS1蛋白结合，荧光偏振实验稳定性Z’因子的考察。
具体实施方式
实施例1
荧光探针Probe 1的制备
5-(丁-3-炔-1-基)-1，3，4-噻二唑-2-胺(4)
向化合物3(1.5g，0.015mol)的三氯氧磷溶液中加入氨基硫脲(1.39g，0.015mol)，反应混合物在80℃的情况下回流反应4小时，待冷却到室温，反应混合物加入到30ml冰水中，用氢氧化钠调PH至9，水层用乙酸乙酯(15ml＊3)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，得到黄褐色粉末1.88g，收率80.2％。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ6.99(s，2H)，2.95(t，J＝7.0Hz，2H)，2.83(d，J＝2.4Hz，1H)，2.50(dd，J＝7.1，4.6Hz，2H).HRMS(ESI)：m/z，calcd forC6H7N3S[M+H]+，154.0433；found：154.0434。
N-(5-(丁-3-炔-1-基)-1，3，4-噻二唑-2-基)-2-(吡啶-2-基)乙酰胺(5)
向化合物4(3g，0.02mol)的N，N-二甲基甲酰胺溶液中加入2-吡啶乙酸盐酸盐(3.74g，0.022mol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(8.8g，0.039mol)，室温搅拌30分钟，加入N，N-二异丙基乙胺(7.5g，0.059mol)。反应混合物室温反应2小时，向混合物中加入大量水，水层用乙酸乙酯(30ml＊3)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，得到固体4.94g，收率92.6％。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ12.71(s，1H)，8.50(d，J＝4.8Hz，1H)，7.78(td，J＝7.7，1.7Hz，1H)，7.40(d，J＝7.7Hz，1H)，7.29(dd，J＝6.7，5.0Hz，1H)，4.02(s，2H)，3.16(t，J＝7.0Hz，2H)，2.88(t，J＝2.6Hz，1H)，2.62(td，J＝7.0，2.6Hz，2H).HRMS(ESI)：m/z，calcd for C13H12N4OS[M+H]+，273.0805；found：273.0807。
N-(5-(4-(6-氨基哒-3-基)丁-3-炔-1-基)-1，3，4-噻二唑-2-基)-2-(吡啶-2-基)乙酰胺(6)
向化合物5(2g，7.4mmol)的N，N-二甲基乙酰胺溶液中加入3-氨基-6-碘哒嗪(1.35g，6.11mmol)，碘化亚铜(0.117g，0.613mmol)和三乙胺(3.1g，30.65mmol)，反应混合物在氮气的保护下室温搅拌20min，然后加入四(三苯基磷)钯(0.708g，0.613mmol)，反应混合物在60℃氮气下搅拌3.5小时，混合物冷却到室温，加入异丙醚(30ml)分离得到红褐色油状物，向其中加入水(10ml)，析出灰色固体，柱层析得到灰色固体1.84g，收率68.5％。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)：δ12.69(s，1H)，8.49(d，J＝4.0Hz，1H)，7.76(t，J＝7.1Hz，1H)，7.39(d，J＝7.8Hz，1H)，7.33-7.17(m，2H)，6.69(d，J＝9.1Hz，1H)，6.63(s，2H)，4.01(s，2H)，3.31-3.23(m，2H)，2.90(t，J＝6.8Hz，2H).HRMS(ESI)：m/z，calcd for C17H15N7OS[M+H]+，366.1132；found：366.1135。
N-(5-(4-(6-氨基哒-3-基)丁基)-1，3，4-噻二唑-2-基)-2-(吡啶-2-基)乙酰胺(7)
向化合物6(1g，2.74mmol)的甲醇溶液中加入雷尼镍(2ml)，反应混合物在氢气条件下室温反应12小时，抽滤得到澄清液体，浓缩得到黄色固体0.98g，收率97％。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ12.67(s，1H)，8.50(d，J＝4.9Hz，1H)，7.77(td，J＝7.7，1.8Hz，1H)，7.40(d，J＝7.8Hz，1H)，7.29(dd，J＝6.9，5.3Hz，1H)，7.19(d，J＝9.0Hz，1H)，6.76(d，J＝9.1Hz，1H)，6.28(s，2H)，4.01(s，2H)，3.00(t，J＝6.9Hz，2H)，2.70(t，J＝6.9Hz，2H)，1.70(s，4H).HRMS(ESI)：m/z，calcd for C17H19N7OS[M+H]+，370.1445；found：370.1451.
