CN110411990B - 一种基于纳米探针检测过氧化氢和相关目标物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，公开了一种基于纳米探针检测过氧化氢和相关目标物的方法。所述方法采用水溶性稀土掺杂NaCeF4纳米材料作为荧光探针，通过过氧化氢与铈离子的氧化还原反应，猝灭稀土离子发光，利用掺杂稀土离子荧光强度的变化实现对过氧化氢浓度的检测。本发明不仅可以用于标准液中过氧化氢或生成过氧化氢的酶促反应中反应物的检测，也可以进一步实现对血清中的过氧化氢、生物酶或底物(如尿酸)的检测，具备操作简便、抗干扰性好、快速灵敏、经济实用等优点，可为解决复杂体系中尿酸和过氧化氢生成体系相关物质的实时检测提供理论依据和技术支持，具有一定的临床应用潜力。

Description

一种基于纳米探针检测过氧化氢和相关目标物的方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于纳米探针检测过氧化氢和相关目标物的方法。
背景技术
过氧化氢(H2O2，俗称双氧水)溶液为无色无味液体，是目前广泛应用于造纸业和纺织业等的一种强氧化剂。但是，过氧化氢是被禁止将添加进食品的，因为它是一种有毒化学物质，具有极强的氧化性和腐蚀性。目前对过氧化氢的检测主要采取电化学法、色谱法和分光光度法等，存在过程复杂且灵敏度不够的问题，对其的微量检测还缺乏简便快捷的方法。
值得注意的是，人体很多生理活动与过氧化氢相关，如尿酸在尿酸酶的催化下会产生过氧化氢。过氧化氢有致癌的作用，会加速人体的衰老，也可能引起脑中风、动脉硬化、糖尿病和肾病等疾病。随着中国经济的腾飞，国民的生活水平和饮食结构都随之改变。越来越多的人因为不良的饮食和生活习惯患上了高尿酸，我国高尿酸症患者人数已达1.7亿。尿酸是体内核酸中嘌呤分解的最终产物，大部分经肾脏排出。当肾功能受损时，尿酸易滞留于血中而导致血中含量升高。一般说来，以下几种症状中尿酸含量比较高：痛风症，急慢性肾小球肾炎，白血病，多发性骨髓瘤，红细胞增多症或其它恶性肿瘤等。在肾脏病变早期，血中尿酸浓度常首先升高，此项指标非常有助于较早期的诊断肾脏的病变。传统尿酸检测主要依赖于电化学法、化学发光法及分光光度法等，这些方法无法避免血液中复杂成分的干扰，而且检测需要经过离心分离、清洗等前期处理，不仅操作繁琐耗时，而且会造成实际检测结果误差偏大等问题。因此，在复杂体系中实现精准快速的尿酸浓度检测，对高尿酸的诊断起重要作用。
发明内容
本发明提供了一种基于稀土掺杂NaCeF4纳米探针的检测方法，该方法只需通过简单混合荧光纳米探针和待测目标物，即可实现血清中的过氧化氢或生成过氧化氢的生化体系中相关物质的精准检测，具有快速简易、高灵敏度、高选择性和低成本等优点。
一种基于纳米探针的检测方法，该方法包括将待测目标物与纳米探针的水溶液混合；
所述待测目标物可以选自过氧化氢或生成过氧化氢的酶促反应中的反应物，例如所述反应物可以为葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、胆固醇氧化酶、乙醇氧化酶、肌氨酸氧化酶、半乳糖氧化酶、L-氨基酸氧化酶等，以及上述生物酶对应的底物分子，例如血糖、尿酸、胆固醇、乙醇、肌氨酸、半乳糖、L-氨基酸等；
优选地，所述待测目标物选自过氧化氢或生成过氧化氢酶促反应中的生物酶对应的底物分子；例如待测目标物可以为过氧化氢、尿酸、血糖、乳酸等；
根据本发明示例性的实施方案，所述待测目标物选自血清或全血中的过氧化氢或尿酸；
优选地，所述纳米探针为水溶性的稀土掺杂NaCeF4纳米材料。
根据本发明，所述稀土掺杂NaCeF4纳米材料可以以化学式NaCeF4:Ln3+表示，其中Ln可以选自稀土元素La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu中的一种、两种或更多种；根据本发明示例性的实施方案，所述稀土掺杂NaCeF4纳米材料可以选自NaCeF4:Tb3 +或NaCeF4:Er3+,Yb3+；
优选地，所述稀土掺杂NaCeF4纳米材料可以选自平均粒径7～200nm的纳米颗粒，如10～80nm，示例性地，粒径可以为10nm、20nm、25nm、50nm、80nm、100nm、150nm、200nm；
优选地，所述水溶性的稀土掺杂NaCeF4纳米材料的表面无有机配体，所述有机配体可以为油酸、油胺、三辛胺等；示例性地，所述有机配体为油酸。
优选地，所述水溶性的稀土掺杂NaCeF4纳米材料是由稀土掺杂NaCeF4纳米颗粒采用酸洗处理的方法制备得到的，酸洗后的稀土掺杂NaCeF4纳米颗粒表面的稀土离子Ln3+裸露出来，使得所述纳米材料可以均匀分散于水溶液中。所述酸洗处理具体包括如下步骤：
a)配制pH在0.5～1.5之间的乙醇酸溶液；
b)将上述稀土掺杂NaCeF4纳米材料溶解于步骤a)所述乙醇酸溶液中，超声、洗涤后，得到水溶性的稀土掺杂NaCeF4纳米材料；
