CN112694471B - 一种苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种苯并吲哚盐‑吩噻嗪衍生物及其制备和应用。本发明提供的苯并吲哚盐‑吩噻嗪衍生物合成便捷，由便宜易得的原料吩噻嗪和苯并吲哚衍生物经四步反应得到，该苯并吲哚盐‑吩噻嗪衍生物具有双反应位点、检测灵敏度高和斯托克斯位移大的优势，对HClO和SO2的检测具有高度的选择性，且两者的荧光检测信号互不干扰。该分子不仅能够监测细胞内的HClO和SO2，同时能够监测HClO和SO2诱导的线粒体应激以及两者间的动力学平衡，该探针还实现了监测斑马鱼体内HClO和SO2的动力学相互作用，并阐明了细胞水平和斑马鱼体内HClO和SO2所扮演的生理角色。因此，该苯并吲哚盐‑吩噻嗪衍生物对相关疾病的诊断和治疗具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于有机小分子荧光探针和生物传感技术领域，具体涉及一种苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物及其制备方法，本发明还涉及苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物在水相体系中检测HClO的应用以及在水相体系中检测检测SO2的应用；本发明同时还涉及苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物在细胞中检测HClO的应用以及在细胞中检测SO2的应用。
背景技术
次氯酸（HClO）作为体内最重要的活性氧之一，主要由髓过氧化物酶催化氯离子的过氧化反应产生。依赖于其在胞内的浓度，HClO在生命系统中既可作为免疫系统的调节剂，表现出抗菌，促炎和抗炎等特性；也可作为毒性分子诱发细胞的氧化应激，导致脂质、蛋白质和生物大分子的氧化损伤以及一系列疾病的发生，如心血管疾病、关节炎，神经元退行性病变和癌症等。为了防御活性氧（如HClO）诱发的潜在的氧化损伤，生物体利用抗氧化剂（如活性硫）建立了保护性免疫机制。其中二氧化硫（SO2）作为最重要的活性硫之一，它在胞内主要通过催化氧化含硫氨基酸和硫化氢内源性地产生，作为继NO，CO和H2S之后的另一内源性气体信使分子，它在维持生物体的氧化还原平衡中起着十分重要的作用；同时，SO2水平的异常与癌症、神经系统的紊乱和心血管疾病有着密不可分的关系。作为体内最重要的活性氧和活性硫，HClO和SO2在调控机体正常的生理功能和信号传导以及维持其氧化还原稳态等方面起着重要作用，它们在生理环境中不仅扮演着“双刃剑”的角色且彼此紧密相关。因此，探究HClO和SO2的动力学相互作用，将为研究它们的生理功能提供更为精准的信息，同时对相关疾病的诊断和治疗具有重要意义。
目前能够实现对HClO和SO2同时检测的荧光探针非常有限（J. Mater. Chem. B,2017, 5,8389-8398; Talanta, 2017, 165, 625-631; Biomaterials, 2017, 133, 82-93;Chem. Commun., 2020, 56, 7710-7713），而且这些探针都存在一些缺陷，如利用单一反应位点同时识别HClO和SO2，该类探针会因竞争反应导致检测结果出现误差；响应时间较长且荧光检测信号相互干扰等。针对以上存在的问题，设计合成双反应位点、选择性高、灵敏性好且具有大波长位移的荧光探针，用于同时检测HClO和SO2以及它们之间的动力学相互作用，并澄清各自的生理角色，是当前荧光探针和生物传感技术领域的热点和难点。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了的目的是一种苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物及其制备方法；
本发明的另一个目的是提供苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物在水相体系中检测HClO的应用；
本发明的再一个目的是提供苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物在水相体系中检测SO2的应用；
本发明的还有一个目的是提供苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物在细胞中检测HClO的应用；