5-氧代-5-((6-(4-(5-(2-(吡啶-2-基)乙酰氨基)-1，3，4-噻二唑-2-基)丁基)哒嗪-3-基)氨基)戊酸(8)
向化合物7的N，N-二甲基甲酰胺溶液中加入化合物戊二酸(0.27g，2.01mmol)和4-(4，6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(0.562g，2.03mmol)，反应混合物在45℃下反应12h，待冷却到室温，将混合物加入到30ml水中，水层用DCM(15ml＊3)萃取，饱和食盐水(10ml＊3)冲洗，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，得到黄色固体，经柱层析得到产物294.5mg，收率45％。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ10.99(s，1H)，8.58(s，1H)，8.24(d，J＝8.9Hz，1H)，7.92(d，J＝8.1Hz，1H)，7.55(dd，J＝15.2，8.5Hz，2H)，7.43(s，1H)，4.09(s，2H)，3.02(s，2H)，2.89(s，2H)，2.45(d，J＝6.4Hz，2H)，2.26(d，J＝7.0Hz，2H)，1.85-1.70(m，6H).HRMS(ESI)：m/z，calcd for C22H25N7O4S[M+H]+，484.1761；found：484.1761。
叔丁基(2-(5-氧代-5-((6-(4-(5-(2-(吡啶-2-基)乙酰氨基)-1，3，4-噻二唑-2-基)丁基)哒嗪-3-基)氨基)戊酰胺)乙基)氨基甲酸叔丁酯(9)
向化合物8(0.42g，0.869mmol)的N，N-二甲基甲酰胺溶液中加入单boc乙二胺(0.168g，1.05mmol)和(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(0.672mg，1.77mmol)，室温搅拌30min，加入N，N-二异丙基乙胺(0.56g，4.36mmol)。反应混合物室温反应2小时，反应混合物在DCM∶MEOH＝10∶1(15ml)和水(30ml)之间进行分配。水层用DCM∶MEOH＝10∶1(10ml＊3)萃取，有机层用饱和食盐水冲洗(10ml＊3)，硫酸钠干燥，过滤浓缩。采用柱层析法对产物进行分离纯化，得到淡黄色固体375mg，收率69％。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ10.99(s，1H)，8.64(d，J＝4.3Hz，1H)，8.25(d，J＝9.1Hz，1H)，8.04(d，J＝8.0Hz，1H)，7.81(s，1H)，7.67-7.49(m，3H)，6.76(s，1H)，4.15(s，2H)，3.10-2.83(m，8H)，2.41(s，2H)，2.14-2.03(m，2H)，1.85-1.68(m，6H)，1.35(s，9H).HRMS(ESI)：m/z，calcdfor C29H29N9O5S[M+H]+，626.2868；found：626.2868.
