CN111829993B - CaS纳米荧光探针检测过氧化氢和相关目标物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物检测技术领域,公开了一种基于纳米探针检测过氧化氢和相关目标物的方法。所述方法采用水溶性稀土掺杂CaS:Ce3+/Ln3+纳米材料作为荧光探针,通过过氧化氢与铈离子的氧化还原反应,猝灭稀土离子发光,利用掺杂稀土离子荧光强度的变化实现对过氧化氢浓度的检测。本发明不仅可以用于标准液中过氧化氢或生成过氧化氢的酶促反应中反应物的检测,也可以进一步实现对血清中的过氧化氢、生物酶或底物(如黄嘌呤)的检测,具备操作简便、抗干扰性好、快速灵敏、经济实用等优点,可为解决复杂体系中过氧化氢和过氧化氢生成体系相关物质的实时检测提供理论依据和技术支持,具有一定的临床应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域,具体涉及一种基于CaS纳米荧光探针检测过氧化氢和相关目标物的方法。
背景技术
过氧化氢(H2O2,俗称双氧水)溶液为无色无味液体,是目前广泛应用于造纸业和纺织业等的一种强氧化剂。人体中许多的生化反应都会产生过氧化氢,如黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的催化作用下会产生过氧化氢。但是过氧化氢积累过多会加速人体的衰老,诱发癌症的产生,以及引发糖尿病和肾脏等疾病。目前越来越多的人因为不良的生活习惯以及饮食习惯,而患上高尿酸症、痛风等及疾病,患者饱受疾病的痛苦。所以,在复杂体系中实现精准快速的过氧化氢及其相关物浓度的检测,对由过氧化氢积累过多而引起的疾病的早期诊断和治疗起重要作用。
目前,关于过氧化氢以及相关物的检测的主要方法有电化学法、色谱法和分光光度计法等,但是这些方法均存在一定的不足,如,这些方法对仪器和样品的要求都比较高,并且无法避免血液中复杂成分的干扰,使得这些方法无法实现对过氧化氢以及相关物浓度快速精准的直接检测。因此,还需探究对其微量检测的简便准确快捷的方法。
与传统有机染料和无机半导体纳米材料相比,稀土掺杂纳米荧光材料如近红外纳米材料具有低自身荧光,深穿透性以及高分辨率的特点,上转换纳米材料具有发射峰窄、无自发荧光、近红外激发零背景、光稳定性好等优势,非常适合疾病标志物的检测,为发展便捷、经济、精准的过氧化氢及其相关物的检测方法提供一种新思路。
发明内容
本发明提供了一种基于稀土掺杂CaS纳米荧光探针的过氧化氢及其过氧化氢生成体系相关物质的检测方法,特别是提供一种基于CaS:Ce3+/Er3+近红外II区纳米荧光探针检测过氧化氢和黄嘌呤的方法;本发明所述的方法只需通过简单混合即可实现血清或全血中过氧化氢和黄嘌呤的高灵敏度、高选择性和低成本的检测。
一种基于纳米探针的检测方法,该方法包括将待测目标物与纳米探针的水溶液混合;
所述待测目标物可以选自过氧化氢或生成过氧化氢的酶促反应中的反应物,例如所述反应物可以为黄嘌呤氧化酶、葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、胆固醇氧化酶、乙醇氧化酶、肌氨酸氧化酶、半乳糖氧化酶和L-氨基酸氧化酶等中的至少一种,以及上述生物酶对应的底物分子,例如黄嘌呤、血糖、尿酸、胆固醇、乙醇、肌氨酸、半乳糖和L-氨基酸等中的至少一种;
优选地,所述待测目标物选自过氧化氢或生成过氧化氢酶促反应中的生物酶对应的底物分子;例如待测目标物可以为过氧化氢、黄嘌呤、尿酸、血糖、乳酸等;
根据本发明示例性的实施方案,所述待测目标物选自血清或全血中的过氧化氢或黄嘌呤;
所述纳米探针为水溶性的稀土掺杂CaS纳米材料。
根据本发明,所述稀土掺杂CaS纳米材料可以以化学式CaS:Ce3+/Ln3+表示,其中Ln可以选自稀土元素La、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu中的一种、两种或更多种;根据本发明示例性的实施方案,所述稀土掺杂CaS纳米材料可以选自CaS:Ce3+/Er3+(例如CaS:0.07mol%Ce3+,0.5mol%Er3+)、CaS:Ce3+/Nd3+、CaS:Ce3+/Tb3+、CaS:Ce3+/Sm3+中的至少一种。
优选地,所述稀土掺杂CaS纳米材料可以选自平均粒径5~100nm的纳米颗粒,如10~50nm,示例性地,粒径可以为10nm、15nm、20nm、26nm;