本发明的更一个目的是提供苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物在细胞中检测SO2的应用。
一、苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物及其制备
本发明提供的苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物，中文名为(E)-2-(2-(10-正丁基-吩噻嗪3-基)乙烯基)-1,1,3-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-碘化盐，英文名为(E)-2-(2-(10-butyl-10H-phenothiazin-3-yl)vinyl)-1,1,3-trimethyl-1H-benzo[e]indol-3-ium，命名为PTBI，结构式如下：
。
本发明提供的苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物的合成方法，包括以下步骤：
（1）冰浴条件下，将氢化钠加入吩噻嗪的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，于常温下反应0.5~1.5h后将溴丁烷滴加至该反应体系中，在65~75℃下反应2~4 h，反应结束后将其冷却至室温，加冰水淬灭反应，乙酸乙酯萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥，减压旋干，柱层析分离提纯得10-正丁基吩噻嗪。其中，吩噻嗪与氢化钠的摩尔比为1:2~1:4；吩噻嗪与溴丁烷的摩尔比为1:1~1:2；柱层析分离洗脱剂为石油醚。
（2）氩气氛围和冰浴条件下，将N,N-二甲基甲酰胺加入三氯氧磷中，于冰浴下反应15~20 min，随后将10-正丁基吩噻嗪的DMF溶液滴加至该反应混合物中，于55~65℃油浴反应3~4h，反应结束后将其冷却至室温并倒入冰水中，用饱和碳酸氢钠中和，二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，减压旋干并柱层析分离提纯得10-正丁基吩噻嗪-3-甲醛。其中，三氯氧磷和N,N-二甲基甲酰胺的摩尔比为1:1~1:2；10-正丁基吩噻嗪与三氯氧磷的摩尔比为1:3~1:5；柱层析分离洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯 =20:1。
（3）将1,1,2-三甲基苯-1H-苯并[e]吲哚溶于乙腈中，将碘甲烷加入该反应体系，于65~75℃下回流反应10~12h，反应结束后将反应体系冷却至室温，将得到的沉淀抽滤，洗涤，得到1,1,2,3-四甲基苯-1H-苯并[e]吲哚-3-碘化盐。其中，1,1,2-三甲基苯-1H-苯并[e]吲哚与碘甲烷的摩尔比为1:2~1:3。
（4）将10-正丁基吩噻嗪-3-甲醛和1,1,2,3-四甲基苯-1H-苯并[e]吲哚-3-碘化盐溶于乙醇中，加入哌啶，于80~90℃加热回流反应10~12h，反应结束后，减压旋干溶剂，柱层析分离提纯得目标产物苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物。其中，10-正丁基吩噻嗪-3-甲醛和1,1,2,3-四甲基苯-1H-苯并[e]吲哚-3-碘化盐的摩尔比为1:1~1:2；10-正丁基吩噻嗪-3-甲醛与哌啶的摩尔比1:1~1:2；柱层析分离洗脱剂为二氯甲烷：乙醇 = 50:1。
苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物PTBI氢谱谱图如图1、碳谱谱图如图2、高分辨质谱谱图如图3。
二、苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物PTBI在水相体系中检测HClO
1、PTBI对HClO的选择性检测