N1-(2-氨基乙基)-N5-(6-(4-(5-(2-(吡啶-2-基)乙酰氨基)-1，3，4-噻二唑-2-基)丁基)哒嗪-3-基基)戊二酰胺(10)
向化合物9(0.22g，0.35mmol)的二氯甲烷溶液中加入三氟乙酸(5ml)，反应混合物室温氮气保护下搅拌1.5h，将反应混合物进行浓缩；用饱和碳酸氢钠水溶液调PH至8，有黄色固体析出，抽滤得粗品，经柱层析得到黄色固体133mg，收率72％。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ10.99(s，1H)，8.61(d，J＝5.4Hz，1H)，8.23(d，J＝9.2Hz，1H)，8.02(dd，J＝13.7，6.6Hz，2H)，7.58(d，J＝9.0Hz，2H)，7.53-7.46(m，1H)，4.13(s，2H)，3.27(dd，J＝12.0，6.3Hz，2H)，3.01(s，2H)，2.92-2.80(m，4H)，2.44(t，J＝7.3Hz，2H)，2.15(t，J＝7.6Hz，2H)，1.87-1.78(m，2H)，1.73(s，4H)，1.22(s，2H).HRMS(ESI)：m/z，calcdfor C24H31N9O3S[M+H]+，526.2343；found：526.2364。
N1-(2-(3-(3′，6′-二羟基-3-氧代-3H-螺[异苯并呋喃-1，9′-呫吨]-6-基)硫脲基)乙基)-N5-(6-(4-(5-(2-(吡啶-2-基)乙酰氨基)-1，3，4-噻二唑-2-基)丁基)哒嗪-3-基)戊二酰胺(probel)
向化合物10(40mg，0.076mmol)的四氢呋喃溶液中加入异硫氰酸荧光素(20mg，0.051mmol)和三乙胺(20mg，0.20mmol)。反应混合物在35℃搅拌2小时，将混合物进行浓缩，通过制备高效液相得到黄色固体25mg，收率35.7％。mp 179.2-180.1℃.1H NMR(300MHz，MeOD-d4)：δ8.69(s，1H)，8.39(d，J＝8.9Hz，1H)，8.22(d，J＝7.5Hz，1H)，8.13(s，1H)，7.80-7.65(m，4H)，7.18(d，J＝7.9Hz，1H)，6.74(d，J＝12.1Hz，4H)，6.58(d，J＝8.8Hz，2H)，3.74(dd，J＝13.1，6.5Hz，6H)，3.05(s，2H)，2.95(s，2H)，2.53(s，2H)，2.31(d，J＝6.9Hz，2H)，2.00(s，2H)，1.82(s，4H).13C NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ181.14，172.97，172.64，168.97，168.73，164.46，159.96，159.88，158.54，154.77，154.55，152.33，148.82，147.14，142.08，138.19，130.10，129.50，128.64，126.78，125.12，123.02，119.15，113.03，110.14，102.68，83.23，54.59，48.87，44.02，38.15，35.80，34.99，34.65，32.39，29.48，29.15，29.03，28.72，27.30，23.23，21.32，18.76，17.15，14.41.HRMS(ESI)：m/z，calcd for C45H42N10O8S2[M+H]+，915.2701；found：915.2662.HPLC：97.454％。
实施例2
荧光探针Probe 2的制备
Scheme 2.Synthesis of probe 2a
aReagents and conditions：(a)N-boc-ethylenediamine，trimethylamine，DMF，DCM，rt，1h，76％；(b)trifluoroacetic acid，DCM，rt，10h，81％；(c)8，HATU，DIPEA，DMF，35℃，1h，52％.(2-((7-硝基苯并[1，2，5]恶二唑-4-基)氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(12)
向化合物11(0.5g，2.51mmol)的N，N-二甲基甲酰胺溶液中加入单boc乙二胺(0.4g，2.51mmol)和溶于二氯甲烷的三甲胺(0.28g，2.77mmol)，反应混合物室温搅拌1h，混合物加入到水中(30m1)，水层用乙酸乙酯(10ml＊3)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，得到固体0.62g，收率76％。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.49(d，J＝8.6Hz，1H)，7.69(s，1H)，6.18(d，J＝8.6Hz，1H)，5.12(s，1H)，3.63(s，4H)，1.48(s，9H).HRMS(ESI)：m/z，calcd forC13H17N5O5[M+H]+，324.1302；found：324.1292。