优选地,所述水溶性的稀土掺杂CaS纳米材料的表面修饰有二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基(DSPE-PEG-NH2)。
优选地,所述水溶性的稀土掺杂CaS纳米材料是由油溶性稀土掺杂CaS纳米颗粒(例如其表面带有有机配体油酸、油胺、三辛胺等)采用表面吸附的方法制备得到DSPE-PEG-NH2修饰的水溶性的稀土掺杂CaS纳米材料,其表面的-NH2使得所述纳米材料可以均匀分散于水溶液中。所述表面吸附的方法具体包括如下步骤:
a)将油溶性CaS:Ce3+/Ln3+纳米颗粒溶解在氯仿中,得到溶液一;
b)将溶解在氯仿或其它低沸点溶剂中(如甲苯、DMF等)的DSPE-PEG-NH2在不断搅拌状态下逐滴滴加进入所述溶液一中,得到溶液二;
c)所述溶液二在30-40℃下反应,待氯仿挥发完毕;
d)步骤(c)完成后,离心,用去离子水洗涤数次,得到所述水溶性的稀土掺杂CaS纳米材料。
优选地,步骤(a)中所述稀土掺杂CaS纳米材料在所述溶液一中的浓度为1~3mg/mL,例如浓度为1.5~3mg/mL,作为示例,浓度为2mg/mL。
优选地,步骤(c)中所述反应的时间为20~40min,,例如时间为25~35min,作为示例,时间为30min。
优选地,所述稀土掺杂CaS纳米材料与DSPE-PEG-NH2的质量比为1:(1~20),如1:(1~10),示例性地为1:5。
根据本发明,该方法还包括待测目标物与纳米探针水溶液混合后,测定混合液的发光强度,计算待测目标物的浓度。
优选地,所述待测目标物的浓度通过代入待测目标物的浓度依赖型标准曲线计算得到。
根据本发明,所述方法还包括配制不同浓度的纳米探针水溶液和待测目标物溶液。
根据本发明,所述方法具体包括以下步骤:
1)将水溶性的稀土掺杂CaS纳米材料分散于水溶液中,得到不同浓度的纳米材料水溶液;
2)配制不同浓度的待测目标物溶液;
优选地,配制不同浓度的过氧化氢溶液或生物酶溶液;例如,配制不同浓度的黄嘌呤氧化酶、葡萄糖氧化酶、尿酸酶、胆固醇氧化酶、乙醇氧化酶、肌氨酸氧化酶、半乳糖氧化酶、1-氨基酸氧化酶等酶溶液;示例性地,配制不同浓度的黄嘌呤氧化酶溶液;
3)将步骤1)所述纳米材料水溶液与步骤2)待测目标物溶液混合,孵育,测定混合液的发光强度,并且计算出发光猝灭效率,得到荧光猝灭效率最大时混合液所对应的纳米材料水溶液和待测目标物的浓度值;
优选地,将步骤1)所述纳米材料水溶液与步骤2)过氧化氢溶液或生物酶溶液混合,孵育,测定混合液的发光强度,并且计算出发光猝灭效率,得到荧光猝灭效率最大时混合液所对应的纳米材料水溶液和过氧化氢溶液或生物酶溶液的浓度值;
示例性地,将步骤1)所述纳米材料水溶液与步骤2)黄嘌呤氧化酶溶液混合,孵育,测定混合液的发光强度,并且计算出发光猝灭效率,得到荧光猝灭效率最大时混合液所对应的纳米材料水溶液和黄嘌呤氧化酶溶液的浓度值;
4)绘制待测目标物的浓度依赖型标准曲线;
优选地,所述待测目标物的浓度依赖型标准曲线绘制具体步骤如下:以荧光猝灭效率最大时对应的纳米材料水溶液和待测目标物溶液的浓度为标准浓度,将标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的待测目标物溶液和不同浓度的待测目标物溶液混合,孵育,测定混合液的发光强度,做出待测目标物的浓度依赖型标准曲线;
更优选地,所述标准曲线的绘制具体步骤如下:以步骤3)的荧光猝灭效率最大时对应的纳米材料水溶液和过氧化氢溶液或生物酶溶液的浓度为标准浓度,将标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的过氧化氢溶液和不同浓度的过氧化氢溶液混合,或者,
将标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的生物酶溶液和不同浓度的底物溶液混合;
孵育,测定混合液的发光强度,做出待测目标物的浓度依赖型标准曲线;
示例性地,所述待测目标物的浓度依赖型标准曲线由以下步骤绘制得到:以荧光猝灭效率最大时对应的纳米材料水溶液和黄嘌呤氧化酶溶液的浓度为标准浓度,将标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的黄嘌呤氧化酶溶液和不同浓度的尿酸混合;孵育,测定混合液的发光强度,做出黄嘌呤的浓度依赖型标准曲线;
