CN112505005A - 一种用于定量检测乳糖酶补充剂中β-Gal的比率型荧光探针的制备方法 - Google Patents

一种用于定量检测乳糖酶补充剂中β-Gal的比率型荧光探针的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于定量检测乳糖酶补充剂中β‑Gal的比率型荧光探针的制备方法，（1）合成发射蓝色和黄绿色荧光的SiNPs‑Rho6G；（2）β‑Gal催化对硝基苯基‑β‑D‑吡喃半乳糖苷生成对硝基苯酚；（3）对硝基苯酚与SiNPs‑Rho6G发生内滤效应，使SiNPs‑Rho6G在415nm处的荧光被猝灭，而550nm处的荧光保持稳定，根据SiNPs‑Rho6G在415nm和550nm处两者荧光强度的比值对β‑Gal的浓度绘制标准曲线，测定的样品根据标准曲线法对β‑Gal的浓度进行定量检测，该方法灵敏度高、选择性好、检测简便。

Description

一种用于定量检测乳糖酶补充剂中β-Gal的比率型荧光探针 的制备方法
技术领域
本发明属纳米材料、荧光传感技术和生物分析检测领域，具体涉及基于硅纳米粒的比率荧光传感平台定量测定乳糖酶补充剂中β-半乳糖苷酶（β-Gal）的方法。
背景技术
β-半乳糖苷酶（β-Gal）是存在于哺乳动物体内的一种重要酶，它能通过水解糖苷键将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖。乳糖酶缺乏会导致乳糖不耐症，一种广泛影响儿童和成人的病症，即过量的乳糖会引起腹泻、胀气、抽筋、腹胀以及抑制钙的吸收，导致骨质疏松。此外，乳糖酶缺乏也会阻碍半乳糖寡糖的生成，从而阻碍人体肠道中有益菌群的生长。在日常饮食中添加β-Gal是一种缓减乳糖不耐症的有效方法，且β-Gal亦被广泛用于乳制品生产过程。因此，发展一种灵敏的、选择性高的方法定量检测乳糖酶补充剂中β-Gal水平是极其重要的。
近年来，已有许多检测β-Gal的方法被报道，包括化学发光法、电化学法、比色法和荧光法。其中，电化学法建立完好但步骤复杂。比色法简单高效，但是大部分方法依赖于紫外方法（TMB或CuNPs），存在着灵敏度低的特点。目前，对于建立检测β-Gal荧光方法的探索已经取得了较大的进步。荧光方法灵敏度高，价格低廉，简单且信号易读。其中，单发射荧光探针易受不同种类环境因素的影响如检测条件、荧光探针的浓度。但是，比率荧光探针能够通过提供内参来降低分析物非依赖干扰信号。另外，比率荧光探针能够展现荧光颜色的变化，这有利于现场检测与诊断。例如：公开号为CN111763234A的中国专利申请公开了一种检测β-半乳糖苷酶的荧光探针及其制备方法和应用，该荧光探针结构式如下：
Figure 340507DEST_PATH_IMAGE001
具有灵敏度高，检测限低(0.168mU/mL)，选择性好，响应快，能特异性地检测β-半乳糖苷酶的活性和含量，并基于该荧光探针首次建立了β-半乳糖苷酶抑制剂筛选的荧光方法，但其制备方法复杂。公开号为CN111778014A的中国专利申请公开了一类β-半乳糖苷酶近红外荧光探针，该荧光探针可根据β-半乳糖基水解、分子内自消除机理实现对β-半乳糖苷酶的检测，灵敏度高，可用于制备衰老细胞的特异性荧光成像的检测制剂。同样，制备方法复杂。
发明内容
针对现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种定量检测乳糖酶补充剂中β-Gal的比率型荧光探针的制备方法，基于硅纳米粒的比率荧光传感平台，具有灵敏度高、选择性好、检测简便的优点，大大减少了来自探针浓度，光源，仪器效率和测量条件的干扰，可以直接应用于乳糖酶补充剂中β-Gal的检测。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种用于定量检测乳糖酶补充剂中β-Gal的比率型荧光探针的制备方法，步骤如下：
（1）、合成发射蓝色和黄绿色荧光的SiNPs-Rho6G:由于所合成的SiNPs-Rho6G需要与步骤（2）反应生成的对硝基苯酚发生内滤效应，那么就必须要求合成的硅纳米粒（SiNPs-Rho6G）的发射光谱与对硝基苯酚的紫外吸收光谱有重叠，同时硅纳米粒在加入对硝基苯酚前后荧光寿命需要保持一致。因此，我们选择了根据以下参考文献来合成硅纳米粒（Shen,X. B.; Song, B.; Fang, B.; Yuan, X.; Li, Y. Y.; Wang, S. Y.; Ji, S. J.; He,Y. Solvent Polarity-Induced Photoluminescence Enhancement (SPIPE): A MethodEnables Several-Fold Increase in Quantum Yield of Silicon Nanoparticles. NanoRes. 2019, 12, 315−322.）合成发射蓝色和黄绿色荧光的SiNPs-Rho6G：将柠檬酸溶液与罗丹明6G混合搅拌15min，然后加入APTES，反应12 h生成发射蓝色和黄绿色荧光的SiNPs-Rho6G。
（2）、生成对硝基苯酚：将β-Gal与底物对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷共孵育生成对硝基苯酚。
对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷的浓度为10-1000 μM，孵育时间为30 min。
（3）、制备比率型荧光探针：将步骤（1）所得的发蓝色和黄绿色荧光的SiNPs-Rho6G与步骤（2）所得的对硝基苯酚混合，SiNPs-Rho6G的蓝色荧光被对硝基苯酚猝灭，得到随着β-Gal浓度增加，蓝色荧光逐渐降低，黄绿色荧光稳定不变的比率型荧光探针；
所用SiNPs-Rho6G浓度为0.1-2.4 mg/mL。
（4）、根据SiNPs-Rho6G在415 nm及550 nm处的荧光强度的比值对β-Gal的浓度绘制标准曲线；
（5）、定量检测β-Gal：在Tris-HCl缓冲溶液稀释的乳糖酶补充剂中加入对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷共孵育，孵育后加入步骤（1）中的SiNPs-Rho6G，测定探针的蓝色荧光与黄绿色荧光的比值，根据标准曲线，得到乳糖酶补充剂中β-Gal的含量。
加入步骤（1）SiNPs-Rho6G反应时间为1-60 min。
本发明定量检测乳糖酶补充剂中的β-Gal活性的原理是：