N1-(7-硝基苯并[1，2，5]恶二唑-4-基)乙烷-1，2-二胺(13)
向化合物12(0.20g，0.62mmol)的二氯甲烷溶液中加入三氟乙酸(5ml)，反应混合物室温氮气保护搅拌4h。将反应混合物进行浓缩，用饱和碳酸氢钠调PH至7，抽滤得到固体，经柱层析得到产物0.11g，收率81％。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.58(d，J＝8.8Hz，1H)，8.28(s，1H)，6.50(d，J＝8.9Hz，1H)，3.78(s，2H)，3.18(t，J＝6.0Hz，2H)，1.32(d，J＝35.7Hz，1H).HRMS(ESI)：m/z，calcd for C8H9N5O3[M-H]-，222.0633；found：222.0638。
N1-(2-((7-硝基苯并[1，2，5]恶二唑-4-基)氨基)乙基)-N5-(6-(4-(5-(2-(吡啶-2-基基)乙酰氨基)-1，3，4-噻二唑-2-基)丁基)哒嗪-3-基)戊二酰胺(probe2)
向化合物8(20mg，0.0414mmol)N，N-二甲基甲酰胺溶液中加入化合物13(11.6mg，0.052mmol)，(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(31mg，0.082mmol)，室温搅拌10min，加入N，N-二异丙基乙胺(31mg，0.24mmol)，反应混合物在35℃条件下搅拌1h，将混合物加入水中(15ml)，析出灰色固体，经过柱层析得到黄色固体15mg，收率52.7％。mp137.9-139.8℃.1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ12.71(s，1H)，10.99(s，1H)，9.47(s，1H)，8.53(d，J＝9.8Hz，2H)，8.26-8.04(m，2H)，7.81(d，J＝7.1Hz，1H)，7.55(d，J＝8.8Hz，1H)，7.46-7.26(m，2H)，6.44(d，J＝9.4Hz，1H)，4.01(s，2H)，3.16(s，3H)，3.01(s，2H)，2.88(s，2H)，2.73(s，1H)，2.40(s，2H)，1.99(d，J＝5.7Hz，2H)，1.75(d，J＝15.5Hz，6H).13C NMR(101MHz，DMSO-d6)：δ172.93，172.87，168.97，164.47，159.93，158.56，155.36，154.52，149.57，145.84，144.93，144.55，138.42，137.23，128.52，124.64，122.67，121.35，118.97，99.63，44.54，43.55，37.67，35.74，34.99，34.70，29.05，29.00，28.73，21.25.HRMS(ESI)：m/z，calcd for C30H32N12O6S[M+H]+，689.2361；found：689.2371.HPLC：94.92％.
实施例3
荧光探针Probe3的制备
Scheme 3.Synthesis of probe 3a
N1-(2-(3-(3′，6′-二羟基-3-氧代-3H-螺[异苯并呋喃-1，9′-呫吨]-6-基)硫脲基)乙基)-N5-(5-(4-(5-(2-苯基乙酰氨基)-1，3，4-噻二唑-2-基)丁基)-1，3，4-噻二唑-2-基)戊二酰胺(probe 3)
合成方法请参照实施例1。黄色固体，收率36.2％。mp141-143℃.1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ12.82(s，1H)，10.99(s，1H)，10.00(s，1H)，9.47(s，1H)，8.53(d，2H)，8.37(d，1H)，8.23(s，1H)，8.02(d，1H)，7.60(s，1H)，7.44(d，1H)，7.26(d，1H)，5.34(d，1H)，4.79-4.71(m，2H)，3.24(d，2H)，2.06(s，3H)ppm；13CNMR(75MHz，DMSO-d6)：δ178.2，172.0，168.3，164.4，159.9，158.5，155.3，154.5，149.5，145.8，144.9，144.5，138.4，137.9，136.1，133.7，131.2，125.4，123.9，120.3，118.1，116.6，108.3，57.7，45.6，37.67，35.74，34.99，34.70，28.7，23.9ppm；HRMS(ESI)：m/z，calcd for C44H42N9O8S3[M+H]+，920.2313；found：920.2319.HPLC：96％.
