CN117164575A - 一种单激发检测onoo-的近红外比率荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单激发检测过氧亚硝酸根ONOO‑的近红外比率荧光探针及其制备方法和应用。所述荧光探针的结构式如下式I所示，命名为ER‑MPTC(R＝H)和ER‑DMPTC(R＝CH3)。本发明的荧光探针为反应型探针，所述荧光探针以碳碳双键的氧化裂解作为ONOO‑的识别方式；本发明的荧光探针在体外实验中表现出对ONOO‑的良好的比率响应、优异的选择性和高灵敏度，同时本发明的荧光探针具有良好的光稳定性，在较宽的pH范围内稳定并在生理pH范围内具有最佳响应信号，能够满足对生物组织样本中ONOO‑的检测要求。
Description
技术领域
本发明涉及荧光探针技术领域。更具体地，涉及一种单激发检测ONOO-的近红外比率荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
过氧化亚硝酸根阴离子ONOO-是活性氧家族的一员，可通过超氧阴离子自由基与一氧化氮自由基的快速反应而产生，具有较强氧化性和亲核性，能与蛋白质、核酸等多种生物活性物种发生反应。同时，ONOO-深刻影响着细胞的氧化应激、炎症和免疫反应，并可以通过各种信号通路触发细胞死亡。在生理条件下，ONOO-在正常细胞的信号转导，基因表达等过程中具有重要作用。同时，ONOO-的过量生成也被认为与许多疾病和病理状况有关，包括药物引起的肝中毒、中风、缺血性-再灌注损伤、神经退行性疾病、炎症和癌症等。因此，研究疾病相关过程中的ONOO-的变化，对于揭示ONOO-的复杂作用，促进对疾病病因及其治疗的深入了解具有重要意义。
近几十年来，基于分子探针的荧光成像已成为研究ONOO-在生物和病理过程中的绝佳选择。与其他成像方式相比，荧光成像在生物样品成像中具有灵敏度高、靶标选择性高、生物安全性好、无创可视化、时空分辨率高等突出优势。近些年，人们开发了很多用于检测ONOO-的荧光探针，但这些探针中的大多数只在单个荧光通道表现出开启荧光信号，其性能会受到所用仪器的类型、细胞内部微环境、探针局部浓度和光漂白的影响。相比之下，比率型荧光探针能够同时调节两个发射信号，具有自校准能力，可以大大消除上述干扰，使响应信号更稳定；同时，单激发的比率型荧光探针，能够避免不同激发光源的强度波动所带来的信号误差。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种单激发波长检测过氧亚硝酸根ONOO-的近红外比率荧光探针ER-MPTC和ER-DMPTC。该探针对ONOO-具有的良好的比率响应、优异的选择性和高灵敏度，同时具有良好的光稳定性，在较宽的pH范围内稳定并在生理pH范围内具有最佳响应信号，能够满足对生物组织样本中ONOO-的检测要求。
本发明的另一个目的在于提供一种制备如上所述的检测ONOO-的近红外比率荧光探针的制备方法。
为达到上述第一个目的，本发明公开一种单激发检测过氧亚硝酸根ONOO-的近红外比率荧光探针，所述近红外比率荧光探针的结构式如式I所示，当R为H时，命名为ER-MPTC，当R为CH3时，命名为ER-DMPTC；
其中，所述R选自H或CH3。
为达到上述第二个目的，本发明采用下述技术方案：
本发明公开一种制备如上所述的近红外比率荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)在0-4℃下，将化合物1、三乙胺和溶剂混合均匀，加入化合物2，搅拌1-2h，恢复至室温，继续搅拌6-12h；待反应结束后，浓缩，硅胶柱层析分离纯化，得到化合物3；
(2)在惰性气氛下，向化合物3和化合物4中加入催化剂、分子筛和溶剂，加热回流反应6-10h；待反应结束后，浓缩，硅胶柱层析分离纯化，即得ER-MPTC或ER-DMPTC。
进一步，步骤(1)中，所述化合物1、化合物2和三乙胺的摩尔比为0.5-1:1.5:1.5。
进一步，所述溶剂选自二氯甲烷和/或乙腈。
进一步，步骤(2)中，所述化合物3和化合物4的摩尔比为1:1-4。
进一步，所述催化剂为哌啶。
进一步，步骤(2)中，所述化合物3与所述催化剂的摩尔体积比为1mmoL:(10-50)μL。
进一步，步骤(2)中，所述化合物3与所述分子筛的摩尔质量比为1mmoL:(1-4)g。
进一步，步骤(1)中，硅胶柱层析使用的洗脱液二氯甲烷与甲醇的体积比为10-100:1。
