CN111778014A - β-半乳糖苷酶近红外荧光探针及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物检测技术领域，涉及小分子荧光探针，具体涉及一类β‑半乳糖苷酶近红外荧光探针，尤其是氟硼二吡咯BODIPYβ‑半乳糖苷酶荧光探针及制备方法和在制备用于衰老细胞成像制剂中的用途。本发明的荧光探针可根据所述反应机制，即β‑半乳糖基水解、分子内自消除机理实现对β‑半乳糖苷酶的检测，且生物毒性较低，其光物理活性稳定，对β‑半乳糖苷酶响应的灵敏度高，可用于制备衰老细胞的特异性荧光成像的检测制剂。
Description
技术领域
本发明属生物检测技术领域，涉及小分子荧光探针，具体涉及一类β-半乳糖苷酶近红外荧光探针及制备方法和在制备用于衰老细胞成像制剂中的用途。
背景技术
现有技术公开了细胞衰老是指细胞在执行生命活动过程中，随着时间的推移，细胞增殖与分化能力和生理功能逐渐发生衰退的变化过程，细胞衰老是机体衰老和死亡的基础。研究显示，细胞衰老与多种老年性疾病如动脉粥样硬化、血管瘤、炎症疾病、肿瘤等有关。面临人口老化进程加快和人口寿命普遍提高的趋势，保障老年人享有良好的健康和较高的生活质量已成为社会科学和生命科学共同关注的重大问题，因此，开展衰老生物学和延缓衰老的研究具有重要的科学意义和社会价值，开发新的监测衰老细胞和生物体衰老状态的方法对医学诊断具有重要意义。
研究表明细胞在衰老状态下β-半乳糖苷酶出现过表达，因此，研究者认为β- 半乳糖苷酶可作为衡量细胞衰老状态的重要指标，对β-半乳糖苷酶的检测可在一定程度上反映生物体系的衰老状态。
荧光分析法具有高灵敏度、高选择性、高时空分辨率、操作简单并可实现对生物活性分子原位无损伤、实时快速的可视化成像等优点，已成为近年来的研究热点。目前，已有多种β-半乳糖苷酶荧光探针被陆续报道，但实践证实，现已存在的β-半乳糖苷酶探针仍然是水解反应后的电子推拉效应设计的，基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供新型反应机制的β-半乳糖苷酶探针及其制备方法和用途。
发明内容
基于现有技术的现状以及针对现有技术存在的问题，本发明的第一个目的是提供一类具有新型反应机制的β-半乳糖苷酶荧光探针，更具体的，涉及一种氟硼二吡咯(BODIPY)β-半乳糖苷酶荧光探针。
本发明第二个目的提供所述β-半乳糖苷酶荧光探针的制备方法。
本发明第三个目的提供所述荧光探针在制备对β-半乳糖苷酶实现高选择性和高灵敏度的检测制剂中的用途。
本发明的进一步目的是提供所述β-半乳糖苷酶荧光探针在制备用于衰老血管平滑肌细胞的荧光成像检测制剂中的用途。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明的基于新型反应机制的β-半乳糖苷酶荧光探针，其特征在于，β-半乳糖苷酶检测的识别基团为对-β-半乳糖基苄硫醚，其结构为：
所述得荧光基团为氟硼二吡咯类染料，其结构为：
本发明所述基于新型反应机制的β-半乳糖苷酶探针其结构为：
本发明所述β-半乳糖苷酶探针的合成路线为：
通过如下方法和步骤制备：
1)向化合物B的巯基乙酸溶液中加入三氟化硼乙醚溶液，室温反应，TLC 监测至反应结束，将溶液用乙酸乙酯稀释，用饱和食盐水洗，有机相经硅胶柱层析得黄色油状化合物C；