5)检测待测目标物的浓度;
优选地,所述待测目标物的浓度具体通过以下步骤测得:将标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的待测目标物溶液和未知浓度的待测目标物溶液混合,孵育,测定混合液的发光强度,代入步骤4)绘制的待测目标物的浓度依赖型标准曲线,得出待测目标物的浓度;
更优选地,所述待测目标物的浓度具体通过以下步骤得到:将标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的过氧化氢溶液和未知浓度的过氧化氢溶液混合,或者,
将标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的生物酶溶液和未知浓度的底物溶液混合;孵育,测定混合液的发光强度,代入步骤4)所绘制的待测目标物的浓度依赖型标准曲线,得出待测目标物的浓度;
示例性地,所述待测目标物的浓度具体通过以下步骤得到:将标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的黄嘌呤氧化酶溶液和未知浓度的黄嘌呤溶液混合;孵育,测定混合液的发光强度,代入绘制的黄嘌呤的浓度依赖型标准曲线,得出黄嘌呤的浓度。
根据本发明,步骤2)中所述生物酶溶液由生物酶与缓冲溶液混合得到;
优选地,所述缓冲溶液可以选自pH值为7~11的缓冲溶液;例如,所述缓冲溶液可以选自Tris-HCl缓冲液、NaOH-H3BO3缓冲液等;根据本发明示例性的实施方案,所述缓冲溶液选自Tris-HCl,其pH为8.2;
根据本发明示例性的实施方案,所述黄嘌呤氧化酶溶液由黄嘌呤氧化酶与Tris-HCl缓冲溶液混合得到;所述黄嘌呤氧化酶的浓度大于0且小于等于0.25mU/mL。
根据本发明,步骤3)中所述孵育的温度可以选自30~50℃,优选地,所述孵育的温度选自35~40℃,根据本发明示例性的实施方案,所述孵育的温度为37℃;
所述孵育的时间可以选自60~240min,优选地,所述孵育的时间选自120~180min;根据本发明示例性的实施方案,所述孵育的时间为180min;
优选地,所述混合优选在酶标板中进行混合,例如在96孔酶标板中进行混合;所述纳米材料水溶液与过氧化氢溶液或生物酶溶液的浓度和体积可以按任意比例混合;优选为能够得到混合液的发光强度和发光猝灭效率最大时混合液所对应的纳米材料水溶液与过氧化氢溶液或生物酶溶液的浓度值即可;
示例性地,所述混合优选在酶标板中进行混合,例如在96孔酶标板中进行混合;所述纳米材料水溶液与黄嘌呤氧化酶溶液的浓度和体积可以按任意比例混合;优选为能够得到混合液的发光强度和发光猝灭效率最大时混合液所对应的纳米材料水溶液与黄嘌呤氧化酶溶液的浓度值即可。
根据本发明,步骤4)中所述孵育的温度可以选自30~50℃,优选地,所述孵育的温度选自35~40℃,根据本发明示例性的实施方案,所述孵育的温度为37℃;
所述孵育的时间可以选自60~240min,优选地,所述孵育的时间选自120~180min;根据本发明示例性的实施方案,所述孵育的时间为180min;
优选地,所述混合优选在酶标板中进行混合,例如在96孔酶标板中进行混合;所述标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的过氧化氢溶液和不同浓度的过氧化氢溶液的浓度和体积可以按任意比例混合;
或者,标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的生物酶溶液和不同浓度的底物溶液的浓度和体积可以按任意比例混合;
示例性地,所述混合优选在酶标板中进行混合,例如在96孔酶标板中进行混合;所述标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的黄嘌呤氧化酶溶液和不同浓度的尿酸溶液的浓度和体积可以按任意比例混合;
例如,所述待测目标物溶液的浓度为0~900μM,例如0~200μM、0~20μM;优选为能够得到绘制待测目标物的浓度依赖型标准曲线即可;
优选地,所述待测目标物的浓度依赖型标准曲线是以待测目标物在混合液中的浓度为横坐标,对应的发光强度值为纵坐标进行绘制的。
根据本发明,步骤5)中所述孵育的温度可以选自30~50℃,优选地,所述孵育的温度选自35~40℃,根据本发明示例性的实施方案,所述孵育的温度为37℃;
