CN112409346B - 一种用于细胞内h2s检测的荧光探针及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种4‑硝基‑苯并氧杂噁二唑(NBD)作为识别基团、氧杂蒽作为分子基本骨架并修饰强吸电子性质的三氰基呋喃基团的荧光探针分子结构，该荧光探针分子本身不发出荧光，但是在H2S存在情况下，通过硫解反应将NBD基团从探针分子结构中切除，形成具有强给电子性质的哌嗪基，分子结构中具有强推拉电子结构的共轭大π键，探针分子荧光显著增强，具有大的斯托克斯位移(193nm)，同时溶液的颜色由蓝紫色变为浅橘色，实现H2S的可视化检测、定性和定量检测以及细胞内的H2S检测。

Description

一种用于细胞内H2S检测的荧光探针及其制备方法
技术领域
本发明属于化学分析检测领域，具体涉及一种检测H2S的荧光探针及其制备方法。
背景技术
生物硫醇在细胞中扮演着非常重要的角色，H2S是最简单的生物硫醇，是一种重要的气体信号分子，通过酶促或非酶促过程在人体中内生性产生。H2S可以作为恶臭气体存在或溶解在水溶液中，主要以阴离子形式 HS-存在。H2S有助于广泛的生理反应，适量的H2S不仅能保护神经元，调节神经细胞和神经内分泌功能，还具有舒张血管平滑肌的功能。H2S作为抗氧化剂和信号传导剂在多种组织类型中，如肝脏，胃肠系统，胰腺，脑和循环系统是有活性的。另一方面，研究已经确定，异常水平的 H2S 可能会导致疾病，如糖尿病，帕金森氏病，阿尔茨海默氏病等疾病。
目前，检测硫化氢的方法有多种。传统的分析技术，例如比色法和气相色谱法提供了对生物体产生的H2S的体积测量，但是在活的生物体细胞和组织内特异性检测H2S是非常困难的。目前为了应对这一挑战，研究开发人员在该领域寻求一种基于对分子结构和功能的基本理论的有机合成方法，以开发基于反应型的具有灵敏性，选择性和生物相容性的荧光探针，并能在活体中检测 H2S。因此设计分子荧光探针用于检测H2S，对开发新药以及预防治疗硫化氢引起的疾病都有着重要意义。
用于检测靶标分析物的基于反应型的探针是生物相容性分子，与靶标分析物化学选择性反应，分子转化而产生敏感的光学信号，将探针从无荧光分子变为具有高强度的荧光分子，并且可以使用荧光显微镜实时检测生物分子。目前，已经报道的针对H2S探针的荧光成像的研究，基于反应的主要有三种策略：还原反应，亲核反应和金属硫化物沉淀。开发具有多功能的新型荧光染料与探针是实现对环境和生物分析物检测的基础，也是科学家面临的重大挑战。在本发明中，发明人设计了一种小分子荧光探针，并对其性能进行研究与应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于4-硝基-苯并氧杂噁二唑（NBD）作为识别基团、氧杂蒽作为分子基本骨架并修饰强吸电子性质的三氰基呋喃基团的荧光探针分子结构，该荧光探针分子本身不发出荧光，但是在H2S存在情况下，通过硫解反应将NBD基团从探针分子结构中切除，形成具有强给电子性质的哌嗪基，分子结构中具有强推拉电子结构的共轭大π键，探针分子荧光显著增强，具有大的斯托克斯位移（193nm），同时溶液的颜色由蓝紫色变为浅橘色，实现H2S的可视化检测、定性及定量检测以及细胞内的H2S检测。
本发明首要目的在于提供的一种用于检测H2S的荧光探针，其结构如式A所示：
Figure 163266DEST_PATH_IMAGE001
。
本发明的另一目的在于提供一种前述用于检测H2S的荧光探针的制备方法，所述制备方法如下：
步骤（1）：将化合物1与4-氯水杨醛在碳酸铯存在下，在DMF中反应，得到式I所示的中间体，反应式如下：
Figure 346991DEST_PATH_IMAGE002
；
步骤（2）：将式I所示的中间体与式3所示的三氰基呋喃化合物在碳酸钾、乙酸酐存在的条件下存在的条件下加热搅拌反应，得到式II所示的中间体，反应式如下：
Figure 668251DEST_PATH_IMAGE003
；
步骤（3）： 将式II所示的中间体与4-硝基-7-哌嗪苯并氧杂噁二唑在三乙胺为碱、二氯甲烷作为反应溶剂的条件下反应，制备获得式A所示的用于检测H2S的荧光探针，反应式如下：
Figure 688160DEST_PATH_IMAGE004
。
步骤（1）中，式1化合物、式2化合物与碳酸铯的投料摩尔比为1:（0.8~1）:（1.5~2.5），反应温度为室温~50℃；