优选地，所述稀土掺杂NaCeF4纳米材料在乙醇酸溶液中的浓度为1～3mg/mL，所述超声的时间为20～40min，所述洗涤可以依次用去离子水和乙醇溶液洗涤次数。
根据本发明，该方法还包括待测目标物与纳米探针水溶液混合后，测定混合液的发光强度，计算待测目标物的浓度。
优选地，所述待测目标物的浓度通过代入待测目标物的浓度依赖型标准曲线计算得到。
根据本发明，所述方法还包括配制不同浓度的纳米探针水溶液和待测目标物溶液。
根据本发明，所述方法具体包括以下步骤：
1)将水溶性的稀土掺杂NaCeF4纳米材料分散于水溶液中，得到不同浓度的纳米材料水溶液；
2)配制不同浓度的待测目标物溶液；
优选地，配制不同浓度的过氧化氢溶液或生物酶溶液；例如，配制不同浓度的葡萄糖氧化酶、尿酸酶、胆固醇氧化酶、乙醇氧化酶、肌氨酸氧化酶、半乳糖氧化酶、1-氨基酸氧化酶等酶溶液；示例性地，配制不同浓度的尿酸酶溶液；
3)将步骤1)所述纳米材料水溶液与步骤2)待测目标物溶液混合，孵育，测定混合液的发光强度，并且计算出发光猝灭效率，得到荧光猝灭效率最大时混合液所对应的纳米材料水溶液和待测目标物的浓度值；
优选地，将步骤1)所述纳米材料水溶液与步骤2)过氧化氢溶液或生物酶溶液混合，孵育，测定混合液的发光强度，并且计算出发光猝灭效率，得到荧光猝灭效率最大时混合液所对应的纳米材料水溶液和过氧化氢溶液或生物酶溶液的浓度值；
示例性地，将步骤1)所述纳米材料水溶液与步骤2)尿酸酶溶液混合，孵育，测定混合液的发光强度，并且计算出发光猝灭效率，得到荧光猝灭效率最大时混合液所对应的纳米材料水溶液和尿酸酶溶液的浓度值；
4)绘制待测目标物的浓度依赖型标准曲线；
优选地，所述待测目标物的浓度依赖型标准曲线绘制具体步骤如下：以荧光猝灭效率最大时对应的纳米材料水溶液和待测目标物溶液的浓度为标准浓度，将标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的待测目标物溶液和不同浓度的待测目标物溶液混合，孵育，测定混合液的发光强度，做出待测目标物的浓度依赖型标准曲线；
更优选地，所述标准曲线的绘制具体步骤如下：以步骤3)的荧光猝灭效率最大时对应的纳米材料水溶液和过氧化氢溶液或生物酶溶液的浓度为标准浓度，将标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的过氧化氢溶液和不同浓度的过氧化氢溶液混合，或者，
将标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的生物酶溶液和不同浓度的底物溶液混合；
孵育，测定混合液的发光强度，做出待测目标物的浓度依赖型标准曲线；
示例性地，所述待测目标物的浓度依赖型标准曲线由以下步骤绘制得到：以荧光猝灭效率最大时对应的纳米材料水溶液和尿酸酶溶液的浓度为标准浓度，将标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的尿酸酶溶液和不同浓度的尿酸混合；孵育，测定混合液的发光强度，做出尿酸的浓度依赖型标准曲线；
5)检测待测目标物的浓度；
优选地，所述待测目标物的浓度具体通过以下步骤测得：将标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的待测目标物溶液和未知浓度的待测目标物溶液混合，孵育，测定混合液的发光强度，代入步骤4)绘制的待测目标物的浓度依赖型标准曲线，得出待测目标物的浓度；
更优选地，所述待测目标物的浓度具体通过以下步骤得到：将标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的过氧化氢溶液和未知浓度的过氧化氢溶液混合，或者，
将标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的生物酶溶液和未知浓度的底物溶液混合；孵育，测定混合液的发光强度，代入步骤4)所绘制的待测目标物的浓度依赖型标准曲线，得出待测目标物的浓度；
示例性地，所述待测目标物的浓度具体通过以下步骤得到：将标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的尿酸酶溶液和未知浓度的尿酸溶液混合；孵育，测定混合液的发光强度，代入绘制的尿酸的浓度依赖型标准曲线，得出尿酸的浓度。
根据本发明，步骤2)中所述生物酶溶液由生物酶与缓冲溶液混合得到；
优选地，所述缓冲溶液可以选自pH值为7～11的缓冲溶液；例如，所述缓冲溶液可以选自Tris-HCl缓冲液、NaOH-H3BO3缓冲液、NaCO3-NaHCO3缓冲液、磷酸盐缓冲液等；根据本发明示例性的实施方案，所述缓冲溶液选自NaOH-H3BO3，其pH为8.7；