配置初浓度为3 mM的PTBI，30 mM的活性氧、活性氮、氨基酸、阴离子和阳离子溶液。向荧光比色皿中加入2.98mLPBS缓冲液（pH = 7.4，含10%乙腈）和10 μL PTBI，再分别加入10 μL各种分析物，测定490-800 nm（λex= 465 nm）波长范围内的荧光光谱，并建立590 nm处荧光强度与不同物质间的柱状图，图4中1-28号分别是HClO, ONOO-, HO•,1O2, H2O2, O2 −•,t-BuOOH, NO, Cys, Hcy, GSH, L-Ser, DL-Met, L-Phe, L-Lys, L-Leu, L-Pro, L-His, S2-, NO3 -, NO2 -, OAc-, SO4 2-, PO4 3-, K+, Zn2+, Cu2+, Na+。如图4所示，只有HClO的加入可以使PTBI在590 nm处的荧光强度显著增强，其它各种分析物均不能引起PTBI在590nm处荧光信号的改变。因此，PTBI能够实现对HClO的选择性检测。
2、PTBI对不同浓度次氯酸的响应性
配置初浓度为3mM的PTBI，分别向荧光比色皿中加入2.98 mL PBS缓冲液（pH =7.4，含10%乙腈）、10 μLPTBI和10 μL不同浓度的次氯酸，混合均匀后立即用荧光分光光度计测定490-800 nm范围内荧光光谱的变化（λex= 465 nm，λem= 590 nm），结果如图5所示。从图5中的A可以得出，PTBI分子本身在590 nm处几乎没有荧光发射，随着HClO浓度依次增加，590 nm波长处的荧光强度逐渐增强，这说明本发明所提供的PTBI能够超灵敏响应HClO，并且表现出“turn-on”型荧光响应。
以次氯酸浓度为横坐标，590 nm波长下的荧光强度为纵坐标得到次氯酸浓度在0~5μM范围内的线性方程Y = 47.057x + 101.445，其线性相关系数为0.995（图5中的B），通过计算得到PTBI对HClO的检测限为46.5 nM，这表明PTBI对次氯酸的检测具有非常高的灵敏度。
三、苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物PTBI在水相体系中检测SO2
1、PTBI对SO2的选择性检测
配置初浓度为3 mM的PTBI，30 mM的各种分析物，包括活性氧、活性氮、氨基酸、阴离子和阳离子溶液。向荧光比色皿中加入2.98mLPBS缓冲液（pH = 7.4，含10%乙腈）和10 μLPTBI，再分别加入10 μL分析物，测定350-620 nm（λex= 325 nm）波长范围内的荧光光谱，并建立475 nm处荧光强度与不同物质间的柱状图，图6中1-28号分别是HSO3 -,ONOO-,HO•,1O2,H2O2, O2 −•,t-BuOOH, NO, Cys, Hcy, GSH, L-Ser, DL-Met, L-Phe, L-Lys, L-Leu, L-Pro, L-His,S2-, NO3 -, NO2 -, OAc-, SO4 2-, PO4 3-, K+, Zn2+, Cu2+, Na+。如图6所示，只有HSO3 -的加入可以使PTBI在475 nm处的荧光强度显著增强，其它活性氧、活性氮、氨基酸、阴离子和阳离子均不能引起PTBI 475 nm处荧光信号的改变，特别是亲核性离子S2-对HSO3 -的检测没有任何影响。因此，PTBI能够实现对SO2的选择性检测。
2、PTBI对不同浓度亚硫酸氢钠的响应性
配置初浓度为3 mM的PTBI，分别向荧光比色皿中加入2.98 mL PBS缓冲液（pH =7.4，含10%乙腈）、10 μLPTBI和10 μL不同浓度的亚硫酸氢钠，混合均匀并反应1min后，测定350-620nm范围内荧光光谱的变化（λex= 325 nm，λem= 475 nm），结果如图7所示。从图7中的A可以得出，PTBI分子本身在475 nm处几乎没有荧光发射，随着亚硫酸氢钠浓度的增加，475nm处的荧光强度逐渐增强，这说明PTBI能够高效地响应SO2。
以亚硫酸氢钠浓度为横坐标，475 nm波长下的荧光强度为纵坐标得到亚硫酸氢钠浓度在0~14 μM范围内的线性方程Y = 71.44x + 193.742（图7中的B），通过计算得PTBI对亚硫酸氢钠的检测限为52.9nM，这表明PTBI对SO2的检测具有很好的灵敏度。
四、机理分析
本发明苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物由吩噻嗪和苯并吲哚盐共轭连接组成，其中吩噻嗪骨架中的硫原子能够被HClO专一地氧化为亚砜结构，并在590 nm处表现出强的荧光发射，从而实现对HClO的选择性检测；苯并吲哚盐单元的强拉电子作用，易与亲核性的SO2发生Michael加成反应，破坏分子的共轭结构，并在475 nm处出现强的荧光发射，实现了对SO2的选择性检测。