步骤（2）中，式I所示的中间体、式3所示的三氰基呋喃化合物与碳酸钾的投料摩尔比为1:（1~1.5）:（1.5~2.5），反应温度为80℃~100℃；
步骤（3）中，式II所示的中间体、4-硝基-7-哌嗪苯并氧杂噁二唑和三乙胺的投料摩尔比1:（1~1.5）:（1.5~2.5），反应温度为0℃~室温。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明首次报道了一种基于4-硝基-苯并氧杂噁二唑（NBD）作为识别基团、氧杂蒽作为分子基本骨架并修饰强吸电子性质的三氰基呋喃基团的荧光探针分子结构，该荧光探针分子本身不发出荧光，但是在H2S存在情况下，通过硫解反应将NBD基团从探针分子结构中切除，形成具有强给电子性质的哌嗪基，分子结构中具有强推拉电子结构的共轭大π键，在激发波长580nm下测试探针分子在773nm处具有显著的荧光发射，斯托克斯位移达到了193nm。
（2）在溶液中检测H2S的试验表明，本发明的探针分子用于溶液中检测时颜色由蓝紫色变为浅橘色，可以实现H2S的可视化检测。
（3）本发明的探针分子可以用于细胞内的H2S检测，斯托克斯位移大，背景干扰小、且组织受到的光损伤小，准确度高。
（4）本发明的探针分子应用于H2S检测，灵敏度高，检测限低至5nM；选择性好，对不同分析物（F-, GSH, H2O2, Hcy，Cys, NO2 -, S2O3 2-, SO3 2-, HSO3 -, NO3 -）无响应，无干扰；对H2S响应时间快，本发明探针分子与H2S的动力学研究表明，探针与不同浓度的H2S在3min左右即可达到平衡，荧光不再变化，表明本发明的探针分子可以应用于高效地检测H2S。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步详述，在下文中，如无特殊说明，所使用的方法均为本领域的常规方法，所使用的试剂均可以通过本领域常规商业途径购买获得或者经过已知的有机合成途径制备获得。
实施例1 荧光探针分子的制备
步骤（1）式I中间体的制备
Figure 503800DEST_PATH_IMAGE002
将 0.95 化合物 1（约5 mmol）和0.75g 4-甲氧基水杨醛（约4.8 mmol）溶于 10mL DMF 中，加入 3.26 g Cs2CO3（约10 mmol）加入100mL圆底烧瓶中，随后置于40℃下搅拌反应过夜（约8-12h），反应完全后过滤除，滤液浓缩得到粗产品，以自己烷/乙酸乙酯（体积比为10:1）混合液为洗脱溶剂，经硅胶层析柱纯化得黄色固体产物I（0.91g，产率 77.1%）。
步骤（2） 式II中间体的制备
Figure 292765DEST_PATH_IMAGE005
在100mL的圆底烧瓶中，将化合物I(0.74g，约3.0mmol)溶于10mL乙酸酐，随后向其加入式3所示的三氰基呋喃化合物 (0 .72g，约3.6mmol)和碳酸钾(0.83g，6.0mmol)，用N2置换反应气氛后，将圆底烧瓶于85℃下搅拌过夜（约8-12h），过滤，液液通过减压蒸馏除去溶剂，粗产品用体积比为20:1二氯甲烷/正己烷洗脱剂进行硅胶柱层析，得到式II所示的中间体化合物(0.97g，产率：75.7％)。
步骤（3） 式A的探针分子的制备
Figure 40053DEST_PATH_IMAGE004
在100mL的圆底烧瓶中，在氮气保护下，将式II所示的中间体0.86g（约2mmol）溶于10mL二氯甲烷，在冰浴和氮气保护条件下，用注射器加入三乙胺(0.55mL, 约4mmol)，搅拌，随后缓慢加入溶于10mL二氯甲烷的4-硝基-7-哌嗪苯并氧杂噁二唑(0.75g, 约3mmol)溶液，滴加完成后升至室温并搅拌反应过夜，反应完全后经旋转蒸发仪旋干溶剂，残余物用二氯甲烷/甲醇（体积比20:1）混合溶剂作为洗脱溶剂经硅胶柱层析分离得到式A所示的化合物（蓝紫色固体M.p. 316-318℃，1.1g, 产率85.9%）。1H NMR(500MHz, DMSO-d6): δ=8.61(d, J=8.4Hz, 1H), 7.49(s, 1H), 7.27(s, 1H)，7.11(s, 1H), 6.92(s, 1H)，6.51 (d,J=17.4Hz, 2H), 6.17(s, 1H)，3.61~3.54(m, 4H), 3.48~3.36(m, 4H), 3.12~2.93(m,2H), 2.76(t, J=7.0Hz, 2H), 1.59(dt, J=14.2Hz, 2H), 1.18(s, 6H)。