根据本发明示例性的实施方案，所述尿酸酶溶液由尿酸酶与NaOH-H3BO3缓冲溶液混合得到；所述尿酸酶的浓度大于0且小于等于0.011U/mL。
根据本发明，步骤3)中所述孵育的温度可以选自30～50℃，优选地，所述孵育的温度选自35～40℃，根据本发明示例性的实施方案，所述孵育的温度为37℃；
所述孵育的时间可以选自60～240min，优选地，所述孵育的时间选自120～180min；根据本发明示例性的实施方案，所述孵育的时间为180min；
优选地，所述混合优选在酶标板中进行混合，例如在96孔酶标板中进行混合；所述纳米材料水溶液与过氧化氢溶液或生物酶溶液的浓度和体积可以按任意比例混合；优选为能够得到混合液的发光强度和发光猝灭效率最大时混合液所对应的纳米材料水溶液与过氧化氢溶液或生物酶溶液的浓度值即可；
示例性地，所述混合优选在酶标板中进行混合，例如在96孔酶标板中进行混合；所述纳米材料水溶液与尿酸酶溶液的浓度和体积可以按任意比例混合；优选为能够得到混合液的发光强度和发光猝灭效率最大时混合液所对应的纳米材料水溶液与尿酸酶溶液的浓度值即可。
根据本发明，步骤4)中所述孵育的温度可以选自30～50℃，优选地，所述孵育的温度选自35～40℃，根据本发明示例性的实施方案，所述孵育的温度为37℃；
所述孵育的时间可以选自60～240min，优选地，所述孵育的时间选自120～180min；根据本发明示例性的实施方案，所述孵育的时间为180min；
优选地，所述混合优选在酶标板中进行混合，例如在96孔酶标板中进行混合；所述标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的过氧化氢溶液和不同浓度的过氧化氢溶液的浓度和体积可以按任意比例混合；
或者，标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的生物酶溶液和不同浓度的底物溶液的浓度和体积可以按任意比例混合；
示例性地，所述混合优选在酶标板中进行混合，例如在96孔酶标板中进行混合；所述标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的尿酸酶溶液和不同浓度的尿酸溶液的浓度和体积可以按任意比例混合；
例如，所述待测目标物溶液的浓度为0～1000μM；优选为能够得到绘制待测目标物的浓度依赖型标准曲线即可；
优选地，所述待测目标物的浓度依赖型标准曲线是以待测目标物在混合液中的浓度为横坐标，对应的发光强度值为纵坐标进行绘制的。
根据本发明，步骤5)中所述孵育的温度可以选自30～50℃，优选地，所述孵育的温度选自35～40℃，根据本发明示例性的实施方案，所述孵育的温度为37℃；
所述孵育的时间可以选自60～240min，优选地，所述孵育的时间选自120～180min；根据本发明示例性的实施方案，所述孵育的时间为180min；
所述混合优选在酶标板中进行混合，例如在96孔酶标板中进行混合；所述标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的过氧化氢溶液和未知浓度的过氧化氢溶液的浓度和体积可以按任意比例混合；所述标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的生物酶溶液和未知浓度的底物溶液的浓度和体积可以按任意比例混合；优选为能够得到在步骤4)的待测目标物的浓度依赖型标准曲线中读取出发光强度的即可；
示例性地，所述标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的尿酸酶溶液和未知浓度的尿酸溶液的浓度和体积可以按任意比例混合；优选为能够得到在步骤4)的尿酸的浓度依赖型标准曲线中读取出发光强度的即可。
根据本发明，步骤3)、4)和5)中所述混合液的发光强度的测定在酶标仪中进行。
本发明还提供了上述检测方法的用途，其用于过氧化氢或生成过氧化氢的酶促反应中反应物的检测；
优选地，所述检测方法用于血清或全血样品中的过氧化氢或尿酸的检测。
本发明还提供了稀土掺杂NaCeF4纳米材料作为纳米探针的用途，优选地，所述纳米材料选用水溶性的稀土掺杂NaCeF4纳米材料；所述稀土掺杂NaCeF4纳米材料具有如上文所述的定义。
本发明还提供了一种试剂盒，其包含一种纳米探针，所述纳米探针为稀土掺杂NaCeF4纳米材料，所述稀土掺杂NaCeF4纳米材料具有如上文所述的定义。
本发明还提供了一种生物传感器，其包含一种纳米探针，所述纳米探针为稀土掺杂NaCeF4纳米材料，所述稀土掺杂NaCeF4纳米材料具有如上文所述的定义。