进一步，步骤(2)中，硅胶柱层析使用的洗脱液二氯甲烷与乙酸乙酯的体积比为10-100:1。
本发明有益效果如下：
本发明公开一种单激发检测ONOO-的近红外比率荧光探针及其制备方法和应用。本发明的荧光探针为反应型探针，所述荧光探针以碳碳双键的氧化裂解作为ONOO-的识别方式，合成出一种全新的ONOO-近红外比率探针，该探针具有如下优势：
1、本发明提供的ER-MPTC和ER-DMPTC近红外比率荧光探针在检测ONOO-时可显示出明显的荧光变化，并且与ONOO-浓度呈现出良好的比率变化趋势，随着加入的ONOO-浓度增大，体系540nm处发射峰强度逐渐增强，680nm处发射峰强度逐渐降低，呈现比率变化。
2、本发明提供的ER-MPTC和ER-DMPTC近红外比率荧光探针对ONOO-的检测具有优异的选择性，将相关干扰物质(Ca2+、Cu2+、Fe3+、Mg2+、K+、Zn2+、NO2 -、NO3 -、Cys、GSH、NO、H2O2、t-BuOOH、O2 -.、·OH、ROO·和ClO-)添加到ER-MPTC或ER-DMPTC溶液后，对ER-MPTC或ER-DMPTC的荧光均无明显影响，只有当ONOO-加入后，探针荧光强度比率变化明显。
3、本发明提供的ER-MPTC和ER-DMPTC近红外比率荧光探针具有良好的光稳定性，通过150W氙灯持续照射90min，该探针的荧光强度没有发生明显变化。
4、本发明提供的ER-MPTC和ER-DMPTC近红外比率荧光探针，在较宽的pH范围内稳定并在生理pH范围内具有最佳响应信号，能够满足对生物组织样本中ONOO-的检测要求。
5、本发明提供的ER-MPTC和ER-DMPTC近红外比率荧光探针具有良好的生物相容性，可实现生物体内的ONOO-的检测。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出本发明实施例1制备的化合物3的1HNMR谱图。
图2示出本发明实施例1制备的ER-MPTC近红外荧光探针的1HNMR谱图。
图3示出本发明实施例1制备的ER-DMPTC近红外荧光探针的1HNMR谱图。
图4示出本发明实施例2制备的ER-MPTC在1xPBS(pH8.2，3mMCTAB)溶液中对ONOO-响应的荧光变化曲线。
图5示出本发明实施例2制备的ER-DMPTC在1xPBS(pH8.2，3mMCTAB)溶液中对ONOO-响应的荧光变化曲线。
图6示出本发明实施例2制备的ER-DMPTC对不同浓度ONOO-的荧光比率响应拟合曲线。
图7示出本发明实施例2制备的ER-DMPTC的选择性测试结果。
图8示出本发明实施例3制备的ER-DMPTC的光稳定性测试结果。
图9示出本发明实施例3制备的ER-DMPTC的pH稳定性测试结果。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
如无特殊说明，本发明所用原料均可通过市售商购获得，本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及端值或者端值之间的任意值所构成的任意子范围。
实施例1
化合物3的合成
在0℃下，向反应容器中加入化合物1(251.3mg，1mmol)、缚酸剂三乙胺(303.6mg，3mmol)和溶剂二氯甲烷20mL，搅拌均匀之后，加入化合物2(785.2mg，3mmol)。维持0℃搅拌2h，恢复至室温后，继续搅拌12h；通过薄层色谱观察反应结束后，浓缩溶剂，通过硅胶柱层析分离纯化，洗脱液为二氯甲烷和甲醇(100/1，v/v)，收集得到淡黄色固体产物，即化合物3(217.4mg，46％)，其中，化合物3的1HNMR谱图如图1所示。
ER-MPTC的合成
向反应容器中加入化合物3(238.3mg，0.5mmol)和化合物4(108.6mg，0.5mmol)，在氮气保护下，加入催化剂哌啶(5μL)、溶剂无水乙腈20mL和分子筛0.5g，加热回流反应10h。通过薄层色谱观察反应结束后，浓缩溶剂，通过硅胶柱层析分离纯化，洗脱液为二氯甲烷和乙酸乙酯(100/1，v/v)，收集得到黑色固体产物，即ER-MPTC(118.3mg，35％)，其中，ER-MPTC的1HNMR谱图如图2所示。
ER-DMPTC的合成