实施例4
荧光探针Probe 4的制备
Scheme 4.Synthesis of probe 4a
N1-(2-((7-硝基苯并[1，2，5]恶二唑-4-基)氨基)乙基)-N5-(5-(4-(5-(2-苯基乙酰氨基)-1，1，3，4-噻二唑-2-基)丁基)-1，3，4-噻二唑-2-基)戊二酰胺(probe 4)
合成方法请参照实施例2。浅黄色粉末状固体，收率58％。mp135-137℃.1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ12.71(s，1H)，10.99(s，1H)，9.76(s，1H)，9.47(s，1H)，8.53(d，J＝9.8Hz，2H)，8.37(d，1H)，8.22(s，1H)，8.09-8.01(m，1H，Ar-H)，7.46-7.26(m，2H)，7.28(d，J＝7.8Hz，1H)，7.17-7.12(m，1H)，7.02(d，J＝7.8Hz，1H)，5.34(d，1H)，4.87-4.84(m，2H)，4.50(dd，J＝16.02，16.08Hz，2H)，3.29-3.18(m，2H)，1.62(t，J＝6.9Hz，2H)，1.39-1.33(m，2H)，0.88-0.80(m，3H)ppm；13CNMR(75MHz，DMSO-d6)：δ178.2，172.0，171.0，166.8，163.1，159.0，158.2，155.36，154.52，149.57，145.84，144.93，144.55，138.42，137.9，136.7，133.7，132.9，131.7，130.0，126.1，118.3，117.0，116.7，115.0，108.3，57.5，53.5，52.3，50.3，45.5，43.9，28.6，25.0，20.6，13.7ppm；HRMS(ESI)：m/z，calcd for C29H32N11O6S2[M+H]+，694.1973；found：694.1971.HPLC：95.4％.
实施例5
荧光探针Probe 5的制备
Scheme 5.Synthesis of probe 5a
N1-(2-(3-(3′，6′-二羟基-3-氧代-3H-螺[异苯并呋喃-1，9′-呫吨]-6-基)硫脲基)乙基)-N5-(6-(4-((5-(2-(吡啶-2-基)乙酰氨基)-1，3，4-噻二唑-2-基)氨基)哌啶-1-基)哒嗪-3-基)戊二酰胺(probe 5)
合成方法请参照实施例1。白色固体，收率43％。mp 138-139℃.1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ12.43(s，1H)，10.86(s，1H)，9.10(s，1H)，9.37(s，1H)，8.38(d，J＝8.5Hz，1H)，8.23(d，J＝8.5Hz，1H)，8.01(d，J＝8.5Hz，1H)，7.63(d，1H)，7.25(d，J＝7.8Hz，1H)，5.34(d，J＝17.7Hz，1H)，4.77(t，J＝18.02Hz，1H)，4.65(d，J＝16.02Hz，1H)，4.13(q，J＝16.02Hz，2H)，3.28(d，J＝8.5Hz，2H)，1.24(t，J＝8.5Hz，3H)ppm；13CNMR(75MHz，DMSO-d6)：δ172.7，171.4，168.97，164.47，161.0，159.93，158.56，155.36，154.52，153.8，145.84，144.93，144.55，139.9，134.7，133.3，132.7，129.9，121.7，119.6，118.1，116.1，115.8，115.7，114.7，105.0，72.5，61.7，53.8，44.54，43.55，37.67，35.74，34.99，34.70，28.1，13.8ppm.HRMS(ESI)：m/z，calcd for C46H45N12O8S2[M+H]+，957.2919；found：957.2910.HPLC：97.2％.