五、苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物PTBI检测细胞内HClO和SO2的应用
1、PTBI的线粒体靶向能力
将处于对数期生长的HeLa接种于六孔板内，于37℃培养箱（含5% CO2）培养过夜后更换新鲜培养基，用HClO（200 μM）和PTBI（5μM）孵育细胞30min，再与市售的线粒体绿色染料Mito-tracker Green（500 nM）孵育细胞30min，随后PBS缓冲液清洗细胞3次，用荧光显微镜进行细胞成像。实验结果如图8所示，PTBI的红色荧光与Mito-tracker Green的绿色荧光完全重叠，说明PTBI能够有效定位至线粒体内。
2、PTBI对细胞内HClO和SO2的检测
将处于对数期生长的HeLa接种于六孔板内，于37℃培养箱（含5% CO2）培养过夜后更换新鲜培养基，分别用（A）PTBI（5μM）孵育细胞30min；（B）HClO（200 μM）孵育细胞30 min，再加入PTBI（5μM）孵育细胞30 min；（C）HSO3 -（200 μM）孵育细胞30 min，再加入PTBI（5μM）孵育细胞30 min；随后PBS缓冲液清洗细胞3次，用荧光显微镜观测红色和蓝色通道荧光信号的变化，结果如图9所示。从图9可以得出，PTBI单独孵育HeLa细胞后，红色和蓝色通道出现较弱的荧光信号，当分别用HClO和HSO3 -孵育细胞后，红色和蓝色通道的荧光均明显增强，这说明本发明所提供的PTBI能够实现对细胞内HClO和SO2的检测。
3、PTBI监测HClO/SO2诱导的线粒体应激及其动态平衡
将处于对数期生长的HeLa细胞接种于六孔板内，于37℃培养箱（含5% CO2）培养过夜后更换新鲜培养基，分别用（A）PTBI（5μM）孵育细胞30 min；（B）NaHSO3（400 μM）孵育细胞1 h，PTBI（5μM）孵育细胞30 min；（C）HClO（400 μM）孵育细胞1 h，PTBI（5μM）孵育细胞30min；随后PBS缓冲液清洗细胞3次，用荧光显微镜观测蓝色和红色通道荧光信号的变化，结果如图10所示。从图10可以得出，当用NaHSO3孵育细胞后，蓝色通道的荧光相比于PTBI单独孵育组明显增强，而且红色通道的荧光也显著增强，这说明该过程中产生了HClO。该结果表明过量SO2诱导的线粒体应激能够促进HClO的产生。当用HClO孵育细胞后，红色通道的荧光明显增强，同时蓝色通道的荧光也轻微增强，说明该过程中产生了SO2。该结果表明过量HClO能够诱导线粒体氧化应激，并伴随着抗氧化剂SO2的产生，以减轻对细胞的氧化损伤。
4、PTBI监测斑马鱼体内HClO和SO2的动力学相互作用
将脱卵培养5天的斑马鱼分为六组，分别放入六孔板中。（A）PTBI（5 μM）孵育斑马鱼30 min；（B）HClO（400 μM）孵育斑马鱼1h，PTBI（5 μM）孵育斑马鱼30 min；（C）LPS（1 μg/mL）孵育斑马鱼30min，PTBI（5 μM）孵育斑马鱼30 min；（D）NaHSO3（400 μM）孵育斑马鱼1h，PTBI（5 μM）孵育斑马鱼30 min；然后用培养液清洗斑马鱼3次，麻醉剂将其麻醉后，荧光显微镜下成像，结果如图11所示。由图11可以看出，PTBI处理斑马鱼后，红色和蓝色通道呈现出微弱的荧光信号，当用HClO和LPS孵育斑马鱼后，红色通道的荧光显著增强，同时蓝色通道的荧光信号也轻微增强，说明过量HClO诱导的应激反应可导致体内抗氧化剂SO2的产生，以维持其氧化还原稳态。当用NaHSO3孵育斑马鱼后，观测到蓝色通道荧光增强，但红色通道的荧光几乎消失，这说明SO2作为抗氧化剂能够清除体内的HClO。
综上所述，本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：
本发明提供的苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物PTBI合成便捷，由便宜易得的原料吩噻嗪和苯并吲哚衍生物经四步反应得到，PTBI具有双反应位点、检测灵敏度高和斯托克斯位移大的优势，对HClO和SO2的检测具有高度的选择性，且两者的荧光检测信号互不干扰。该探针分子不仅能够监测胞内的HClO和SO2，同时能够监测HClO和SO2诱导的线粒体应激及其动力学平衡，该探针还实现了监测斑马鱼体内HClO和SO2的动力学相互作用，并阐明了细胞水平和斑马鱼中HClO和SO2所扮演的生理角色。因此，该苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物对相关疾病的诊断和治疗具有重要意义。