2)化合物C和α-D-五乙酰半乳糖的混合物用DMF溶解，加入三氟化硼乙醚溶液，室温反应，TLC监测至反应结束，将溶液用乙酸乙酯稀释，用饱和食盐水洗，有机相经硅胶柱层析得无水油状化合物D；
3)化合物D溶于甲醇，加入甲醇钠，TLC监测至反应结束，加入阳离子交换树脂调PH＝7，过滤，浓缩得化合物白色固体E；
4)化合物E和化合物A溶于DMSO，加入三乙胺，室温反应，TLC监测至反应结束，经硅胶柱层析得化合物F；
5.化合物F溶于吡啶，加入三乙胺，分别和化合物G、H、I在80℃反应， TLC监测至反应结束，经硅胶柱层析得通式(1)探针。
本发明的实施例中按上述方法制得基于新型反应机制的β-半乳糖苷酶荧光探针，优选制得探针C-1，探针C-2，探针C-3，其中，
探针C-1结构为：
经检测，本发明的探针C-1的水溶性好，在PBS(10mM，pH7.4)缓冲溶液中，室温下可实现对β-半乳糖苷酶的检测识别，对β-半乳糖苷酶的响应速度快，反应时间30min，对β-半乳糖苷酶的响应为荧光增强型或比率型；其识别机理如下：
荧光探针分子中β-半乳糖基被酶水解，暴露出酚羟基，酚羟基发生分子内自消除，进一步生成荧光染料；
所述的β-半乳糖苷酶荧光探针C-1的特点为：可根据所述反应机制，即β- 半乳糖基水解、分子内自消除机理实现对β-半乳糖苷酶的检测，其反应前紫外最大吸收为488nm，激发波长为488nm，荧光最大发射为574nm，其反应后紫外最大吸收为651nm，激发波长为651nm，荧光最大发射为727nm，所述β-半乳糖苷酶荧光探针C-1本身可被激发出574nm的荧光，在37℃下，30％DMSO的 PBS缓冲液中，加入β-半乳糖苷酶后，574nm处的荧光降低为原来的60％，727 nm处荧光增强为原来的34.8倍；
所述β-半乳糖苷酶荧光探针C-1在各种分析物，如无机盐、氨基酸、氧化剂、还原剂、维生素、硫醇、其他生物活性酶存在下不受干扰，可实现对β-半乳糖苷酶的特异性检测；所述β-半乳糖苷酶探针C-1的生物毒性较低，可用于制备实现衰老细胞的特异性荧光成像的检测制剂。
探针C-2结构为：
经检测，本发明探针C-2的水溶性好，在PBS(10mM，pH7.4)缓冲溶液中，室温下可实现对β-半乳糖苷酶的检测识别，对β-半乳糖苷酶的响应速度快，反应时间60min，对β-半乳糖苷酶的响应为荧光增强型或比率型；
其识别机理如下：
荧光探针分子中β-半乳糖基被酶水解，暴露出酚羟基，酚羟基发生分子内自消除，进一步生成荧光染料；
本发明所述的β-半乳糖苷酶荧光探针C-2的特点为：
可根据所述反应机制，即β-半乳糖基水解、分子内自消除机理实现对β-半乳糖苷酶的检测；其反应前紫外最大吸收为535nm，激发波长为535nm，荧光最大发射为638nm，其反应后紫外最大吸收为670nm，激发波长为670nm，荧光最大发射为722nm；所述β-半乳糖苷酶荧光探针C-2本身可被激发出638nm 的荧光，在37℃下，30％DMSO的PBS缓冲液中，加入β-半乳糖苷酶后，638nm 处的荧光降低为原来的80％，722nm处荧光增强为原来的50.0倍；该β-半乳糖苷酶探针C-2的生物毒性较低，可用于制备实现衰老细胞的特异性荧光成像的检测制剂。
探针C-3结构为：