所述孵育的时间可以选自60~240min,优选地,所述孵育的时间选自120~180min;根据本发明示例性的实施方案,所述孵育的时间为180min;
所述混合优选在酶标板中进行混合,例如在96孔酶标板中进行混合;所述标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的过氧化氢溶液和未知浓度的过氧化氢溶液的浓度和体积可以按任意比例混合;所述标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的生物酶溶液和未知浓度的底物溶液的浓度和体积可以按任意比例混合;优选为能够得到在步骤4)的待测目标物的浓度依赖型标准曲线中读取出发光强度的即可;
示例性地,所述标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的黄嘌呤氧化酶溶液和未知浓度的黄嘌呤溶液的浓度和体积可以按任意比例混合;优选为能够得到在步骤4)的黄嘌呤的浓度依赖型标准曲线中读取出发光强度的即可。
根据本发明,步骤3)、4)和5)中所述混合液的发光强度的测定在FLS980荧光光谱仪中进行。
本发明还提供了上述检测方法的用途,其用于过氧化氢或生成过氧化氢的酶促反应中反应物的检测;
优选地,所述检测方法用于血清或全血样品中的过氧化氢或黄嘌呤的检测。
本发明还提供了上述水溶性的稀土掺杂CaS纳米材料作为纳米探针的用途,优选地,所述水溶性的稀土掺杂CaS纳米材料具有如上文所述的定义。
本发明还提供了一种试剂盒,其包含一种纳米探针,所述纳米探针为水溶性的稀土掺杂CaS纳米材料,所述水溶性的稀土掺杂CaS纳米材料具有如上文所述的定义。
本发明还提供了一种生物传感器,其包含一种纳米探针,所述纳米探针为水溶性的稀土掺杂CaS纳米材料,所述水溶性的稀土掺杂CaS纳米材料具有如上文所述的定义。
申请人在本发明的研究中发现,过氧化氢的存在可以有效猝灭稀土掺杂CaS:Ce3+/Ln3+纳米颗粒发光,体系中的过氧化氢时可以将Ce3+氧化成Ce4+,从而可以猝灭稀土发光(如图1所示)。过氧化氢的含量与稀土发光猝灭强度正相关,因此可以通过稀土掺杂CaS:Ce3+/Ln3+纳米材料的发光强弱反映待检测体系中过氧化氢的含量,进而也可以检测生成过氧化氢的生化体系(如黄嘌呤+黄嘌呤氧化酶,尿酸+尿酸酶,葡萄糖(血糖)+葡萄糖氧化酶、乳酸+乳酸酶等体系,底物在对应的生物酶作用下生成过氧化氢,如黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶作用下能够生成过氧化氢),通过检测生成的过氧化氢可以实现对底物(如黄嘌呤)的定量检测。
本发明的有益效果在于:
本发明提供了一种通过稀土掺杂CaS:Ce3+/Ln3+纳米材料中铈离子氧化还原反应检测待测目标物的方法,特别是提供一种基于CaS:Ce3+/Er3+近红外II区纳米荧光探针检测过氧化氢和黄嘌呤的方法。与传统的荧光探针检测方法相比,本发明所述的方法无需进行荧光受体或荧光供体-受体复合物的前期制备,只需将水溶性的稀土掺杂CaS:Ce3+/Ln3+纳米材料和待检测目标物进行简单混合,通过光谱测试即可精准测定待检测物的浓度,操作简易方便、成本低廉、省时省力。
本发明可以用于过氧化氢或生成过氧化氢的酶促反应中反应物的检测,也可以进一步实现对血清中的过氧化氢、生物酶或相应底物(如黄嘌呤)的检测,具备操作简便、抗干扰性好、快速灵敏(对过氧化氢和黄嘌呤的检测极限分别为21.1nM和32.0nM)、经济实用等优点,可为解决复杂体系中过氧化氢和尿酸的实时监测提供理论依据和技术支持,具有一定的临床应用潜力。
附图说明
图1为本发明所述水溶性的稀土掺杂CaS:Ce3+/Ln3+纳米探针检测过氧化氢的原理示意图。
图2为本发明制备例1所述油溶性CaS:Ce3+/Er3+的物化表征结果。
图3为本发明制备例1所述油溶性CaS:Ce3+/Er3+纳米颗粒(a)和制备例2所述水溶性CaS:Ce3+/Er3+纳米颗粒(b)的红外谱图。
图4为本发明制备例1所述油溶性CaS:Ce3+/Er3+纳米颗粒(a)和制备例2所述水溶性CaS:Ce3+/Er3+纳米颗粒(b)的热重分析。
图5为本发明实施例1所述水溶性CaS:Ce3+/Er3+纳米颗粒与过氧化氢反应前后的XRD衍射谱图。