附图说明
图1是苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物的1H NMR图谱；
图2是苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物的13C NMR图谱；
图3是苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物的高分辨质谱图；
图4是苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物选择性检测次氯酸的荧光光谱图；
图5是苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物在不同浓度次氯酸条件下的荧光光谱图；
图6是苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物选择性检测二氧化硫的荧光光谱图；
图7是苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物在不同浓度亚硫酸氢钠条件下的荧光光谱图；
图8是苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物靶向线粒体的荧光成像；
图9是苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物检测细胞内次氯酸和二氧化硫的荧光成像；
图10是苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物检测次氯酸和二氧化硫诱导的线粒体应激及其动力学平衡的荧光成像；
图11是苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物检测斑马鱼体内次氯酸和二氧化硫的动力学相互作用的荧光成像。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。
实施例1 苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物的合成
（1）10-正丁基吩噻嗪的合成
冰浴条件下，将氢化钠（45mmol，1.08g）慢慢加入吩噻嗪（15mmol，3g）的N,N-二甲基甲酰胺（10mL）中，将该反应体系于常温反应1h后，再将溴丁烷（18mmol，2mL）慢慢滴加至上述反应体系，随后在70℃反应3 h后将其冷却至室温，慢慢加冰水淬灭，乙酸乙酯萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥，减压除去有机溶剂，所得样品经柱层析分离（石油醚为洗脱剂）得无色油状液体10-正丁基吩噻嗪（化合物1），产率86%。
（2）10-正丁基吩噻嗪-3-甲醛的合成：
氩气氛围和冰浴条件下，将DMF（6mmol，0.464mL）加入POCl3（6mmol，0.559mL）中，得到的反应体系于冰浴下反应15min后，将化合物1（2mmol，0.57mg）的DMF（2mL）溶液慢慢滴加至上述反应体系中，随后于60℃反应4 h，将反应体系冷却至室温后，倒入冰水中，饱和碳酸氢钠中和，二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，减压除去有机溶剂，所得样品经柱层析分离（石油醚：乙酸乙酯 = 20:1）得黄色固体10-正丁基吩噻嗪-3-甲醛（化合物2），产率75%。
（3）1,1,2,3-四甲基苯-1H-苯并[e]吲哚-3-碘化盐的合成：
将1,1,2-三甲基苯-1H-苯并[e]吲哚（5mmol，1.046g）溶于乙腈（10mL）中，加入碘甲烷（10mmol，0.62mL），将反应体系于70℃回流12h后，冷却至室温，将得到的沉淀抽滤，乙腈洗涤，干燥得白色固体1,1,2,3-四甲基苯-1H-苯并[e]吲哚-3-碘化盐（化合物3）。
（4）PTBI的合成：
将化合物2（1mmol，283mg）和化合物3（1mmol，224mg）溶于乙醇（5mL）中，再将哌啶（50 μL）加入反应混合物中，于85℃回流反应12h后，减压除去有机溶剂，所得样品经柱层析分离（二氯甲烷：乙醇 =50:1）得深蓝色固体的目标产物PTBI，产率71%。