经检测，本发明的探针C-3的水溶性好，在PBS(10mM，pH7.4)缓冲溶液中，室温下可实现对β-半乳糖苷酶的检测识别，对β-半乳糖苷酶的响应速度快，反应时间20min，对β-半乳糖苷酶的响应为荧光增强型或比率型；
其识别机理如下：
荧光探针分子中β-半乳糖基被酶水解，暴露出酚羟基，酚羟基发生分子内自消除，进一步生成荧光染料；
本发明的β-半乳糖苷酶荧光探针C-3的特点为：
可根据所述反应机制，即β-半乳糖基水解、分子内自消除机理实现对β-半乳糖苷酶的检测，其反应前紫外最大吸收为533nm，激发波长为533nm，荧光最大发射为603nm，其反应后紫外最大吸收为721nm，激发波长为721nm，荧光最大发射为850nm，所述β-半乳糖苷酶荧光探针C-3本身可被激发出603nm 的荧光，在37℃下，30％DMSO的PBS缓冲液中，加入β-半乳糖苷酶后，603nm 处的荧光降低为原来的18％，850nm处荧光增强为原来的43.3倍；所述β-半乳糖苷酶探针C-3的生物毒性较低，可实现衰老细胞的特异性荧光成像检测。
本发明提供了氟硼二吡咯(BODIPY)β-半乳糖苷酶荧光探针及其制备方法和在用于制备衰老血管平滑肌细胞的荧光成像检测制剂中的用途，本发明的荧光探针光物理活性稳定，对β-半乳糖苷酶响应的灵敏度高。
附图说明
图1为探针C-1的核磁1H NMR图谱；
图2为探针C-1的核磁13C NMR图谱；
图3为探针C-1与β-半乳糖苷酶反应前后的紫外吸收光谱图；
图4为探针C-1与β-半乳糖苷酶前后的荧光发射光谱图；
图5为探针C-1与β-半乳糖苷酶反应的动力学实验图；
图6为探针C-1与不同浓度β-半乳糖苷酶反应的浓度滴定实验结果图；
图7为探针C-1与不同浓度β-半乳糖苷酶反应的浓度滴定实验结果图；
图8为探针C-1与β-半乳糖苷酶及各种干扰物质反应的选择性结果图；
图9为探针C-2的核磁1H NMR图谱；
图10为探针C-2的核磁13C NMR图谱；
图11为探针C-2与β-半乳糖苷酶反应前后的紫外吸收光谱图；
图12为探针C-2与β-半乳糖苷酶前后的荧光发射光谱图；
图13为探针C-2与β-半乳糖苷酶反应的动力学实验图；
图14为探针C-3的核磁1H NMR图谱；
图15为探针C-3的核磁13C NMR图谱；
图16为探针C-3与β-半乳糖苷酶反应前后的紫外吸收光谱图；
图17为探针C-3与β-半乳糖苷酶前后的荧光发射光谱图；
图18为探针C-3与β-半乳糖苷酶反应的动力学实验图；
图19为探针C-1衰老血管平滑肌细胞的荧光成像图。
具体实施方式
下面通过实施例和附图对本发明进行说明，但本发明的内容不受具体实施例的限制。
实施例1.
合成探针通式(1)，其结构为：
探针的合成工艺为：
1)制备化合物C：
向化合物B(12g，96mmol)的巯基乙酸溶液(30mL)中加入三氟化硼乙醚溶液(1.8mL，13.2mmol)，室温反应3h，TLC监测至反应结束。将溶液用乙酸乙酯稀释，用饱和食盐水洗，有机相经硅胶柱层析得黄色油状化合物C(14g，80％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ2.27(s，3H)，3.99(s，2H)，5.66(s，1H)，6.98(d，J＝8.1Hz， 2H)，7.07(d，J＝8.1Hz，2H).ESI-MScalculated for C9H10NaO2S+[M+Na]+：205.03， found：205.1.