申请人在本发明的研究中发现，过氧化氢的存在可以有效猝灭稀土掺杂NaCeF4纳米颗粒发光，体系中的过氧化氢时可以将Ce3+氧化成Ce4+，从而可以猝灭稀土发光。过氧化氢的含量与稀土发光猝灭强度正相关，因此可以通过稀土掺杂NaCeF4纳米材料的发光强弱反映待检测体系中过氧化氢的含量，进而也可以检测生成过氧化氢的生化体系(如尿酸+尿酸酶，葡萄糖(血糖)+葡萄糖氧化酶、乳酸+乳酸酶等体系，底物在对应的生物酶作用下生成过氧化氢，如尿酸在尿酸酶作用下能够生成过氧化氢)，通过检测生成的过氧化氢可以实现对底物(如尿酸)的定量检测。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种通过稀土掺杂NaCeF4纳米材料中铈离子氧化还原反应检测待测目标物的方法，与传统的荧光探针检测方法相比，本发明所述的方法无需进行荧光受体或荧光供体-受体复合物的前期制备，只需将稀土掺杂NaCeF4纳米材料和待检测目标物进行简单混合，通过光谱测试即可精准测定待检测物的浓度，操作简易方便、成本低廉、省时省力。
本发明可以用于过氧化氢或生成过氧化氢的酶促反应中反应物的检测，也可以进一步实现对血清中的过氧化氢、生物酶或相应底物(如尿酸)的检测，具备操作简便、抗干扰性好、快速灵敏(对过氧化氢和尿酸的检测极限分别为41.8nM和25.6nM)、经济实用等优点，可为解决复杂体系中过氧化氢和尿酸的实时监测提供理论依据和技术支持，具有一定的临床应用潜力。
附图说明
图1为本发明所述稀土掺杂NaCeF4纳米探针检测过氧化氢的原理示意图。
图2为本发明制备例1所述NaCeF4:Tb3+纳米颗粒的透射电镜图。
图3为本发明制备例1所述NaCeF4:Tb3+纳米颗粒酸洗之后的粒径分析图。
图4为本发明所述NaCeF4:Er3+,Yb3+纳米颗粒被过氧化氢氧化前和氧化后的X射线衍射图。
图5为本发明实施例1所述不同浓度过氧化氢作用下混合液的光谱图。
图6为实施例1所述NaCeF4:Tb3+探针发光强度的过氧化氢浓度依赖型响应曲线。
图7为本发明实施例2所述NaCeF4:Tb3+纳米探针测定不同浓度尿酸的光谱图。
图8为实施例2所述NaCeF4:Tb3+纳米探针发光强度的尿酸浓度依赖型响应曲线。
图9为本发明实施例3所述NaCeF4:Er3+,Yb3+纳米探针在尿酸检测中的抗干扰性考察。
图10为本发明实施例4所述NaCeF4:Er3+,Yb3+纳米探针检测去尿酸血清加不同浓度尿酸的光谱图。
图11为本发明实施例4所述NaCeF4:Er3+,Yb3+纳米探针检测去尿酸血清的尿酸浓度依赖型标准曲线。
图12为本发明实施例4所述NaCeF4:Er3+,Yb3+纳米探针检测血清中的尿酸与商用尿酸测试试剂盒检测结果的相关性对照图。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的检测方法和应用做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
部分仪器信息如下：
X射线衍射仪：理学公司，Miniflex600X射线粉末衍射仪；
荧光酶标仪：爱丁堡公司，FLS980荧光光谱仪；
透射电子显微镜：日本电子株式会社，JEOL-2010透射电子显微镜。
制备例1
采用酸洗处理的方法制备水溶性无油酸配体的NaCeF4:Tb3+荧光纳米材料：
取15mL无水乙醇溶液，滴入适量盐酸，使其pH＝1；将20mg的NaCeF4:Tb3+纳米颗粒(见图2所示)溶解于上述乙醇溶液，超声30min；离心后用无水乙醇及蒸馏水洗涤数次；清洗过程采用15000rpm的转速离心10分钟，最后获取的酸洗后纳米颗粒为透明状，最后将其分散于4mL的去离子水中。
其中，NaCeF4:Tb3+纳米颗粒可以由现有技术公开的方法制备得到，如采用文献：HLian,Y Dai,D Yang,Z Cheng,C Li,et al,Nanoscale,2014,6(16):9703-9712中的方法。
制备得到的水溶性无油酸配体的NaCeF4:Tb3+荧光纳米材料的表征结果见图3，由结果可以看出制得的纳米材料粒径较为均一，平均直径约为25.3±1.1nm。
实施例1
本实施例用于过氧化氢的生物检测，如下是具体的操作步骤：
(1)用聚苯乙烯96孔板为检测所用的载体，在设置好的微孔中加入8排100μL的制备例1所得NaCeF4:Tb3+纳米颗粒的水溶液，每排NaCeF4:Tb3+纳米颗粒的水溶液浓度依次是200、100、50、25、10、5、2.5、1μg/mL，每排依次加入12组不同浓度的过氧化氢100μL，其浓度分别为是10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156、0.078、0.039、0.019、0μM；每排分别得到12组混合液；在37摄氏度的恒温箱均匀震荡2h，分别测得8排12组混合液的发光强度，分别各组混合溶液的发光猝灭效率；当发光猝灭效率最大时混合液所对应的NaCeF4:Tb3+纳米颗粒浓度为2.5μg/mL，以此为标准浓度，绘制过氧化氢的浓度依赖型曲线，见图5。以过氧化氢在混合液中的浓度对荧光强度作图可以得到过氧化氢的浓度依赖型曲线，见图6。