首先，β-Gal催化水解对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷生成对硝基苯酚，加入发射蓝色和黄绿色荧光的SiNPs-Rho6G后，由于内滤效应的作用，SiNPs-Rho6G的蓝色荧光被对硝基苯酚猝灭，因此可以得到随着β-Gal的浓度增加，蓝色荧光逐渐降低，黄绿色荧光稳定不变的比率荧光探针，其蓝色荧光和黄绿色荧光的强度比值与β-Gal浓度有关。
有益效果：本发明利用β-半乳糖苷酶和对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷的水解反应生成的对硝基苯酚，猝灭SiNPs-Rho6G的蓝色荧光，黄绿色荧光稳定不变，构成比率荧光探针，其蓝色荧光与黄绿色荧光的强度比值与β-Gal浓度有关，因此可用于检测β-Gal的活性。与传统的单信号检测方法相比，具有灵敏度高、选择性好、检测简便的优点，并且可以减少来自探针浓度，光源，仪器效率和测量条件的干扰，可以直接应用于乳糖酶补充剂中β-Gal的检测。整个检测过程环保、安全、方便。
附图说明
图1A是实施例1制备得到的SiNPs-Rho6G的透射电子显微镜图；如图所示，SiNPs-Rho6G粒径约在4 nm（图中标尺为10 nm）。
图1B是实施例1制备得到的SiNPs-Rho6G在不同激发波长下的荧光发射图；如图所示，SiNPs-Rho6G荧光发射波长在415-550 nm，且发射波长随激发波长的改变而变化。
图2是实施例2中底物对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷的浓度优化图；如图所示，随着对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷浓度的增大，荧光强度比值逐渐减少然后趋于稳定。
图3是实施例3中缓冲液pH的优化图。如图所示，随着缓冲液pH的增大，信噪比逐渐增大然后再减小。
图4是实施例4中反应时间的优化图。如图所示，随着反应时间的延长，荧光强度比值逐渐减小然后趋于稳定。
图5是实施例5中SiNPs-Rho6G的浓度优化图。如图所示，随着SiNPs-Rho6G的浓度逐渐增加，信噪比先升高后下降。
图6A是实施例6中β-Gal浓度与比率荧光探针的荧光变化图；如图所示，随着β-Gal浓度的增大，比率荧光探针的蓝色荧光逐渐减弱，黄绿色荧光保持不变。
图6B是实施例6中β-Gal浓度与比率荧光探针的蓝色荧光与黄绿色荧光比值的相关图；如图所示，随着β-Gal浓度的增大，比率荧光探针的蓝色荧光与黄绿色荧光比值逐渐减少，在1-25 U/L范围内，β-Gal的浓度与比率荧光探针的蓝色荧光与黄绿色荧光比值呈线性相关，线性回归方程为F415/F550=0.0597c β-Gal+2.479，相关系数r2=0.992。
具体实施方式
无水柠檬酸、氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）、对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷、罗丹明6G（阿拉丁试剂有限公司）；β-半乳糖苷酶（西格玛奥德里奇贸易有限公司）。
实施例1 发射蓝色和黄绿色荧光的SiNPs-Rho6G的合成，步骤如下：
将无水柠檬酸和罗丹明6G加入到超纯水中并搅拌通氮气除氧15 min，后加入APTES，反应釜中反应12 h，后通过微孔滤膜和透析除去杂质。透射电镜图如图1A所示，其不同激发波长下的荧光发射光谱如图1B所示。
实施例2 考察底物对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷的浓度对目标物响应的影响实验，步骤如下:
将β-Gal分散在Tris-HCl缓冲溶液中，加入不同浓度的底物对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（10-1000 μM）共孵育，然后加入SiNPs-Rho6G反应，测定探针的蓝色荧光和黄绿色荧光强度比值，考察底物对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷浓度对目标物响应的影响，结果如图2所示。
实施例3 考察缓冲液的pH对目标物响应的影响实验，步骤如下:
将β-Gal分散在Tris-HCl缓冲溶液（pH 3 - 9）中，加入底物对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷共孵育，然后加入SiNPs-Rho6G，测定探针的蓝色荧光和黄绿色荧光强度比值，考察缓冲液pH对目标物响应的影响，结果如图3所示。
实施例4 考察反应时间对目标物响应的影响实验，步骤如下:
将β-Gal分散在Tris-HCl缓冲溶液中，加入底物对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷共孵育，然后加入SiNPs-Rho6G反应（1-60 min），测定探针的蓝色荧光和黄绿色荧光强度比值，考察反应时间对目标物响应的影响，结果如图4所示。
实施例5 考察SiNPs-Rho6G的浓度对目标物响应的影响实验，步骤如下:
将β-Gal分散在Tris-HCl缓冲溶液中，加入底物对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷孵育，然后加入SiNPs-Rho6G（0.1-2.4 mg/mL），观察SiNPs-Rho6G的蓝色荧光和黄绿色荧光强度比值变化，考察SiNPs-Rho6G浓度对目标物响应的影响，结果如图5所示。
实施例6 对β-Gal的定量检测，步骤如下:
将不同浓度的β-Gal（0.1-200 U/L）Tris-HCl缓冲溶液中，加入底物对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷孵育，然后加入SiNPs-Rho6G，测定探针的蓝色荧光与黄绿色荧光的强度的比值，所得荧光图如图6A所示，荧光强度的比值与β-Gal活性的相关性如图6B所示。
实施例7 实际乳糖酶补充剂样品中β-Gal的检测，步骤如下：
将用Tris-HCl缓冲溶液（(pH=8.0)）稀释的乳糖酶补充剂与底物对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷共孵育，后加入SiNPs-Rho6G，测定探针的蓝色荧光与黄绿色荧光的强度的比值，根据标准曲线计算得到乳糖酶补充剂中β-Gal的含量。实施例中三个乳糖酶补充剂样品检测到的β-Gal活性如表1所示，其中标准值为乳糖酶补充剂标示活性计算所得。三个乳糖酶补充剂样品检测到的β-Gal浓度与标示值基本一致。
表1
Figure 402135DEST_PATH_IMAGE002