2)制备化合物D：
化合物C(11.7g，64mmol)和A-D-五乙酰半乳糖(12.5g，32mmol)的混合物用 DMF(100ml)溶解，加入三氟化硼乙醚溶液(10mL，64mmol)，室温反应， TLC监测至反应结束。将溶液用乙酸乙酯稀释，用饱和食盐水洗，有机相经硅胶柱层析得无水油状化合物D(7.4g，45％)。1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ7.25 (d，J＝8.6Hz，2H)，6.92(d，J＝8.6Hz，2H)，5.42(d，J＝7.9Hz，1H)，5.33(d，J＝3.5 Hz，1H)，5.27(dd，J＝10.4，3.5Hz，1H)，5.19(dd，J＝10.3，7.9Hz，1H)，4.41(t，J＝ 6.4Hz，1H)，4.09(dd，J＝6.4，3.8Hz，2H)，4.07(s，2H)，2.34(s，3H)，2.14(s，3H)， 2.03(s，3H)，2.00(s，3H)，1.94(s，3H).13C NMR(151MHz，DMSO-d6)δ194.83， 169.97，169.83，169.55，169.21，155.55，132.29，130.01，116.47，97.78，70.30，70.13， 68.33，67.20，61.28，39.52，31.83，30.27，20.47，20.43，20.39，20.34.ESI-MScalculated for C23H28NaO11S+[M+Na]+：535.12，found：535.2.
3)制备化合物E：
化合物D(5.12g，10mmol)溶于甲醇100ml，加入甲醇钠3g，TLC监测至反应结束。加入阳离子交换树脂调PH＝7，过滤，浓缩得化合物白色固体E(2.37g， 78.5％)。ESI-MScalculated for C13H18NaO6S+[M+Na]+：325.07，found：325.1.
4)制备化合物F：
化合物E(950mg，3.12mmol)和化合物A(400mg，1.04mmol)溶于DMSO 30 mL，加入三乙胺(145μl，1.04mmol)，室温反应，TLC监测至反应结束，经硅胶柱层析得黄色固体化合物F(358mg，49.2％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.94(s， 1H)，7.39(m，3H)，7.20(m，2H)，6.83(d，J＝8.1Hz，2H)，6.76(d，J＝8.1Hz，2H)， 6.45(s，1H)，4.73(m，1H)，4.48(m，1H)，4.38(m，1H)，4.20(m，1H)，4.00(m，2H)， 3.62(m，2H)，3.40(m，1H)，2.67(s，3H)，2.32(q，J＝7.4Hz，2H)，1.39(s，3H)，0.97(t， J＝7.4Hz，3H).ESI-MS calculated for C33H35BF2N2O7S[M+H]+：652.22，found： 652.3.
5)制备探针C-1：
化合物F(300mg，0.46mmol)和化合物G(92mg，1.38mmol)溶于吡啶，加入三乙胺(145μl，1.04mmol)，80℃反应，TLC监测至反应结束，经硅胶柱层析得探针C-1(150mg，46.5％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ7.65-7.41(m，6H)，7.02 (d，J＝8.3Hz，2H)，6.92(d，J＝8.0Hz，2H)，6.81(s，1H)，5.15(m，1H)，4.91(m，1H)， 4.76(m，1H)，4.64(m，1H)，4.53(m，1H)，4.11(m，2H)，3.52(m，4H)，2.73(s，3H)， 2.43(q，J＝7.4Hz，2H)，1.49(s，3H)，1.01(s，J＝7.4Hz，3H).12C NMR(151MHz， DMSO-d6)，δ171.13，157.31，151.45，145.10，144.28，140.12，138.94，137.05，136.21， 131.95，130.27，130.15，129.92，129.68，128.85，128.80，127.10，118.92，116.46， 114.51，113.49，101.53，75.44，73.31，70.25，67.95，62.81，60.13，41.25，40.05，39.52， 16.57，14.05，13.61，12.37.HRMS(ESI，m/z)：calculated forC36H35BF2N4NaO6S+ [M+Na]+：723.2231，found：723.2222.