图5中可以明显的看出，在一定浓度范围内，过氧化氢的浓度越高，相对应的混合溶液发光强度也越低，图6从图可以明显得知在一定浓度范围内，过氧化氢的浓度与发光强度呈良好的线性关系。图5和图6的结果表明，本实施例的检测方法可以用于对过氧化氢浓度的检测。
(2)用聚苯乙烯96孔板为检测所用的载体，在设置好的微孔依次加入100μL浓度为2.5μg/mL的NaCeF4:Tb3+纳米颗粒的水溶液，加入100μL未知浓度的过氧化氢，在37摄氏度的恒温箱均匀震荡2h，终止反应。将反应后的96孔板置于酶标仪中读测出混合溶液的发光强度，根据已绘制好过氧化氢的浓度依赖型曲线，计算得出体系中待测过氧化氢的浓度。
实施例2
本实施例用于生成过氧化氢体系的相关物质的浓度检测(以检测尿酸为例)，具体操作过程如下：
(1)用聚苯乙烯96孔板为检测所用的载体，在预设定好的微孔中加入100μL的NaCeF4:Tb3+纳米颗粒的水溶液，分别加入50μL不同浓度的尿酸，浓度分别为900、300、100、33.33、11.11、3.704、1.234、0.411、0.137、0.047、0.015、0μM；再加入50μL浓度为0.011U/mL的尿酸酶缓冲溶液(pH＝8.7)，得到12组混合液；在37摄氏度的恒温箱均匀震荡3h，反应停止，分别测得12组混合液的发光强度；空白组检测得到的发光强度最强，随着尿酸浓度的增加，发光强度逐渐减小，见图7。根据尿酸在混合液中的浓度对荧光强度作图可以得到尿酸的浓度依赖曲线，见图8。
(2)用聚苯乙烯96孔板为检测所用的载体，在设置好的微孔依次加入100μL浓度为2.5μg/mL的NaCeF4:Tb3+纳米颗粒的水溶液，加入50μL未知浓度的尿酸，再加入50μL浓度为0.011U/mL的尿酸酶，放置37摄氏度的恒温箱均匀震荡3h，终止反应。将反应后的96孔板置于酶标仪中读测出混合溶液的发光强度，根据已绘制尿酸的浓度依赖型曲线得出未知浓度尿酸的浓度。
实施例3
对识别待检测物尿酸的抗干扰性考察：
(1)本实施例所需试剂和仪器与实施例2相同，实施例所需NaCeF4:Er3+,Yb3+纳米颗粒的水溶液和尿酸酶的浓度与实施例2一致。
(2)实验选取血液中常见干扰物：缓冲液、果糖、半乳糖、蔗糖、金属盐离子(K+、Na+、Fe3+、Zn2+)、麦芽糖、人免疫球蛋白G(IgG)、人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、亮氨酸、赖氨酸、组氨酸、丝氨酸、色氨酸等等。
(3)首先在96孔板中对检测孔板进行分组设定，将1mM的上述干扰物加入到含有0.011U/mL的尿酸酶以及2.5μg/mL的NaCeF4:Er3+,Yb3+纳米颗粒的水溶液，得到18组混合液，将96孔板置于37摄氏度恒温箱振荡反应3h后，将反应后的96孔板放置于酶标仪中测定设定孔中18组混合溶液的发光强度，其对应的发光猝灭相对强度值见图9。
由图9的柱形图可以看出，只有尿酸能够有效抑制NaCeF4:Er3+,Yb3+纳米颗粒的发光强度，而其余干扰物对探针的发光影响非常小，因此在实际检测中能够避免这些干扰物的影响。
实施例4
复杂体系样品中尿酸检测结果与商用尿酸试剂盒的比较：
(1)本实施例所需试剂和仪器与实施例2相同，实施例所需NaCeF4:Er3+,Yb3+纳米颗粒的水溶液和尿酸酶溶液的浓度与实施例2一致。
(2)复杂体系实验所使用的模型基质为人血清。
本实施例血清样品中尿酸浓度的检测，可以利用商业尿酸测试试剂盒来验证其检测结果的可靠性，具体操作步骤如下：
尿酸在人血清中标准曲线的制备：
将血清样品预先用尿酸酶处理，水浴加热37摄氏度反应30min，以去除血清中含有的尿酸，接着把尿酸酶灭活，并加入N-乙基马来酰亚胺。将去除尿酸的血清作为分散液，配制不同浓度的尿酸血清溶液，并加入96孔板预设定孔内。将浓度为2.5μg/mL的NaCeF4:Er3+,Yb3+纳米颗粒的水溶液，与浓度为0.011U/mL的尿酸酶缓冲液(pH＝8.7)混合均匀。于37℃恒温振荡反应3h，反应结束，将96孔板置于带有酶标仪中测定设定孔的发光强度(见图10)。以尿酸浓度为横坐标，发光强度为纵坐标，制作尿酸在人血清中的标准曲线(见图11)。
取24份不同人的血清，用NaOH-H3BO3缓冲溶液将血清样品稀释10倍，在预设定好的微孔中分别加入100μL浓度为2.5μg/mL的NaCeF4:Er3+,Yb3+纳米颗粒的水溶液，50μL浓度为0.011U/mL的尿酸酶，100μL预处理的人血清，定混合溶液250μL。放置37摄氏度恒温箱振荡反应3h后，测定混合液的发光强度，然后代入标准曲线计算血清中的尿酸含量。
将上述24份血清分别用商用尿酸测试试剂盒检测其浓度值。
将NaCeF4:Er3+,Yb3+纳米颗粒测试出来的值为纵坐标，商用试剂盒测出来的值为横坐标做图，其结果如图12所示。从图可以明显看出本实施例测出人血清中的尿酸浓度值与商用测试试剂盒测定的值相关性很好，说明本实施例对复杂体系中尿酸浓度检测的可行性。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (42)