向反应容器中加入化合物3(238.3mg，0.5mmol)和化合物5(115.7mg，0.5mmol)，在氮气保护下，加入催化剂哌啶5μL、溶剂无水乙腈20mL和分子筛0.5g，加热回流反应10h。通过薄层色谱观察反应结束后，浓缩溶剂，通过硅胶柱层析分离纯化，洗脱液为二氯甲烷和乙酸乙酯(100/1，v/v)，收集得到黑色固体产物，即ER-DMPTC(100.0mg，29％)，其中，ER-DMPTC的1HNMR谱图如图3所示。
探针母液配制方法
1mMER-MPTC或ER-DMPTC探针母液配制：在分析天平上称取适量样品，移液枪移取相应体积二甲基亚砜(DMSO)溶解样品，配制探针浓度为1mM，放入冰箱4℃保存，下面各实施例按照相同方法配制探针母液。
实施例2：
化合物3的合成
在0℃下，向反应容器中加入化合物1(502.6mg，2mmol)、缚酸剂三乙胺(303.6mg，3mmol)和溶剂二氯甲烷20mL，搅拌均匀之后，加入化合物2(785.2mg，3mmol)。维持0℃搅拌1h，恢复至室温后，继续搅拌6h；通过薄层色谱观察反应结束后，浓缩溶剂，通过硅胶柱层析分离纯化，洗脱液为二氯甲烷和甲醇(10/1，v/v)，收集得到淡黄色固体产物，即化合物3。
ER-MPTC的合成
向反应容器中加入化合物3(238.3mg，0.5mmol)和化合物4(434.4mg，2mmol)，在氮气保护下，加入催化剂哌啶15μL、溶剂无水乙腈20mL和分子筛1g，加热回流反应8h。通过薄层色谱观察反应结束后，浓缩溶剂，通过硅胶柱层析分离纯化，洗脱液为二氯甲烷和乙酸乙酯(10/1，v/v)，收集得到黑色固体产物，即ER-MPTC。
ER-DMPTC的合成
向反应容器中加入化合物3(238.3mg，0.5mmol)和化合物5(462.8mg，2mmol)，在氮气保护下，加入催化剂哌啶15μL、溶剂无水乙腈20mL和分子筛1g，加热回流反应8h。通过薄层色谱观察反应结束后，浓缩溶剂，通过硅胶柱层析分离纯化，洗脱液为二氯甲烷和乙酸乙酯(10/1，v/v)，收集得到黑色固体产物，即ER-DMPTC。
探针响应ONOO-的荧光发射光谱变化测定
取10μLER-MPTC荧光探针母液，用1xPBS(pH8.2，3mMCTAB)溶液稀释，平行制备12组，分别加入ONOO-待测溶液，使得每组探针溶液为10μM，而ONOO-待测溶液浓度分别为0-200μM(分别为0μM、5μM、10μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM、140μM、160μM、180μM和200μM)。在室温下避光孵育12h，充分反应后，在10mm的比色皿中测试平行样品的荧光光谱。荧光发射光谱变化见图4。
取10μLER-DMPTC荧光探针母液，用1xPBS(pH8.2，3mMCTAB)溶液稀释，平行制备21组，分别加入ONOO-待测溶液，使得每组探针溶液为10μM，而ONOO-待测溶液浓度分别为0-200μM(分别为0μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM、120μM、140μM、160μM、180μM和200μM)。在室温下避光孵育12h，充分反应后，在10mm的比色皿中测试平行样品的荧光光谱。荧光发射光谱变化见图5。
从图4和5中可以看出，荧光探针ER-MPTC和ER-DMPTC对ONOO-具有相似的响应现象，随着ONOO-的加入，探针680nm处的荧光逐步下降，而540nm处的荧光逐渐上升。后续实验均选择ER-DMPTC作为代表物质进行测试。
探针对不同浓度ONOO-的荧光比率响应的拟合曲线见图6。探针ER-DMPTC对于0-200μMONOO-具有良好的线性比率响应。
探针检测ONOO-的选择性测定
取10μL荧光探针母液，用1xPBS(pH8.2，3mMCTAB)溶液稀释，平行制备17组，分别加入500μM相关干扰物质，相关干扰物质包括Ca2+、Cu2+、Fe3+、Mg2+、K+、Zn2+、NO2 -、NO3 -、Cys、GSH、NO、H2O2、t-BuOOH、O2 -.、·OH、ROO·和ClO-，使得每组探针溶液为10μM，在室温下避光孵育12h，充分反应后，在10mm的比色皿中测试荧光光谱，测试结果见图7。从图中可以看出，荧光探针对ONOO-具有良好的选择性。
实施例3：
化合物3的合成
在0℃下，向反应容器中加入化合物1(377.0mg，1.5mmol)、缚酸剂三乙胺(303.6mg，3mmol)和溶剂二氯甲烷20mL，搅拌均匀之后，加入化合物2(785.2mg，3mmol)。维持4℃搅拌2h，恢复至室温后，继续搅拌12h；通过薄层色谱观察反应结束后，浓缩溶剂，通过硅胶柱层析分离纯化，洗脱液为二氯甲烷和甲醇(50/1，v/v)，收集得到淡黄色固体产物，即化合物3。