5)制备探针C-2：
化合物F(300mg，0.46mmol)和化合物H(155mg，1.38mmol)溶于吡啶，加入三乙胺(145μl，1.04mmol)，80℃反应，TLC监测至反应结束，经硅胶柱层析得探针C-2(130mg，38.1％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ7.61(d，3H)，7.49(d，2H)， 7.12(s，1H)，7.07(d，J＝8.3Hz，2H)，6.86(d，J＝8.3Hz，2H)，6.70(s，1H)，5.16(d，J ＝5.0Hz，1H)，4.88(d，J＝5.0Hz，1H)，4.66(d，2H)，4.51(d，1H)，4.17-4.09(m， 3H)，3.68(s，1H)，3.51(m，4H)，3.16(d，2H)，3.01(s，3H)，2.67(s，3H)，2.40(d，2H)， 2.12(s，3H)，1.44(s，3H)，1.00(t，J＝7.4Hz，3H).13C NMR(151MHz，DMSO-d6)δ 169.23，166.99，162.18，156.78，143.28，142.99，139.95，138.28，137.23，136.09， 134.62，132.84，129.94，129.44，128.92，128.74，124.49，116.55，116.17，101.05， 79.19，78.97，78.75，75.43，73.32，70.22，68.05，60.29，54.90，48.62，41.25，39.52， 26.19，16.53，15.40，13.83，13.61，12.17.ESI-MScalculated for C38H42BF2N4O7S+ [M+H]+：747.3，found：747.3.
5)制备探针C-3：
化合物F(300mg，0.46mmol)和化合物I(368mg，1.38mmol)溶于吡啶，加入三乙胺(145μl，1.04mmol)，80℃反应，TLC监测至反应结束，经硅胶柱层析得探针C-2(104mg，25.1％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ7.88(d，1H)，7.80(m，2H)， 7.65(m，3H)，7.57(m，4H)，7.25(d，1H)，7.13(s，1H)，7.01(d，J＝8.0Hz，2H)，6.85 (d，J＝8.0Hz，2H)，5.07(d，1H)，4.87(s，1H)，4.68(d，1H)，4.58(s，1H)，4.47(s，3H)， 4.25(s，2H)，3.63(s，1H)，3.16(s，2H)，2.74(s，3H)，2.44(q，2H)，1.52(s，3H)，1.49(s， 3H)，1.43(s，3H)，1.31(q，3H)，1.02(q，3H).13C NMR(151MHz，DMSO-d6)δ 180.85，169.86，156.80，145.99，144.93，144.04，143.17，140.33，139.78，139.55， 137.43，135.97，132.31，131.17，130.58，130.12，129.76，129.04，129.00，128.91， 128.83，122.94，120.62，116.18，114.64，109.96，100.61，75.30，73.22，70.11，67.87， 67.23，67.15，60.12，51.64，48.57，41.67，41.10，40.06，39.52，26.20，26.15，19.96， 16.52，13.89，13.63，13.52，12.14.ESI-MScalculated for C46H51BF2N3O6S+[M]+： 822.4，found：822.4.
