CN104730052A - 一种基于亲水性上转换纳米NaYF4的过氧化氢和葡萄糖传感器 - Google Patents

一种基于亲水性上转换纳米NaYF4的过氧化氢和葡萄糖传感器 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于亲水性上转换纳米颗粒的传感器的制备方法，及其在过氧化氢和葡萄糖检测中的应用。本发明采用超声微乳法，利用油胺修饰的聚琥珀酰亚胺高分子与上转换纳米颗粒表面的油酸之间的疏水-疏水作用，以及聚琥珀酰亚胺高分子在碱性条件下部分链单元水解形成亲水性基团，从而在两亲体系下制得了水溶性好且稳定的大小均一的单分散上转换纳米颗粒。将上转换纳米颗粒与四甲基联苯胺、辣根过氧化物酶混合即可得到过氧化氢和葡萄糖传感器。与传统的检测方法比较，该方法背景干扰小，信号强，成本低，且具有快速准确，高灵敏，高选择性的特点。本发明可为今后活体微环境中过氧化氢和葡萄糖的实时监测提供新的机会。

Description

一种基于亲水性上转换纳米NaYF4的过氧化氢和葡萄糖传感器
技术领域
本发明属于过氧化氢和葡萄糖传感器制备及检测技术领域，特别涉及一种基于亲水性上转换纳米NaYF4的过氧化氢和葡萄糖传感器的制备及其检测方法。
技术背景
最新研究表明，哺乳动物细胞产生的过氧化氢会参与很多的生理反应并起着重要作用，如细胞增殖、分化和迁移。因此，生物体内的过氧化氢的浓度可被当做诊断某种疾病(帕金森氏症，癌症和阿尔茨海默氏病)的不同状态的重要参数之一。
作为一个重要的生理活性物质，葡萄糖在活细胞中几乎全部过程中都起着关键作用，而适当的血糖浓度才会对这些过程起到有利作用。所以体液中的葡萄糖水平常常用于糖尿病或低血糖的诊断。而目前用于葡萄糖检测的方法通常涉及到以下两个步骤——葡萄糖氧化酶将葡萄糖转化成葡萄糖酸和过氧化氢；然后过氧化氢被还原成水。因此，更加精确灵敏快速地检测过氧化氢对血液中葡萄糖含量的检测监测也起着重要作用。
截至目前，已经有多种方法被开发用于生物样本中过氧化氢的检测，例如分光光度法、化学发光、比色法、电化学法、细胞成像和荧光法等等。这些分析方法大多数对仪器和样品的要求都很高，且耗时较长，在实际应用中会受到一定的限制。而荧光法(Wen,F.；Dong,Y.；Feng,L.；Wang,S.；Zhang,S.；Zhang,X.Anal.Chem.2011,83,1193-1196；Huang,X.；Wang,J.；Liu,H.；Lan,T.；Ren,J.Talanta 2013,106,79-84)在一定程度上可以避开这些缺点，成为用于在活细胞、血清、组织和整个动物活体中实时检测过氧化氢浓度的最优方法。但是大多数有机荧光探针分子水溶性都不好，且其荧光寿命短，稳定性差，在实际样品的检测中仍然存在一定的局限性。近些年的研究结果显示，上转换纳米颗粒具有无自发荧光、无漂白、灵敏度高、对样品损伤低等优点；加上近红外光在组织中的穿透深度更深这一优势，使上转换纳米颗粒可以更好地被应用于体内检测、生物成像、甚至体内治疗。为了进一步研究其在过氧化氢和葡萄糖传感器领域的实际应用价值，设计一种简单的基于稀土上转换发光材料过氧化氢和葡萄糖传感器，达到水溶性好、高灵敏度、高选择性、快速且低成本的检测目的，是本发明的意义和重点所在。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于亲水性上转换纳米NaYF4的过氧化氢和葡萄糖传感器的制备及其检测方法，实现高灵敏、高选择性和低成本检测过氧化氢和葡萄糖。
本发明所述的基于亲水性上转换纳米颗粒的传感器的制备方法为：
a.将2.0-16.0mg的氢氧化钠加入5-15mL去离子水中，超声促使其完全溶解；
b.在1.5mL离心管中加入浓度为0.1-1.0mg/mL的油胺修饰的聚琥珀酰亚胺高分子溶液150-400μL以及浓度为0.1-0.5mmol/mL的稀土上转换纳米颗粒分散液100-300μL，用氯仿将混合液定溶至0.5-1.5mL；所述的油胺修饰的聚琥珀酰亚胺高分子溶液和稀土上转换纳米颗粒分散液均以氯仿为溶剂；