Claims (7)

1.一种用于定量检测乳糖酶补充剂中β-半乳糖苷酶的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）、合成发射蓝色和黄绿色荧光的SiNPs-Rho6G；
（2）、生成对硝基苯酚：将β-Gal与底物对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷共同孵育生成对硝基苯酚；
（3）、制备比率型荧光探针：将步骤（1）所得的发蓝色和黄绿色荧光的SiNPs-Rho6G与步骤（2）所得的对硝基苯酚混合，SiNPs-Rho6G在415 nm处的蓝色荧光被猝灭，而550 nm处的黄绿色荧光保持不变，得到随着β-Gal浓度增加，蓝色荧光逐渐降低，黄绿色荧光保持不变的比率型荧光探针；
（4）、根据SiNPs-Rho6G在415 nm和550 nm处两者荧光强度的比值对β-Gal的浓度绘制标准曲线；
（5）、定量检测β-Gal：在用Tris-HCl缓冲溶液稀释的乳糖酶补充剂中加入对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷共孵育，孵育完成后加入步骤（1）中的SiNPs-Rho6G，测定探针的蓝色荧光与黄绿色荧光强度比值，根据标准曲线，得到乳糖酶补充剂中β-Gal的含量。
2.根据权利要求1所述的用于定量检测乳糖酶补充剂中β-Gal的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤（1）中合成的SiNPs-Rho6G的方法是：将柠檬酸溶液与罗丹明6G混合搅拌均匀，然后加入APTES，反应12 h生成发射蓝色和黄绿色荧光的SiNPs-Rho6G，其发射波长范围在415-550 nm。
3.根据权利要求1所述的用于定量检测乳糖酶补充剂中β-Gal的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，底物对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷浓度为10-1000 μM，孵育时间为30 min。
4.根据权利要求1所述的用于定量检测乳糖酶补充剂中β-Gal的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，步骤（1）中SiNPs-Rho6G与步骤（2）中对硝基苯酚混合反应时间为1-60 min。
5.根据权利要求1所述的用于定量检测乳糖酶补充剂中β-Gal的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，SiNPs-Rho6G浓度为0.1-2.4 mg/mL。
6.根据权利要求1所述的用于定量检测乳糖酶补充剂中β-Gal的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤（5）Tris-HCl缓冲溶液的pH为3-9。
7.根据权利要求6所述的用于定量检测乳糖酶补充剂中β-Gal的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤（5）Tris-HCl缓冲溶液的pH为8。
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