1.一种基于纳米探针的检测方法，其特征在于，该方法包括将待测目标物与纳米探针的水溶液混合；所述待测目标物选自过氧化氢或生成过氧化氢的酶促反应中的反应物，所述纳米探针为水溶性的稀土掺杂NaCeF4纳米材料；
所述水溶性的稀土掺杂NaCeF4纳米材料为NaCeF4:Tb3+或NaCeF4:(Er3+,Yb3+)；
所述反应物为生物酶以及所述生物酶对应的底物分子，所述底物分子为葡萄糖或血糖、尿酸、胆固醇、乙醇、肌氨酸、半乳糖或L-氨基酸；
所述生物酶为葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、胆固醇氧化酶、乙醇氧化酶、肌氨酸氧化酶、半乳糖氧化酶或L-氨基酸氧化酶。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测目标物选自过氧化氢或生成过氧化氢酶促反应中的生物酶对应的底物分子。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述待测目标物为过氧化氢、尿酸、血糖或乳酸。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测目标物选自血清中的过氧化氢或尿酸，或全血中的过氧化氢或尿酸。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述稀土掺杂NaCeF4纳米材料选自平均粒径7~200 nm的纳米颗粒。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述稀土掺杂NaCeF4纳米材料选自平均粒径10~80nm的纳米颗粒。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述水溶性的稀土掺杂NaCeF4纳米材料的表面无有机配体，所述有机配体为油酸、油胺或三辛胺。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述水溶性的稀土掺杂NaCeF4纳米材料是由稀土掺杂NaCeF4纳米颗粒采用酸洗处理的方法制备得到的，所述酸洗处理具体包括如下步骤：
a）配制pH在0.5~1.5之间的乙醇酸溶液；
b）将上述稀土掺杂NaCeF4纳米材料溶解于步骤a）所述乙醇酸溶液中，超声、洗涤后，得到水溶性的稀土掺杂NaCeF4纳米材料。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述稀土掺杂NaCeF4纳米材料在乙醇酸溶液中的浓度为1~3 mg/mL，所述超声的时间为20~40min，所述洗涤依次用去离子水和乙醇溶液洗涤数次。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，该方法还包括待测目标物与纳米探针水溶液混合后，测定混合液的发光强度，计算待测目标物的浓度。
11.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于，所述待测目标物的浓度通过代入待测目标物的浓度依赖型标准曲线计算得到。
12.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括配制不同浓度的纳米探针水溶液和待测目标物溶液。
13.根据权利要求1~12任一项所述的检测方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
1）将水溶性的稀土掺杂NaCeF4纳米材料分散于水溶液中，得到不同浓度的纳米材料水溶液；
2）配制不同浓度的待测目标物溶液：过氧化氢溶液或生物酶溶液；
3）将步骤1）所述纳米材料水溶液与步骤2）待测目标物溶液混合，孵育，测定混合液的发光强度，并且计算出发光猝灭效率，得到荧光猝灭效率最大时混合液所对应的纳米材料水溶液和待测目标物的浓度值；
4）绘制待测目标物的浓度依赖型标准曲线：以荧光猝灭效率最大时对应的纳米材料水溶液和待测目标物溶液的浓度为标准浓度，将标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的待测目标物溶液和不同浓度的待测目标物溶液混合，孵育，测定混合液的发光强度，做出待测目标物的浓度依赖型标准曲线；
5）检测待测目标物的浓度：将标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的待测目标物溶液和未知浓度的待测目标物溶液混合，孵育，测定混合液的发光强度，代入步骤4）绘制的待测目标物的浓度依赖型标准曲线，得出待测目标物的浓度。