图6为本发明实施例1所述a)不同浓度过氧化氢作用下混合液的光谱图和b)过氧化氢浓度依赖型响应曲线。
图7为本发明实施例2所述a)不同浓度黄嘌呤作用下混合液的光谱图和b)黄嘌呤浓度依赖型响应曲线。
图8为本发明实施例3黄嘌呤检测中的抗干扰性考察。
图9为本发明实施例4去黄嘌呤血清的黄嘌呤浓度依赖型标准曲线。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解,下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明,而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明,以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品,或者可以通过已知方法制备。
部分仪器信息如下:
X射线衍射仪:理学公司,Miniflex600X射线粉末衍射仪;
荧光酶标仪:爱丁堡公司,FLS980荧光光谱仪;
透射电子显微镜:日本电子株式会社,JEOL-2010透射电子显微镜。
制备例1油溶性CaS:0.07mol%Ce3+,0.5mol%Er3+纳米颗粒的制备
1)称取0.9943mmol Ca(CH3COO)2·H2O、0.0007mmol Ce(CH3COO)3·4H2O,0.005mmol Er(CH3COO)3·4H2O然后加入2mL油酸和6mL油胺和12mL三辛胺,通氮气加热至120℃并保温30分钟,形成透明溶液A;
2)然后降至室温;称取3mmol的DPTU(N’N-二苯基硫脲),溶于10mL乙醇中,并逐滴加入到溶液A中,继续搅拌10min使之充分混匀,升温至80℃,保温30min,形成透明溶液B;
3)升温至320℃,保温1h,降至室温;加入20mL乙醇沉淀分离并洗涤数次,得到26nm左右的油溶性CaS:0.07mol%Ce3+,0.5mol%Er3+纳米颗粒。
图2中a为油溶性CaS:0.07mol%Ce3+,0.5mol%Er3+纳米颗粒的XRD衍射图,相应的衍射峰与标准PDF卡片一一对应,说明:我们成功地合成了立方相的CaS:0.07mol%Ce3+,0.5mol%Er3+纳米颗粒。图2中b为油溶性CaS:0.07mol%Ce3+,0.5mol%Er3+纳米颗粒的TEM电镜图,纳米颗粒大小均匀,平均粒径约为26nm。
制备例2水溶性CaS:0.07mol%Ce3+,0.5mol%Er3+纳米颗粒的制备
1)将制备例1所得油溶性CaS:0.07mol%Ce3+,0.5mol%Er3+纳米颗粒溶解在氯仿中,得到溶液一,溶液一中CaS:0.07mol%Ce3+,0.5mol%Er3+纳米颗粒的浓度为2mg/mL;
2)将溶解在氯仿中的DSPE-PEG-NH2在不断搅拌状态下逐滴滴加进入溶液一中,得到溶液二;
步骤(1)油溶性CaS:0.07mol%Ce3+,0.5mol%Er3+纳米颗粒与DSPE-PEG-NH2的质量比为1:5;
3)将溶液二在30℃下反应5h左右,待氯仿挥发完毕;
4)步骤3)完成后离心,用去离子水洗涤数次,得到DSPE-PEG-NH2修饰的水溶性的稀土掺杂CaS纳米材料,将其重新分散在超纯水中,在4℃下保存使用;
图3为CaS:0.07mol%Ce3+,0.5mol%Er3+油溶性(见图3中a)以及水溶性(见图3中b)纳米颗粒的FT-IR图,表面修饰前后2924和2851cm-1的两个峰归属于油酸配体中碳链的对称和不对称伸缩振动但表面修饰后峰的强度明显变弱。表面修饰后3328cm-1以及1576cm-1处-NH2-和-NH-C=O特征峰的出现,说明:我们成功地在CaS:0.07mol%Ce3+,0.5mol%Er3+纳米颗粒表面修饰了DSPE-PEG-NH2,得到水溶性的CaS:0.07mol%Ce3+,0.5mol%Er3+纳米颗粒。
图4中CaS:0.07mol%Ce3+,0.5mol%Er3+油溶性(a)以及水溶性(b)纳米颗粒的热重分析图,对比表面修饰前后,纳米颗粒失重的不同说明纳米颗粒的表面特征发生了改变,间接说明我们成功地在CaS:0.07mol%Ce3+,0.5mol%Er3+纳米颗粒表面修饰了DSPE-PEG-NH2。
实施例1
本实施例用于过氧化氢的生物检测,如下是具体的操作步骤:
(1)用聚苯乙烯96孔板为检测所用的载体,在设置好的微孔中加入8排100μL的制备例2所得CaS:0.07mol%Ce3+,0.5mol%Er3+纳米颗粒的水溶液,CaS:0.07mol%Ce3+,0.5mol%Er3+纳米颗粒的水溶液浓度依次是200、100、50、25、10、5、2.5、1μg/mL,依次加入浓度为20μM的过氧化氢100μL,分别得到8组混合液;在37摄氏度的恒温箱均匀震荡2h,分别测得8组混合液的发光强度,分别各组混合溶液的发光猝灭效率;当发光猝灭效率最大时混合液所对应的CaS:0.07mol%Ce3+,0.5mol%Er3+纳米颗粒浓度为0.5mg/mL。
(2)用聚苯乙烯96孔板为检测所用的载体,在设置好的微孔依次加入100μL浓度为0.5mg/mL的CaS:0.07mol%Ce3+,0.5mol%Er3+纳米颗粒的水溶液,依次加入100μL不同浓度的过氧化氢,浓度分别为20、10、5、2.5、1.25、0.63、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01、0μM在37摄氏度的恒温箱均匀震荡2h,终止反应。将反应后的96孔板置于酶标仪中读测出混合溶液的发光强度,不同浓度过氧化氢作用下混合液的光谱图和过氧化氢浓度依赖型响应曲线,见图6。
图6中的a可以明显地看出,在一定浓度范围内,过氧化氢的浓度越高,相对应的混合溶液发光强度也越低,从图6中的b可以明显得知在一定浓度范围内,过氧化氢的浓度与发光强度呈良好的线性关系。
图6的结果表明,本实施例的检测方法可以实现对过氧化氢浓度的检测。
同时图5为水溶性CaS:0.07mol%Ce3+,0.5mol%Er3+纳米颗粒与过氧化氢反应前后的XRD衍射谱图,表明在与过氧化氢反应前后纳米颗粒依然保持纯相,也间接说明本实施例方法的可行性。
实施例2
本实施例用于生成过氧化氢体系的相关物质的浓度检测(以检测黄嘌呤为例),具体操作过程如下:
用聚苯乙烯96孔板为检测所用的载体,在预设定好的微孔中加入100μL的制备例2制备的水溶性CaS:0.07mol%Ce3+,0.5mol%Er3+纳米颗粒的水溶液,分别加入100μL不同浓度的黄嘌呤,浓度分别为200、100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.19、0.10、0μM;再加入100μL浓度为0.25U/mL的黄嘌呤氧化酶酶缓冲溶液(pH=8.2),得到13组混合液;在37摄氏度的恒温箱均匀震荡3h,反应停止,分别测得13组混合液的发光强度;空白组检测得到的发光强度最强,随着黄嘌呤浓度的增加,发光强度逐渐减小(见图7中的a)。根据黄嘌呤在混合液中的浓度对荧光强度作图可以得到黄嘌呤的浓度依赖曲线(见图7中的b)。
实施例3
对识别待检测物黄嘌呤的抗干扰性考察:
(1)本实施例所需试剂和仪器与实施例2相同,实施例所需CaS:0.07mol%Ce3+,0.5mol%Er3+纳米颗粒的水溶液和黄嘌呤氧化酶的浓度与实施例2一致。
(2)实验选取血液中常见干扰物:缓冲液、果糖、半乳糖、蔗糖、金属盐离子(K+、Na+、Zn2+)、麦芽糖、人免疫球蛋白G(IgG)、人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、亮氨酸、赖氨酸、组氨酸、丝氨酸、色氨酸等等。
(3)首先在96孔板中对检测孔板进行分组设定,将200μM的上述干扰物加入到含有0.25mU/mL的黄嘌呤氧化酶以及0.5mg/mL的CaS:0.07mol%Ce3+,0.5mol%Er3+纳米颗粒的水溶液,得到21组混合液,将96孔板置于37摄氏度恒温箱振荡反应3h后,将反应后的96孔板放置于酶标仪中测定设定孔中18组混合溶液的发光强度,其对应的发光猝灭相对强度值见图8。
由图8的柱形图可以看出,只有黄嘌呤能够有效抑制CaS:0.07mol%Ce3+,0.5mol%Er3+纳米颗粒的发光强度,而其余干扰物对探针的发光影响非常小,因此在实际检测中能够避免这些干扰物的影响。
实施例4
黄嘌呤在人血清中的标准曲线的制备:
将血清样品预先用黄嘌呤氧化酶处理,以去除血清中固有的黄嘌呤,之后在100℃高温下将黄嘌呤氧化酶灭活。将去除黄嘌呤的血清作为分散液,配制不同浓度的黄嘌呤血清溶液,并加入96孔板预设定孔内。将制备例2制备的水溶性CaS:0.07mol%Ce3+,0.5mol%Er3+纳米颗粒水溶液(0.5mg mL-1),黄嘌呤缓冲液溶液(200μM),葡萄糖氧化酶(0.25mU mL-1)与黄嘌呤血清溶液混合均匀。于37℃恒温振荡反应1h,将反应后的96孔板置于酶标仪中测定设定孔的近红外荧光信号。最后得到黄嘌呤在人血清中的标准曲线如图9。