ER-MPTC的合成
向反应容器中加入化合物3(238.3mg，0.5mmol)和化合物4(217.2mg，1mmol)，在氮气保护下，加入催化剂哌啶25μL、溶剂无水乙腈20mL和分子筛2g，加热回流反应6h。通过薄层色谱观察反应结束后，浓缩溶剂，通过硅胶柱层析分离纯化，洗脱液为二氯甲烷和乙酸乙酯(50/1，v/v)，收集得到黑色固体产物，即ER-MPTC。
ER-DMPTC的合成
向反应容器中加入化合物3(238.3mg，0.5mmol)和化合物5(231.4mg，1mmol)，在氮气保护下，加入催化剂哌啶25μL、溶剂无水乙腈20mL和分子筛2g，加热回流反应6h。通过薄层色谱观察反应结束后，浓缩溶剂，通过硅胶柱层析分离纯化，洗脱液为二氯甲烷和乙酸乙酯(50/1，v/v)，收集得到黑色固体产物，即ER-DMPTC。
荧光探针光稳定性测定
取10μL荧光探针母液，用DMSO将其稀释成10μM，放置于150W氙灯下持续照射90min，每间隔1min采集溶液的荧光光谱。测试结果见图8。从图中可以看出，荧光探针具有良好的光稳定性。
荧光探针pH稳定性及不同pH值下对ONOO-的响应测试
调节1xPBS(3mMCTAB)溶液，使其pH值分别为3.16、4.06、5.13、5.98、6.60、7.12、7.80、8.29、9.29、10.03和11.20。取10μL荧光探针母液，用相应pH值的PBS溶液稀释成10μM，在室温下避光静置12h。另取一组平行样品，加入200μMONOO-，在室温下避光孵育12h。充分反应后，在10mm的比色皿中测试样品的荧光光谱，测试结果见图9。从图中可以看出，荧光探针在较宽的pH范围内稳定并在生理pH范围内具有最佳响应信号，能够满足对生物组织样本中ONOO-的检测要求。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (10)
1.一种单激发检测过氧亚硝酸根ONOO-的近红外比率荧光探针，其特征在于，所述近红外比率荧光探针的结构式如式I所示：
其中，所述R选自H或CH3。
2.一种如权利要求1所述的近红外比率荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)在0-4℃下，将化合物1、三乙胺和溶剂混合均匀，加入化合物2，搅拌1-2h，恢复至室温，继续搅拌6-12h；待反应结束后，浓缩，硅胶柱层析分离纯化，得到化合物3；
(2)在惰性气氛下，向化合物3和化合物4中加入催化剂、分子筛和溶剂，加热回流反应6-10h；待反应结束后，浓缩，硅胶柱层析分离纯化，即得。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述化合物1、化合物2和三乙胺的摩尔比为0.5-1:1.5:1.5。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂选自二氯甲烷和/或乙腈。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述化合物3和化合物4的摩尔比为1:1-4。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述催化剂为哌啶。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述化合物3与所述催化剂的摩尔体积比为1mmoL:(10-50)μL。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述化合物3与所述分子筛的摩尔质量比为1mmoL:(1-4)g。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，硅胶柱层析使用的洗脱液二氯甲烷与甲醇的体积比为10-100:1。
10.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，硅胶柱层析使用的洗脱液二氯甲烷与乙酸乙酯的体积比为10-100:1。
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