其氢谱谱图如图1：1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 8.41 (d,J= 3.6 Hz, 1H),8.38 (d,J= 11.6 Hz, 1H), 8.27 (d,J= 9.2 Hz, 1H), 8.20 (d,J= 8.0 Hz, 1H), 8.11– 8.05 (m, 3H), 7.79 (t,J= 7.8 Hz, 1H), 7.70 (t,J= 7.6 Hz, 1H), 7.56 (d,J=16.4 Hz, 1H), 7.25 (t,J= 7.8 Hz, 1H), 7.19 (d,J= 8.4 Hz, 2H), 7.13 (d,J= 8.0Hz, 1H), 7.03 (t,J= 7.6 Hz, 1H), 4.24 (s, 3H), 4.01 (t,J= 7.0 Hz, 2H), 1.99(s, 6H), 1.74 – 1.64 (m, 2H), 1.48 – 1.38 (m, 2H), 0.90 (t,J= 7.2 Hz, 3H).
其碳谱谱图如图2：13C NMR(101 MHz, DMSO-d6) δ 181.31, 150.28, 148.54,142.10, 137.07, 132.47, 131.56, 130.24, 129.48, 128.38, 127.82, 127.59,127.51, 126.75,126.39, 126.16, 123.21, 123.05, 122.56, 121.65, 116.12,115.20, 112.64, 109.33, 98.99, 52.88, 46.19, 34.17, 27.77, 24.79, 18.74,13.08.
其高分辨质谱谱图如图3：HRMS (ESI) m/z calcd for C33H33N2S (M):489.2359. Found: 489.2355, error: 0.8 ppm.
实施例2、苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物PTBI对HClO的检测
向荧光比色皿中加入2.98mL PBS缓冲液（pH = 7.4，含10%乙腈）和10 μLPTBI（3mM），再分别加入10 μLHClO, ONOO-, HO•,1O2, H2O2, O2 −•,t-BuOOH, NO, Cys, Hcy, GSH,L-Ser, DL-Met, L-Phe, L-Lys, L-Leu, L-Pro, L-His, S2-, NO3 -, NO2 -, OAc-, SO4 2-,PO4 3-, K+, Zn2+, Cu2+, Na+（30 mM）。若PTBI的PBS缓冲液在590 nm处的荧光强度显著增强，说明加入的是HClO；若PTBI的PBS缓冲液在590 nm处的荧光强度没有发生明显变化，说明加入的不是HClO。
实施例3、苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物PTBI对SO2的检测
向荧光比色皿中加入2.98mLPBS缓冲液（pH = 7.4，含10%乙腈）和10 μLPTBI（3mM），再分别加入10 μLHSO3 -, ONOO-,HO•,1O2, H2O2, O2 −•,t-BuOOH, NO, Cys, Hcy, GSH,L-Ser, DL-Met, L-Phe, L-Lys, L-Leu, L-Pro, L-His,S2-, NO3 -, NO2 -, OAc-, SO4 2-,PO4 3-, K+, Zn2+, Cu2+, Na+（30 mM）。若PTBI的PBS缓冲液在475 nm处的荧光强度显著增强，说明加入的是HSO3 -；若PTBI的PBS缓冲液在475 nm处的荧光强度没有发生明显变化，说明加入的不是HSO3 -。
Claims (6)
1.一种苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物，其结构式如下：
。
2.如权利要求1所述的一种苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物的合成方法，包括如下步骤：