以上,对本发明的实施方式进行了说明。但是,本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (13)
1.基于纳米探针的检测方法,其特征在于,该方法包括将待测目标物与纳米探针的水溶液混合,测定混合液的发光强度,计算待测目标物的浓度,所述待测目标物的浓度通过代入待测目标物的浓度依赖型标准曲线计算得到;
所述待测目标物的浓度依赖型标准曲线的绘制具体步骤如下:以荧光猝灭效率最大时对应的纳米材料水溶液和待测目标物溶液的浓度为标准浓度,将标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的待测目标物溶液和不同浓度的待测目标物溶液混合,孵育,测定混合液的发光强度,做出待测目标物的浓度依赖型标准曲线;
所述待测目标物选自过氧化氢或生成过氧化氢的酶促反应中的反应物;所述反应物为黄嘌呤氧化酶、葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、胆固醇氧化酶、乙醇氧化酶、肌氨酸氧化酶、半乳糖氧化酶和L-氨基酸氧化酶中的至少一种,以及上述生物酶对应的底物分子;
所述纳米探针为水溶性的稀土掺杂CaS纳米材料,由油溶性稀土掺杂CaS纳米颗粒采用表面吸附的方法制备得到,所述表面吸附的方法具体包括如下步骤:
a)将油溶性CaS:Ce3+/Ln3+纳米颗粒溶解在氯仿中,得到溶液一;
b)将溶解在氯仿或其它低沸点溶剂中的DSPE-PEG-NH2在不断搅拌状态下逐滴滴加进入所述溶液一中,得到溶液二;
c)所述溶液二在30-40℃下反应,待氯仿挥发完毕;
d)步骤(c)完成后,离心、洗涤,得到所述水溶性的稀土掺杂CaS纳米材料。
2.根据权利要求1所述的基于纳米探针的检测方法,其特征在于,所述底物分子为黄嘌呤、血糖、尿酸、胆固醇、乙醇、肌氨酸、半乳糖和L-氨基酸中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的基于纳米探针的检测方法,其特征在于,所述稀土掺杂CaS纳米材料以化学式CaS:Ce3+/Ln3+表示,其中Ln选自稀土元素La、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu中的一种、两种或更多种;
所述稀土掺杂CaS纳米材料选自平均粒径5~100nm的纳米颗粒;
所述水溶性的稀土掺杂CaS纳米材料的表面修饰有二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基(DSPE-PEG-NH2)。
4.根据权利要求1或2所述的基于纳米探针的检测方法,其特征在于,所述方法还包括配制不同浓度的纳米探针水溶液和待测目标物溶液。
5.根据权利要求1-2任一项所述的基于纳米探针的检测方法,其特征在于,所述方法具体包括以下步骤:
1)将所述水溶性的稀土掺杂CaS纳米材料分散于水溶液中,得到不同浓度的纳米材料水溶液;
2)配制不同浓度的待测目标物溶液;
3)将步骤1)所述水溶性的稀土掺杂CaS纳米材料水溶液与步骤2)待测目标物溶液混合,孵育,测定混合液的发光强度,并且计算出发光猝灭效率,得到荧光猝灭效率最大时混合液所对应的纳米材料水溶液和待测目标物的浓度值;
4)绘制待测目标物的浓度依赖型标准曲线:以荧光猝灭效率最大时对应的纳米材料水溶液和待测目标物溶液的浓度为标准浓度,将标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的待测目标物溶液和不同浓度的待测目标物溶液混合,孵育,测定混合液的发光强度,做出待测目标物的浓度依赖型标准曲线;
5)检测待测目标物的浓度:将标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的待测目标物溶液和未知浓度的待测目标物溶液混合,孵育,测定混合液的发光强度,代入步骤4)绘制的待测目标物的浓度依赖型标准曲线,得出待测目标物的浓度。
6.根据权利要求5所述的基于纳米探针的检测方法,其特征在于,所述方法具体包括以下步骤:
1)将所述水溶性的稀土掺杂CaS纳米材料分散于水溶液中,得到不同浓度的纳米材料水溶液;
2)配制不同浓度的过氧化氢溶液或生物酶溶液;
3)将步骤1)所述水溶性的稀土掺杂CaS纳米材料水溶液与步骤2)过氧化氢溶液或生物酶溶液混合,孵育,测定混合液的发光强度,并且计算出发光猝灭效率,得到荧光猝灭效率最大时混合液所对应的纳米材料水溶液和过氧化氢溶液或生物酶溶液的浓度值;
4)所述标准曲线的绘制具体步骤如下:以步骤3)的荧光猝灭效率最大时对应的纳米材料水溶液和过氧化氢溶液或生物酶溶液的浓度为标准浓度,将标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的过氧化氢溶液和不同浓度的过氧化氢溶液混合,或者,
将标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的生物酶溶液和不同浓度的底物溶液混合;
孵育,测定混合液的发光强度,做出待测目标物的浓度依赖型标准曲线;
5)检测待测目标物的浓度:将标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的过氧化氢溶液和未知浓度的过氧化氢溶液混合,或者,将标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的生物酶溶液和未知浓度的底物溶液混合;孵育,测定混合液的发光强度,代入步骤4)所绘制的待测目标物的浓度依赖型标准曲线,得出待测目标物的浓度。
7.根据权利要求5所述的基于纳米探针的检测方法,其特征在于,步骤2)中所述生物酶溶液由生物酶与缓冲溶液混合得到;
所述缓冲溶液选自pH值为7~11的缓冲溶液;
步骤3)中所述孵育的温度为30~50℃,所述孵育的时间为60~240min;
步骤4)中所述孵育的温度为30~50℃,所述孵育的时间为60~240min;
所述待测目标物溶液的浓度为0~900μM;
所述待测目标物的浓度依赖型标准曲线是以待测目标物在混合液中的浓度为横坐标,对应的发光强度值为纵坐标进行绘制的;
步骤5)中所述孵育的温度为30~50℃,所述孵育的时间为60~240min。
8.根据权利要求1-2任一项所述的基于纳米探针的检测方法,其特征在于,所述检测方法具体包括如下步骤:
1)将水溶性的稀土掺杂CaS纳米材料分散于水溶液中,得到不同浓度的纳米材料水溶液;
2)配制不同浓度的黄嘌呤氧化酶溶液:所述黄嘌呤氧化酶溶液由黄嘌呤氧化酶与Tris-HCL缓冲溶液混合得到,所述黄嘌呤氧化酶的浓度大于0且小于等于0.25mU/mL;
3)将步骤1)所述纳米材料水溶液与步骤2)黄嘌呤氧化酶溶液混合,孵育,测定混合液的发光强度,并且计算出发光猝灭效率,得到荧光猝灭效率最大时混合液所对应的纳米材料水溶液和黄嘌呤氧化酶溶液的浓度值;
4)绘制黄嘌呤的浓度依赖型标准曲线:以荧光猝灭效率最大时对应的纳米材料水溶液和黄嘌呤氧化酶溶液的浓度为标准浓度,将标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的黄嘌呤氧化酶溶液和不同浓度的黄嘌呤混合;孵育,测定混合液的发光强度,做出黄嘌呤的浓度依赖型标准曲线;
5)检测黄嘌呤的浓度:将标准浓度的纳米材料水溶液、标准浓度的黄嘌呤氧化酶溶液和未知浓度的黄嘌呤溶液混合;孵育,测定混合液的发光强度,代入绘制的黄嘌呤的浓度依赖型标准曲线,得出黄嘌呤的浓度。
9.权利要求1-8任一项所述的基于纳米探针的检测方法的用途,用于过氧化氢或生成过氧化氢的酶促反应中反应物的检测。
10.根据权利要求9所述的用途,其特征在于,所述检测方法用于血清或全血样品中的过氧化氢或黄嘌呤的检测。
11.稀土掺杂CaS纳米材料作为纳米探针的用途,其特征在于,所述稀土掺杂CaS纳米材料为权利要求1-8任一项所述基于纳米探针的检测方法中的稀土掺杂CaS纳米材料。
12.一种试剂盒,其包含一种纳米探针,所述纳米探针为稀土掺杂CaS纳米材料,所述稀土掺杂CaS纳米材料为权利要求1-8任一项所述基于纳米探针的检测方法中的稀土掺杂CaS纳米材料。
13.一种生物传感器,其包含一种纳米探针,所述纳米探针为稀土掺杂CaS纳米材料,所述稀土掺杂CaS纳米材料为权利要求1-8任一项所述基于纳米探针的检测方法中的稀土掺杂CaS纳米材料。
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