c.将步骤b得到的混合液加入步骤a配制的溶液中，在冰水浴下用超声破碎粉碎仪超声5-10min，最终得到水包油微乳液，超声功率为200-400W；然后在200-400rpm磁力搅拌条件下，45-60℃水浴中常压挥发去除溶液中的氯仿；
d.将步骤c得到的溶液在10000-12000rpm速率下离心10-30min，得到的沉淀分散在1.0-4.0mL超纯水中，即得到亲水性上转换纳米颗粒分散液；
e.取50.0-200.0μL亲水性上转换纳米颗粒分散液、25.0-200.0μL浓度为5.0-50.0mg/mL的四甲基联苯胺溶液、25.0-100.0μL浓度为0.5-5.0mg/mL的辣根过氧化物酶溶液混合均匀，即得基于亲水性上转换纳米颗粒的传感器溶液。
步骤b所述的油胺修饰的聚琥珀酰亚胺高分子中聚琥珀酰亚胺高分子的单体与油胺的摩尔比为1-9，聚琥珀酰亚胺高分子的分子量为5000-7000。
步骤b所述的稀土上转换纳米颗粒为NaYF4:Yb3+，Er3+；其中Yb的摩尔掺杂量为10-18％，Er的摩尔掺杂量为2-10％；所述的稀土上转换纳米颗粒的表面包覆有油酸，其粒径为15-25nm。
将上述制备的基于亲水性上转换纳米颗粒的传感器应用于过氧化氢的检测。
将上述制备的基于亲水性上转换纳米颗粒的传感器应用于葡萄糖的检测。
基于亲水性上转换纳米颗粒的传感器检测过氧化氢的步骤为：
a.配制过氧化氢溶液；
b.将上述制备的基于亲水性上转换纳米颗粒的传感器溶液加入过氧化氢溶液中，再加入缓冲溶液，常温下混合均匀后进行光谱测试；
c.固定激发光波长为980nm，收集400-700nm波长范围内的光谱图。
基于亲水性上转换纳米颗粒的传感器检测葡萄糖的步骤为：
a.分别配制葡萄糖氧化酶及葡萄糖溶液；
b.将葡萄糖与葡萄糖氧化酶溶液混合，在37℃培养箱中培养10-30min，最终形成葡萄糖氧化酶-葡萄糖溶液；
c.将上述制备的基于亲水性上转换纳米颗粒的传感器溶液加入葡萄糖氧化酶-葡萄糖溶液中，再加入缓冲溶液，常温下混合均匀后进行光谱测试；
d.固定激发光波长为980nm，收集400-700nm波长范围内的光谱图。
本发明采用超声微乳法，利用油胺修饰的聚琥珀酰亚胺高分子与上转换纳米颗粒表面的油酸之间的疏水-疏水作用，以及聚琥珀酰亚胺高分子在碱性条件下部分链单元水解形成亲水性基团，从而在两亲体系下制得了水溶性好且稳定的大小均一的单分散上转换纳米颗粒。将上转换纳米颗粒与四甲基联苯胺、辣根过氧化物酶混合即可得到过氧化氢和葡萄糖传感器，传感器溶液需现用现制。在过氧化氢存在的条件下，辣根过氧化物酶催化过氧化氢将四甲基联苯胺氧化，所得的氧化产物能够吸收上转换纳米颗粒发出的荧光，即在荧光光谱上表现为上转换纳米颗粒荧光淬灭，可以通过检测荧光强度，达到定性定量检测过氧化氢的目的。葡萄糖在葡萄糖氧化酶作用下能生成过氧化氢，因此借助葡萄糖氧化酶的作用，本发明的传感器通过间接检测生成的过氧化氢也可实现对葡萄糖的定性定量检测。与传统的检测方法比较，该方法背景干扰小，信号强，成本低，且具有快速准确，高灵敏，高选择性的特点。本发明可为今后活体微环境中过氧化氢和葡萄糖的实时监测提供新的机会。
附图说明
图1为实施例1及实施例2中的稀土上转换纳米颗粒的TEM图；
图2为实施例1及实施例2中制备的基于亲水性上转换纳米颗粒的传感器的TEM照片；
图3为实施例1过氧化氢、四甲基联苯胺、辣根过氧化物酶混合溶液与稀土上转换纳米颗粒光谱重叠图：过氧化氢、四甲基联苯胺、辣根过氧化物酶混合溶液的吸收光谱(a1)，加入过氧化氢(20μM)之前(a2)和之后(a3)亲水性上转换纳米NaYF4、过氧化氢、四甲基联苯胺、辣根过氧化物酶混合溶液的荧光光谱；
图4为实施例1中pH值对基于亲水性上转换纳米颗粒的传感器的影响关系图；
图5为实施例1中不同浓度过氧化氢对基于亲水性上转换纳米颗粒的传感器的荧光强度的标准曲线图；
图6为实施例1干扰离子对过氧化氢检测(传感器的荧光强度变化)的影响；
图7为实施例2中不同浓度葡萄糖对基于亲水性上转换纳米颗粒的传感器的荧光强度的标准曲线图；
图8为基于亲水性上转换纳米颗粒的传感器检测过氧化氢和葡萄糖的原理图。
具体实施方式
实施例1：
a.将4.0mg的氢氧化钠加入10mL去离子水中，超声促使其完全溶解；