实施例6
荧光探针Probe 6的制备
Scheme 6.Synthesis of probe 6a
N1-(2-((7-硝基苯并[1，2，5]恶二唑-4-基)氨基)乙基)-N5-(6-(4-((5-(2-(吡啶-2-基)乙酰氨基)-1，3，4-噻二唑-2-基)氨基)哌啶-1-基)哒嗪-3-基)戊二酰胺(probe 6)
合成方法请参照实施例2。白色粉末状固体，收率60％。mp 129-131℃.1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ12.51(s，1H)，10.59(s，1H)，9.68(s，1H)，8.37(d，J＝8.4Hz，1H)，8.23(s，1H)，8.02(d，J＝8.4Hz，1H)，7.81(d，J＝7.1Hz，1H)，7.45(s，1H)，7.35(d，J＝8.4Hz，1H)，7.24(d，J＝8.4Hz，1H)，6.44(d，J＝9.4Hz，1H)，5.32(d，J＝17.7Hz，1H)，4.79-4.69(m，2H)，4.17-4.10(m，2H)，3.25-3.22(m，2H)，1.28-1.20(m，3H)ppm；13CNMR(75MHz，DMSO-d6)：δ178.7，172.5，154.0，138.4，136.6，134.2，131.3，129.9，128.1，125.2，120.8，117.8，116.2，115.5，108.8，99.63,60.6，58.2，46.1，44.54，43.55，37.67，35.74，34.99，34.70，29.1，14.9ppm；HRMS(ESI)：m/z，calcd for C31H35N14O65[M+H]+，731.2579；found：731.2574.HPLC：96.3％.
下面是本发明部分化合物的生物学实验及结果如下：
半数效应浓度(EC50)检测；
探针分子要能应用于GLS1的活性检测，首先要保证探针分子与GLS1能稳定结合，具有较好亲和力。通过荧光偏振法(affinity-based fluorescence polarization assay，FP assay)来检测荧光探针对于GLS1的结合亲和力，用半数效应浓度(EC50)来表征其亲和力强弱。将GLS1蛋白30nM，荧光探针初浓度100μM三倍稀释，每个浓度设置2个复孔，11个浓度梯度，于384孔黑板(#3575，Corning)中4℃共孵育1h。384孔黑板用多功能酶标仪(SpectraMaxiD)进行数据读取，以溶剂为对照。测试结果表明此类荧光探针的活性都保持在nM水平，如表1所示。因此，本发明中的探针分子均具有较好的GLS1结合能力。
表1本发明部分化合物的半数效应浓度
化合物编号 GLS1 EC<sub>50</sub>(nM)
Probe 1 450.6±1.18
Probe 2 268.1±3.89
Probe 3 193.0±2.07
Probe 4 59.2±6.20
Probe 5 315.8±2.96
Probe 6 104.9±1.53
以probe 1为工具分子，说明基于荧光偏振建立GLS1小分子抑制剂高通量筛选方法：
(1)Probe 1最适浓度的确定：
以PBS为溶剂系统，设定probe 1浓度范围为100μM---10nM，当探针浓度越高时，荧光偏振值越低，当荧光偏振值达到下平台的临界值时对应的浓度就是探针的最适浓度。通过荧光偏振仪读取数据，实验数据于Graphpad prism 7.0分析，表明探针probe 1偏振光的优选浓度为20-200nM。
(2)Probe 1和GLS1蛋白作用最适缓冲体系：