14.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，步骤2）中，配制不同浓度的葡萄糖氧化酶、尿酸酶、胆固醇氧化酶、乙醇氧化酶、肌氨酸氧化酶、半乳糖氧化酶或L-氨基酸氧化酶的酶溶液。
15.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，步骤2）中，所述生物酶溶液由生物酶与缓冲溶液混合得到，所述缓冲溶液选自pH值为7~11的缓冲溶液。
16.根据权利要求15所述的检测方法，其特征在于，所述缓冲溶液选自Tris-HCl缓冲液、NaOH-H3BO3缓冲液、NaCO3-NaHCO3缓冲液或磷酸盐缓冲液。
17.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，步骤3）中，将步骤1）所述纳米材料水溶液与步骤2）过氧化氢溶液或生物酶溶液混合，孵育，测定混合液的发光强度，并且计算出发光猝灭效率，得到荧光猝灭效率最大时混合液所对应的纳米材料水溶液和过氧化氢溶液或生物酶溶液的浓度值。
18.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，步骤4）中，所述标准曲线的绘制具体步骤如下：以步骤3）的荧光猝灭效率最大时对应的纳米材料水溶液和过氧化氢溶液或生物酶溶液的浓度为标准浓度，将标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的过氧化氢溶液和不同浓度的过氧化氢溶液混合，或者，
将标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的生物酶溶液和不同浓度的底物溶液混合；
孵育，测定混合液的发光强度，做出待测目标物的浓度依赖型标准曲线。
19.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，步骤5）中，所述待测目标物的浓度具体通过以下步骤得到：将标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的过氧化氢溶液和未知浓度的过氧化氢溶液混合，或者，
将标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的生物酶溶液和未知浓度的底物溶液混合；孵育，测定混合液的发光强度，代入步骤4）所绘制的待测目标物的浓度依赖型标准曲线，得出待测目标物的浓度。
20.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，
步骤3）中，所述孵育的温度选自30~50℃；
所述孵育的时间选自60~240 min。
21.根据权利要求17所述的检测方法，其特征在于，步骤3）中，所述孵育的温度选自30~50℃；
所述孵育的时间选自60~240 min。
22.根据权利要求20或21所述的检测方法，其特征在于，步骤3）中，所述孵育的温度选自35~40℃；所述孵育的时间选自120~180 min。
23.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，步骤3）中，所述混合在酶标板中进行混合；所述纳米材料水溶液与过氧化氢溶液或生物酶溶液的浓度和体积按比例混合，以能够得到混合液的发光强度和发光猝灭效率最大时混合液所对应的纳米材料水溶液与过氧化氢或生物酶溶液的浓度值即可。
24.根据权利要求17所述的检测方法，其特征在于，步骤3）中，所述混合在酶标板中进行混合；所述纳米材料水溶液与过氧化氢溶液或生物酶溶液的浓度和体积按比例混合，以能够得到混合液的发光强度和发光猝灭效率最大时混合液所对应的纳米材料水溶液与过氧化氢或生物酶溶液的浓度值即可。
25.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，步骤4）中，所述孵育的温度选自30~50℃；
所述孵育的时间选自60~240 min。
26.根据权利要求18所述的检测方法，其特征在于，步骤4）中，所述孵育的温度选自30~50℃；
所述孵育的时间选自60~240 min。
27.根据权利要求25或26所述的检测方法，其特征在于，所述孵育的温度选自35~40℃；所述孵育的时间选自120~180 min。
28.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，所述待测目标物溶液的浓度为0~1000 μM；
所述待测目标物的浓度依赖型标准曲线是以待测目标物在混合液中的浓度为横坐标，对应的发光强度值为纵坐标进行绘制的。
29.根据权利要求18所述的检测方法，其特征在于，所述待测目标物溶液的浓度为0~1000 μM；
所述待测目标物的浓度依赖型标准曲线是以待测目标物在混合液中的浓度为横坐标，对应的发光强度值为纵坐标进行绘制的。