实施例2 探针C-1与β-半乳糖苷酶反应前后的紫外吸收光谱图变化
配制30％DMSO的PBS溶液，现配现用；将探针配制成1mM的乙腈溶液，备用；将β-半乳糖苷酶(1mg，1580u/mg)用去离子水配制成1000u/mL的储备液，分装-20℃储存，备用，在3mL的石英比色皿中加入3mL 30％DMSO的PBS (pH 7.4，50mM)缓冲溶液，再依次加入10μL的探针，14μL的β-半乳糖苷酶， 37℃下反应30min，测量其吸收光谱，由图3看出，探针C-1在反应后，488nm 处的紫外最大吸收强度变弱，651nm处的紫外最大吸收强度变强。
实施例3.探针C-1与β-半乳糖苷酶反应前后的荧光发射光谱变化
在3mL的石英比色皿中加入3mL 30％DMSO的PBS(pH 7.4，50mM)缓冲溶液，再依次加入10μL的探针，14μL的β-半乳糖苷酶，37℃下反应30min，测量其吸收光谱，37℃下反应300min，测量其荧光发射光谱，激发波长488m，激发狭缝宽5nm，发射狭缝宽5nm，增益700V；激发波长651nm，激发狭缝宽 10nm，发射狭缝宽10nm，增益700V，图4显示了加入β-半乳糖苷酶后，574nm 处的荧光降低为原来的60％，727nm处荧光增强为原来的34.8倍。
实施例4.探针C-2与β-半乳糖苷酶反应前后的紫外吸收光谱图变化
配制30％DMSO的PBS溶液，现配现用；将探针配制成1mM的乙腈溶液，备用；将β-半乳糖苷酶(1mg，1580u/mg)用去离子水配制成1000u/mL的储备液，分装-20℃储存，备用，在3mL的石英比色皿中加入3mL 30％DMSO的PBS (pH 7.4，50mM)缓冲溶液，再依次加入10μL的探针，14μL的β-半乳糖苷酶， 37℃下反应30min，测量其吸收光谱，如图3所示，探针C-2在反应后，535nm 处的紫外最大吸收强度变弱，670nm处的紫外最大吸收强度变强。
实施例5 探针C-2与β-半乳糖苷酶反应前后的荧光发射光谱变化
在3mL的石英比色皿中加入3mL 30％DMSO的PBS(pH 7.4，50mM)缓冲溶液，再依次加入10μL的探针，14μL的β-半乳糖苷酶，37℃下反应30min，测量其吸收光谱，37℃下反应300min，测量其荧光发射光谱。激发波长535nm，激发狭缝宽5nm，发射狭缝宽5nm，增益700V；激发波长670nm，激发狭缝宽 10nm，发射狭缝宽10nm，增益700V，图4显示，加入β-半乳糖苷酶后，638nm 处的荧光降低为原来的80％，722nm处荧光增强为原来的50.0倍。
实施例6.探针C-3与β-半乳糖苷酶反应前后的紫外吸收光谱图变化
配制30％DMSO的PBS溶液，将探针配制成1mM的乙腈溶液，备用；将β-半乳糖苷酶(1mg，1580u/mg)用去离子水配制成1000u/mL的储备液，分装 -20℃储存，备用，在3mL的石英比色皿中加入3mL 30％DMSO的PBS(pH 7.4， 50mM)缓冲溶液，再依次加入10μL的探针，14μL的β-半乳糖苷酶，37℃下反应30min，测量其吸收光谱，图3显示，探针C-3在反应后，533nm处的紫外最大吸收强度变弱，721nm处的紫外最大吸收强度变强。
实施例7.探针C-3与β-半乳糖苷酶反应前后的荧光发射光谱变化
在3mL的石英比色皿中加入3mL 30％DMSO的PBS(pH 7.4，50mM)缓冲溶液，再依次加入10μL的探针，14μL的β-半乳糖苷酶。37℃下反应30min，测量其吸收光谱，37℃下反应300min，测量其荧光发射光谱。激发波长533nm，激发狭缝宽5nm，发射狭缝宽5nm，增益700V；激发波长721nm，激发狭缝宽 10nm，发射狭缝宽10nm，增益700V，图4显示，加入β-半乳糖苷酶后，603nm 处的荧光降低为原来的18％，850nm处荧光增强为原来的43.3倍。
实施例8.探针C-1(10μM)与β-半乳糖苷酶反应的动力学实验
在3mL的石英比色皿中加入3mL 30％DMSO的PBS(pH 7.4，50mM)缓冲溶液，再依次加入10μL的探针，14μL的β-半乳糖苷酶，激发波长651nm，激发狭缝宽10nm，发射狭缝宽10nm，增益700V，结果如图5所示，加入β- 半乳糖苷酶后5min后，检测到724nm处的荧光增强15.6倍，并且在前20min 内变化明显，之后随着时间的延长，荧光缓慢增强，反应30min后荧光强度趋于稳定，至此荧光信号增强了34.8倍，同时荧光最大发射波长也由574nm位移至727nm处。