接着对缓冲体系进一步研究。Probe 1浓度设为25nM，GLS1初始浓度25μM三倍稀释，十个浓度梯度。将Probe 1分别和GLS1蛋白于384黑板一起孵育1h，用多功能酶标仪进行数据读取，以空白缓冲体系的孔为空白对照，只加25nMProbe 1的孔为阴性对照。Δmp＝测试值mp-阴性mp，将Δmp数值和蛋白浓度数值导入Graphpad prism 7.0分析。结果表明Probe 1与GLS1的结合亲和力曲线如图1所示。经过Graphpad prism 7.0分析可以得出Probe 1对GLS1的EC50，说明Probe 1对GLS1具有较好的亲和力及预期结合效果，且曲线拟合很好(R2≥99.0％)，表明实验结果真实可信。
然后，我们用建立好的高通量筛选方案测试已报道的阳性药对GLS1的抑制IC50值；以Tris，8.5为缓冲体系，Probe 1浓度为25nM，GLS1蛋白浓度30nM，将阳性药CB839和BPTES初始浓度100μM，三倍稀释，十个浓度梯度，两个复孔，分别与GLS1蛋白和Probe 1于384孔板4℃孵育2h，酶标仪读取荧光偏振值，以只加探针缓冲液为空白对照，探针和GLS1蛋白为阴性对照。
以CB839为例说明此高通量方法测试化合物IC50的计算过程，酶标仪读取两个复孔的荧光偏振值，通过公式％抑制率＝100x(1-(实测值-空白)/(阴性值-空白))，得出具体浓度所对应的抑制率。将所得数据导入Graphpad prism 7.0分析拟合得IC50值(图2)。由图2可见，经过Graphpad prism 7.0分析可以得出CB839、BPTES对GLS1的IC50，且曲线拟合很好(R2≥99.0％)，且与已报道的活性数据相近，表明实验结果真实可信。
表1采用本发明方法测定的IC50值以及文献报道方法测定的IC50值
阳性化合物 文献报道的方法，IC<sub>50</sub>值 本发明的方法，IC<sub>50</sub>值
CB839 0.032μM 0.21μM
BPTES 3.3μM 2.9μM
阳性药IC50测试结果与已报道得活性数据相近，且与已报道IC50值呈一定得相关性，确证了此高通量筛选的准确性和可靠性。
高通量筛选方法的稳定性和溶剂耐受性考察：
(1)DMSO耐受性；
二甲基亚砜(DMSO)是一种常用的溶剂，多用于测试化合物的溶解。因此，基于Probe 1和GLS1蛋白作用的荧光偏振测定应该能够耐受低体积的DMSO。在进行Probe 1和GLS1蛋白结合试验时，结合体系中最大含有1.00％DMSO(v/v)。基于此，进一步测试了1％-14％(v/v)的DMSO对竞争结合实验的影响。实验结果表明，当DMSO(v/v)含量增加至14％时，荧光偏振测定的探针和蛋白结合亲和力依然相当稳定。DMSO(v/v)占比为0％、1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％和14％时，用GraphPad Prism 7.0分析，当DMSO(V/V)≤14％，对探针蛋白结合几乎没有影响，表明这个方法溶剂耐受性良好，适用于小分子的高通量筛选。这种高通量筛选方法具有良好的DMSO耐受性(图3)。
(2)验稳定性Z’因子考察；
Z’因子统计实验，根据30次实验中高信号组(Probe 1结合GLS1)和低信号组(仅Probe 1)的偏振光，并且在不同的时间段重复这个实验2次，分析此高通量筛选方法的稳定性。统计得Z′因子为0.96，确证了该方法有较好的稳定性。将30次实验荧光偏振值用GraphPad Prism 7.0统计分析，利用公式Z’＝1-3(σb-σf)/|μb-μf|，(其中σb和σf分别是高信号组和低信号组的标准偏差)，得出Z’因子为0.96，表明此方案可以用于药物的高通量筛选，具有廉价，稳定，快速，高效等优点(图4)。

Claims (9)

1.具有通式(I)的谷氨酰胺酶小分子荧光探针，其特征在于：包括谷氨酰胺酶抑制剂A、连接链L2和荧光报告基团B，
其中，
L1为：CH2SCH2、CH2CH2、CH2CH2CH2、CH2、CH2S、SCH2、CH2NHCH2、CH＝CH；