试验例1 探针分子的光谱性质及特异性研究试验
将制备探针分子溶于DMSO中（浓度为10-3mol/L）。将不同分析物（F-, GSH, H2O2,Hcy，Cys, NO2 -, S2O3 2-, SO3 2-, HSO3 -, NO3 -, Na2S）溶于去离子水中，浓度为10-3mol/L。检测溶液包括20μL浓度为10-3mol/L探针溶液、适量的DMSO、一定量的PBS缓冲液(10mM,pH=7.45)和适量体积的分析物溶液，最终体积为2.0mL。使用光子技术国际(PTI)光谱仪记录检测液的荧光光谱和测定荧光强度。测试条件：激发波长为580nm。
结果表明，本发明的荧光探针分子本身在580nm激发下，荧光探针分子本身不发出荧光，其余待分析物均不改变探针的荧光性质，荧光光谱未发生明显变化。加入Na2S后，溶液的颜色由蓝紫色变为浅橘色，说明书本发明的探针分子可以实现H2S的可视化检测。加入Na2S后，通过硫解反应将NBD基团从探针分子结构中切除，形成具有强给电子性质的哌嗪基，分子结构中具有强推拉电子结构的共轭大π键，探针分子在773nm处具有显著的荧光发射，斯托克斯位移达到了193nm。
试验例2 探针分子的灵敏度及定量分析测试试验
利用探针溶液（10-3mol/L，DMSO/PBS(v/v=6:4),pH=7.45）进行Na2S的定量分析检测 (响应时间3min)，加入不同浓度的Na2S（0，0.5，1.5，2.5，5，10，15，25，40，50，100，150，250，500μM），在25℃反应3min后在773nm处具有明显的荧光增强，并且探针（10-3mol/L）与Na2S (0-100μM)的响应存在线性关系，线性回归方程Y=0.0684+0.0017X(R2=0.09969)，检测限低至5nM，说明本发明的探针分子对H2S灵敏度高、响应迅速、并能实现定量检测溶液中的H2S含量。
试验例3 探针分子的细胞培养及荧光成像试验
将HepG2细胞置于 96孔玻底板共聚焦培养皿中贴壁培养24h，经过PBS洗涤三次后加入探针（10μM，1%DMSO），继续培养30min，再用PBS洗涤三次，利用倒置荧光显微镜对细胞进行荧光成像，由于内源H2S的浓度水平较低，因此我们分别添加含有0、25、50和100μM的Na2S溶液用以增加细胞内H2S的浓度，在培养箱中继续孵育细胞30min，用PBS洗涤三次以除去多余的Na2S，在倒置荧光显微镜下对细胞进行荧光成像分析。
结果表明本发明的探针分子应用于细胞荧光成像可以清晰地看出细胞荧光随着H2S浓度的增加而增强，证明本发明的荧光探针具有良好的膜透过性并可用于细胞内的H2S浓度检测。

Claims (3)

1.一种用于检测H2S的荧光探针，其特征在于，具有如式A所示的结构：
Figure 704200DEST_PATH_IMAGE001
。
2.根据权利要求1所述的用于检测H2S的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法如下：
步骤（1）：将化合物1与4-氯水杨醛在碳酸铯存在下，在DMF中反应，得到式I所示的中间体，反应式如下：
Figure 854559DEST_PATH_IMAGE002
；
步骤（2）：将式I所示的中间体与式3所示的三氰基呋喃化合物在碳酸钾、乙酸酐存在的条件下加热搅拌反应，得到式II所示的中间体，反应式如下：
Figure 636439DEST_PATH_IMAGE003
；
步骤（3）：将式II所示的中间体与4-硝基-7-哌嗪苯并氧杂噁二唑在三乙胺为碱、二氯甲烷作为反应溶剂的条件下反应，制备获得式A所示的用于检测H2S的荧光探针，反应式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，式1化合物、式2化合物与碳酸铯的投料摩尔比为1:（0.8~1）:（1.5~2.5），反应温度为室温~50℃；
步骤（2）中，式I所示的中间体、式3所示的三氰基呋喃化合物与碳酸钾的投料摩尔比为1:（1~1.5）:（1.5~2.5），反应温度为80℃~100℃；
步骤（3）中，式II所示的中间体、4-硝基-7-哌嗪苯并氧杂噁二唑和三乙胺的投料摩尔比1:（1~1.5）:（1.5~2.5），反应温度为0℃~室温。
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