实施例9.探针C-1(10μM)与β-半乳糖苷酶的浓度滴定实验
在3mL的石英比色皿中加入3mL 30％DMSO的PBS(pH 7.4，50mM)缓冲溶液，再依次加入10μL的探针，和各种浓度(0、0.5、1、2、4、6、8、10、 12、14u)的β-半乳糖苷酶，37℃下反应，300min，测量其荧光发射光谱。激发波长651nm，激发狭缝宽10nm，发射狭缝宽10nm，增益700V，图6显示，随着β-半乳糖苷酶浓度的增大，724nm处的荧光强度也不断增强，在0-8u的浓度范围内，荧光强度与β-半乳糖苷酶浓度呈良好的线性关系，线性方程为 Y＝120.6X+51.18，R2＝0.9954。
实施例10 探针C-1与各种干扰分析物反应的选择性实验
各分析物β-gal，cellulase，lysozyme，tripsin，NaHS，Cys，Hcy，GSH，DTT， NADH，Vitamin C，Na2S2O5，H2O2，NaClO均配制成3M的浓溶液，备用，在 3mL的石英比色皿中加入3mL30％DMSO的PBS(pH 7.4，50mM)缓冲溶液，再依次加入10μL的探针，14u的β-半乳糖苷酶或100equiv的各种分析物，37 ℃下反应30min，测量其荧光发射光谱，激发波长651nm，激发狭缝宽10nm，发射狭缝宽10nm，增益700V，图6显示，在其它分析物存在下探针C-1的荧光基本不发生改变，而加入β-半乳糖苷酶后荧光强度大幅度提升，表明探针C-1 可对β-半乳糖苷酶的检测不受其他物质干扰，可对β-半乳糖苷酶进行选择性检测。
实施例11.探针C-1检测衰老细胞成像图
将VSMCs细胞以3×105个/mL的浓度接种到35mm的共聚焦培养皿中，在 37℃，5％CO2的培养箱中孵育12小时后，将细胞分成两组，对照组在正常氧含量条件下继续培养72小时，实验组以Ang II诱导细胞衰老，培养72小时，随后分别加入10μM的探针C-1孵育1小时，吸掉培养液，并用PBS洗涤3次，加入无血清培养基，在荧光显微镜下观察，激发波长488nm，发射波段550-610 nm荧光为绿色通道；激发波长633nm，发射波段700-750nm荧光为绿色通道，结果如图8所示，正常培养的细胞有很强的绿色荧光，很弱的红色荧光，红色通道比绿色通道比值为0.4，而衰老的细胞，有很强的红色荧光，很弱的绿色荧光，红色通道比绿色通道比值为2；
进一步进行探针C-1、C-2、C-3细胞毒性实验，将VSMCs细胞以3×105个 /mL的浓度接种到96孔板中，在37℃，5％CO2的培养箱中孵育12小时后，再加不同浓度探针孵育24小时，随后每孔加CCK8溶液，1小时后用酶标仪读OD 值，结果显示，探针成像浓度均无明显细胞毒性，毒性不影响成像结果。
Claims (5)
1.一种β-半乳糖苷酶近红外荧光探针，其特征在于，具有通式(1)结构：
2.根据权利要求1所述的β-半乳糖苷酶近红外荧光探针，其特征在于，其按如下合成路线和步骤制备：
(1)向化合物B的巯基乙酸溶液中加入三氟化硼乙醚溶液，室温反应，TLC监测至反应结束，将溶液用乙酸乙酯稀释，用饱和食盐水洗，有机相经硅胶柱层析得化合物C；
(2)化合物C和α-D-五乙酰半乳糖的混合物用DMF溶解，加入三氟化硼乙醚溶液，室温反应，TLC监测至反应结束，将溶液用乙酸乙酯稀释，用饱和食盐水洗，有机相经硅胶柱层析得化合物D；
(3)化合物D溶于甲醇，加入甲醇钠，TLC监测至反应结束，加入阳离子交换树脂调PH＝7，过滤，浓缩得化合物E；
(4)化合物E和化合物A溶于DMSO，加入三乙胺，室温反应，TLC监测至反应结束，经硅胶柱层析得黄色固体化合物F；
(5)化合物F溶于吡啶，加入三乙胺，分别与化合物G、H、I在80℃反应，TLC监测至反应结束，经硅胶柱层析制得通式(1)探针。
3.根据权利要求1或2所述的β-半乳糖苷酶近红外荧光探针，其特征在于，通式(1)β-半乳糖苷酶近红外荧光探针为探针C-1，探针C-2，探针C-3，其中，