30.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，步骤5）中，所述孵育的温度选自30~50℃；
所述孵育的时间选自60~240 min。
31.根据权利要求19所述的检测方法，其特征在于，步骤5）中，所述孵育的温度选自30~50℃；
所述孵育的时间选自60~240 min。
32.根据权利要求30或31所述的检测方法，其特征在于，所述孵育的温度选自35~40℃；所述孵育的时间选自120~180 min。
33.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，步骤5）中，所述混合在酶标板中进行混合；所述标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的过氧化氢溶液和未知浓度的过氧化氢溶液的浓度和体积按比例混合；或者，所述标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的生物酶溶液和未知浓度的底物溶液的浓度和体积按比例混合；
混合的比例以能够得到在步骤4）的待测目标物的浓度依赖型标准曲线中读取出发光强度的即可。
34.根据权利要求19所述的检测方法，其特征在于，步骤5）中，所述混合在酶标板中进行混合；所述标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的过氧化氢溶液和未知浓度的过氧化氢溶液的浓度和体积按比例混合；或者，所述标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的生物酶溶液和未知浓度的底物溶液的浓度和体积按比例混合；
混合的比例以能够得到在步骤4）的待测目标物的浓度依赖型标准曲线中读取出发光强度的即可。
35.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
1）将水溶性的稀土掺杂NaCeF4纳米材料分散于水溶液中，得到不同浓度的纳米材料水溶液；
2）配制不同浓度的尿酸酶溶液：所述尿酸酶溶液由尿酸酶与NaOH-H3BO3缓冲溶液混合得到，所述尿酸酶的浓度大于0且小于等于0.011 U/mL；
3）将步骤1）所述纳米材料水溶液与步骤2）尿酸酶溶液混合，孵育，测定混合液的发光强度，并且计算出发光猝灭效率，得到荧光猝灭效率最大时混合液所对应的纳米材料水溶液和尿酸酶溶液的浓度值；
4）绘制尿酸的浓度依赖型标准曲线：以荧光猝灭效率最大时对应的纳米材料水溶液和尿酸酶溶液的浓度为标准浓度，将标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的尿酸酶溶液和不同浓度的尿酸混合；孵育，测定混合液的发光强度，做出尿酸的浓度依赖型标准曲线；
5）检测尿酸的浓度：将标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的尿酸酶溶液和未知浓度的尿酸溶液混合；孵育，测定混合液的发光强度，代入绘制的尿酸的浓度依赖型标准曲线，得出尿酸的浓度。
36.根据权利要求35所述的检测方法，其特征在于，步骤3）中，所述纳米材料水溶液与尿酸酶溶液的浓度和体积按比例混合，以能够得到混合液的发光强度和发光猝灭效率最大时混合液所对应的纳米材料水溶液与尿酸酶溶液的浓度值即可。
37.根据权利要求35所述的检测方法，其特征在于，步骤5）中，所述标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的尿酸酶溶液和未知浓度的尿酸溶液的浓度和体积按比例混合，以能够得到在步骤4）的尿酸的浓度依赖型标准曲线中读取出发光强度的即可。
38.权利要求1~37任一项所述检测方法的用途，其用于过氧化氢或生成过氧化氢的酶促反应中反应物的检测。
39.根据权利要求38所述的用途，其特征在于，所述检测方法用于血清中的过氧化氢或尿酸的检测，或全血样品中的过氧化氢或尿酸的检测。
40.水溶性的稀土掺杂NaCeF4纳米材料作为权利要求1~37任一项所述检测方法中的纳米探针的用途，所述水溶性的稀土掺杂NaCeF4纳米材料为NaCeF4:Tb3+或NaCeF4:(Er3+,Yb3 +)。
41.一种用于权利要求1~37任一项所述检测方法的试剂盒，其包含一种纳米探针，所述纳米探针为水溶性的稀土掺杂NaCeF4纳米材料NaCeF4:Tb3+或NaCeF4:(Er3+,Yb3+)。
42.一种用于权利要求1~37任一项所述检测方法的生物传感器，其包含一种纳米探针，所述纳米探针为水溶性的稀土掺杂NaCeF4纳米材料NaCeF4:Tb3+或NaCeF4:(Er3+,Yb3+)。
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