X1和X2分别为：S、O或CH＝CH，其中，CH中的任何一个氢都可以被烷基取代；
R1和R2分别为：H、烷基、烷氧基、羟基；
R3为烷烃、取代的烷烃、芳香烃、芳香烷烃、氰基、环烷烃、环芳香烷烃、氢、卤素、卤素取代的烷烃、杂原子芳香烃、杂原子芳香烷烃或杂原子环烷烃；
L2为4～10个原子长度的连接链，该连接链含有碳、氮或氧原子；
B为荧光报告基团。
2.根据权利要求1所述的具有通式(I)的谷氨酰胺酶小分子荧光探针，其特征在于：所述荧光报告基团为异硫氰酸荧光素FITC或7-硝基-2，1，3-苯并氧杂噁二唑NBD，
3.根据权利要求1所述的具有通式(I)的谷氨酰胺酶小分子荧光探针，其特征在于：所述L2为如下结构式中任意一种：
4.根据权利要求1所述的具有通式(I)的谷氨酰胺酶小分子荧光探针，其特征在于：所述L1代表CH2CH2。
5.根据权利要求1所述的具有通式(I)的谷氨酰胺酶小分子荧光探针，其特征在于：所述X1为S，X2为CH＝CH。
6.根据权利要求1所述的具有通式(I)的谷氨酰胺酶小分子荧光探针，为如下任一种：
N1-(2-(3-(3′，6′-二羟基-3-氧代-3H-螺[异苯并呋喃-1，9′-呫吨]-6-基硫脲基乙基)-N5-(6-(4-(5-(2-(吡啶-2-基)乙酰氨基)-1，3，4-噻二唑-2-基)丁基)哒嗪-3-基)戊二酰胺、
N1-(2-((7-硝基苯并[1，2，5]恶二唑-4-基)氨基)乙基)-N5-(6-(4-(5-(2-(吡啶-2-基基)乙酰氨基)-1，3，4-噻二唑-2-基)丁基(哒嗪-3-基)戊二酰胺、
N1-(2-(3-(3′，6′-二羟基-3-氧代-3H-螺[异苯并呋喃-1，9′-呫吨]-6-基)硫脲基)乙基)-N5-(5-(4-(5-(2-苯基乙酰氨基)-1，3，4-噻二唑-2-基)丁基)-1，3，4-噻二唑-2-基)戊二酰胺、
N1-(2-((7-硝基苯并[1，2，5]恶二唑-4-基)氨基)乙基)-N5-(5-(4-(5-(2-苯基乙酰氨基)-1，1，3，4-噻二唑-2-基)丁基)-1，3，4-噻二唑-2-基)戊二酰胺、
N1-(2-(3-(3′，6′-二羟基-3-氧代-3H-螺[异苯并呋喃-1，9′-呫吨]-6-基)硫脲基)乙基)-N5-(6-(4-((5-(2-(吡啶-2-基)乙酰氨基)-1，3，4-噻二唑-2-基)氨基)哌啶-1-基)哒嗪-3-基)戊二酰胺、
N1-(2-((7-硝基苯并[1，2，5]恶二唑-4-基)氨基)乙基)-N5-(6-(4-((5-(2-(吡啶-2-基)乙酰氨基)-1，3，4-噻二唑-2-基)氨基)哌啶-1-基)哒嗪-3-基)戊二酰胺。
7.权利要求1所述的具有通式(I)的谷氨酰胺酶小分子荧光探针的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
化合物II先与戊二酸III发生缩合反应，生成中间体IV，反应溶剂为DMF、氯仿或DMSO；中间体IV和单Boc-乙二胺缩合生成中间体V，反应溶剂为DMF、DMSO、甲醇或四氢呋喃；中间体V在酸性条件下水解，脱去Boc保护基生成中间体VI，反应溶剂为二氯甲烷、甲醇或四氢呋喃；中间体IV、VI分别和NBD、FITC反应，生成通式(I)的谷氨酰胺酶小分子荧光探针，反应溶剂优选DMF、二氯甲烷、甲醇或四氢呋喃。
8.权利要求1-6任一项所述的具有通式(I)的谷氨酰胺酶小分子荧光探针在测定化合物对谷氨酰胺酶的抑制活性中的用途。
9.权利要求8所述的用途，其特征在于：所述谷氨酰胺酶抑制活性测定方法为将待测化合物、具有通式(I)的谷氨酰胺酶小分子荧光探针和谷氨酰胺酶在缓冲体系中共孵育，在偏振光激发波长为485nm条件下，采用荧光偏振酶标仪记录发射波长为535nm条件下的偏振光信号值，计算即得。
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