（1）冰浴条件下，将氢化钠加入吩噻嗪的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，于常温下反应0.5~1.5h后将溴丁烷滴加至该反应体系中，在65~75℃下反应2~4 h，反应结束后将其冷却至室温，加冰水淬灭反应，乙酸乙酯萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥，减压旋干，柱层析分离提纯得10-正丁基吩噻嗪；吩噻嗪与氢化钠的摩尔比为1:2~1:4；吩噻嗪与溴丁烷的摩尔比为1:1~1:2；
（2）氩气氛围和冰浴条件下，将N,N-二甲基甲酰胺加入三氯氧磷中，于冰浴下反应15~20 min，随后将10-正丁基吩噻嗪的DMF溶液滴加至该反应混合物中，于55~65℃油浴反应3~4h，反应结束后将其冷却至室温并倒入冰水中，用饱和碳酸氢钠中和，二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，减压旋干并柱层析分离提纯得10-正丁基吩噻嗪-3-甲醛；
（3）将1,1,2-三甲基苯-1H-苯并[e]吲哚溶于乙腈中，加入碘甲烷，于65~75℃下回流反应10~12h，反应结束后将反应体系冷却至室温，将得到的沉淀抽滤，洗涤，得到1,1,2,3-四甲基苯-1H-苯并[e]吲哚-3-碘化盐；三氯氧磷和N,N-二甲基甲酰胺的摩尔比为1:1~1:2；10-正丁基吩噻嗪与三氯氧磷的摩尔比为1:3~1:5；1,1,2-三甲基苯-1H-苯并[e]吲哚与碘甲烷的摩尔比为1:2~1:3；
（4）将10-正丁基吩噻嗪-3-甲醛和1,1,2,3-四甲基苯-1H-苯并[e]吲哚-3-碘化盐溶于乙醇中，加入哌啶，于80~90℃加热回流反应10~12h，反应结束后，减压旋干溶剂，柱层析分离提纯得目标产物苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物；10-正丁基吩噻嗪-3-甲醛和1,1,2,3-四甲基苯-1H-苯并[e]吲哚-3-碘化盐的摩尔比为1:1~1:2；10-正丁基吩噻嗪-3-甲醛与哌啶的摩尔比1:1~1:2。
3.如权利要求1所述的苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物在水相体系中检测HClO的应用，其特征在于：在苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物的PBS缓冲液中，分别加入HClO, ONOO-, HO•, 1O2,H2O2, O2 −•, t-BuOOH, NO, Cys, Hcy, GSH, L-Ser, DL-Met, L-Phe, L-Lys, L-Leu, L-Pro, L-His, S2-, NO3 -, NO2 -, OAc-, SO4 2-, PO4 3-, K+, Zn2+, Cu2+, Na+，只有HClO能够使苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物的PBS缓冲液在590 nm处的荧光强度显著增强；PBS缓冲液中，乙腈的体积分数为10%，pH = 7.4。
4.如权利要求1所述的苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物在水相体系中检测SO2的应用，其特征在于：在苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物的PBS缓冲液中，分别加入HSO3 -,ONOO-,HO•, 1O2, H2O2,O2 −•,t-BuOOH, NO, Cys, Hcy, GSH, L-Ser, DL-Met, L-Phe, L-Lys, L-Leu, L-Pro, L-His,S2-, NO3 -, NO2 -, OAc-, SO4 2-, PO4 3-, K+, Zn2+, Cu2+, Na+，只有HSO3 -能够使苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物的PBS缓冲液在475 nm处的荧光强度显著增强；PBS缓冲液中，乙腈的体积分数为10%，pH = 7.4。
5.如权利要求1所述的苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物以非诊断或治疗为目的在细胞中检测HClO的应用。
6.如权利要求1所述的苯并吲哚盐-吩噻嗪衍生物以非诊断或治疗为目的在细胞中检测SO2的应用。
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