探针C-1结构为：
探针C-2结构为：
探针C-3结构为：
4.根据权利要求1或2所述的β-半乳糖苷酶近红外荧光探针，其特征在于，所述的通式(1)荧光探针通过式I反应机制实现β-半乳糖苷酶的荧光检测，其中，在溶液中，通式(1)探针被β-半乳糖苷酶(β-gal)识别，使其结构中半乳糖苷被水解，水解后的酚类产物发生分子内自消除反应，产生的新的荧光信号，
5.根据权利要求1-4任一所述的β-半乳糖苷酶近红外荧光探针在制备用于检测衰老血管平滑肌细胞的荧光成像的制剂中的用途。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112505005A (zh) * | 2020-10-30 | 2021-03-16 | 南京医科大学 | 一种用于定量检测乳糖酶补充剂中β-Gal的比率型荧光探针的制备方法 |
| CN113527389A (zh) * | 2021-07-27 | 2021-10-22 | 武汉工程大学 | 快速检测β-半乳糖苷酶的荧光探针及其制备方法和应用 |
| CN114736255A (zh) * | 2022-05-11 | 2022-07-12 | 湖南超亟检测技术有限责任公司 | 检测β-半乳糖苷酶的黄酮衍生物荧光探针及其制备方法和应用、试剂盒及其使用方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106905389A (zh) * | 2017-01-24 | 2017-06-30 | 华东理工大学 | 一种具有细胞内滞留能力的β‑半乳糖苷酶荧光探针 |
| CN108329366A (zh) * | 2018-03-07 | 2018-07-27 | 南京工业大学 | 一种用于检测β-半乳糖苷酶的荧光探针化合物及其制备方法 |
| CN109134559A (zh) * | 2018-09-20 | 2019-01-04 | 济南大学 | 一种检测β-半乳糖苷酶的荧光探针及制备方法和应用 |
| CN109180744A (zh) * | 2018-09-20 | 2019-01-11 | 济南大学 | 一种检测β-半乳糖苷酶的荧光探针 |
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106905389A (zh) * | 2017-01-24 | 2017-06-30 | 华东理工大学 | 一种具有细胞内滞留能力的β‑半乳糖苷酶荧光探针 |
| CN108329366A (zh) * | 2018-03-07 | 2018-07-27 | 南京工业大学 | 一种用于检测β-半乳糖苷酶的荧光探针化合物及其制备方法 |
| CN109134559A (zh) * | 2018-09-20 | 2019-01-04 | 济南大学 | 一种检测β-半乳糖苷酶的荧光探针及制备方法和应用 |
| CN109180744A (zh) * | 2018-09-20 | 2019-01-11 | 济南大学 | 一种检测β-半乳糖苷酶的荧光探针 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| GE XU等: "Imaging of Colorectal Cancers Using Activatable Nanoprobe swith Second Near-Infrared Window Emission", 《ANGEW.CHEM.INT.ED.》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112505005A (zh) * | 2020-10-30 | 2021-03-16 | 南京医科大学 | 一种用于定量检测乳糖酶补充剂中β-Gal的比率型荧光探针的制备方法 |
| CN113527389A (zh) * | 2021-07-27 | 2021-10-22 | 武汉工程大学 | 快速检测β-半乳糖苷酶的荧光探针及其制备方法和应用 |
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