b.在1.5mL离心管中加入浓度为0.365mg/mL的油胺修饰的聚琥珀酰亚胺高分子溶液200μL以及浓度为0.25mmol/mL的稀土上转换纳米颗粒分散液200μL，用氯仿将混合液定溶至1mL；所述的油胺修饰的聚琥珀酰亚胺高分子溶液和稀土上转换纳米颗粒分散液均以氯仿为溶剂；
c.将步骤b中所得的混合液加入步骤a配制的溶液中，在冰水浴下用超声破碎粉碎仪超声6min，最终得到水包油微乳液，超声功率为200W；然后在300rpm磁力搅拌条件下，52℃水浴中常压挥发去除溶液中的氯仿；
d.将步骤c得到的溶液在12000rpm速率下离心15min，得到的沉淀分散在1.0mL超纯水中，即得到亲水性上转换纳米颗粒分散液；
e.取50.0μL亲水性上转换纳米颗粒分散液、50.0μL浓度为10.0mg/mL的四甲基联苯胺溶液、50.0μL浓度为1mg/mL的辣根过氧化物酶溶液混合均匀，即得基于亲水性上转换纳米颗粒的传感器溶液。
步骤b所述的油胺修饰的聚琥珀酰亚胺高分子中单体与油胺的摩尔比为7:3，聚琥珀酰亚胺高分子的分子量为6000。
步骤b所述的稀土上转换纳米颗粒为NaYF4:Yb3+，Er3+；其中Yb的摩尔掺杂量为15％，Er的摩尔掺杂量为5％；所述的稀土上转换纳米颗粒的表面包覆有油酸，采用油相的溶剂热法合成，粒径为15-25nm，其TEM照片如图1所示。
油胺中文别名9-十八烯胺，CAS号为112-90-3，分子量267.5。
四甲基联苯胺英文名称3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，CAS号为64285-73-0，分子式:C16H22Cl2N2，分子量313.2653。
辣根过氧化物酶酶学分类号为EC 1.11.1.7。
上述制得的基于亲水性上转换纳米颗粒的传感器的TEM照片如图2所示。
采用上述制得的基于亲水性上转换纳米颗粒的传感器进行过氧化氢检测：
a.分别配制浓度浓度为100μM的葡萄糖、维生素C、Na+、K+、Ca2+、Cu2+、Fe3+、ClO―、NO2 ―、NO3 ―的溶液和浓度为0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.8，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0(μM)的过氧化氢溶液；
b.将上述制备的基于亲水性上转换纳米颗粒的传感器溶液分别加入步骤a配置的溶液中，再加入20mM的CH3COOH-CH3COONa缓冲溶液调节pH值为5.0，常温下混合均匀后进行光谱测试；
c.固定激发光波长为980nm，收集400-700nm波长范围内的光谱图。
四甲基联苯胺与过氧化氢、辣根过氧化物酶的反应产物的吸收光谱和稀土上转换纳米颗粒的发射光谱(加入与未加入过氧化氢)的重叠图如图3所示，溶液的pH值对过氧化氢检测的影响如图4所示，过氧化氢检测的溶液标准曲线如图5所示，不同干扰离子存在下传感器的溶液在543nm处的荧光强度的变化如图6所示。
实施例2：
a.将5.0mg的氢氧化钠加入12mL去离子水中，超声促使其完全溶解；
b.在1.5mL离心管中加入浓度为0.40mg/mL的油胺修饰的聚琥珀酰亚胺高分子溶液240μL以及浓度为0.25mmol/mL的稀土上转换纳米颗粒分散液240μL，用氯仿将混合溶液定溶至1.2mL；所述的油胺修饰的聚琥珀酰亚胺高分子溶液和稀土上转换纳米颗粒分散液均以氯仿为溶剂；
c.将步骤b中所得的混合液加入步骤a配制的溶液中，在冰水浴下用超声破碎粉碎仪超声6min，最终得到水包油微乳液，超声功率为260W；然后在300rpm磁力搅拌条件下，52℃水浴中常压挥发去除溶液中的氯仿；
d.将步骤c得到的溶液在12000rpm速率下离心15min，得到的沉淀分散在2.0mL超纯水中，即得到亲水性上转换纳米颗粒分散液；
e.取50.0μL亲水性上转换纳米颗粒分散液、50.0μL浓度为20.0mg/mL的四甲基联苯胺溶液、50.0μL浓度为2mg/mL的辣根过氧化物酶溶液混合均匀，即得基于亲水性上转换纳米颗粒的传感器溶液。
步骤b所述的油胺修饰的聚琥珀酰亚胺高分子中单体与油胺的摩尔比为7:3，聚琥珀酰亚胺高分子的分子量为6000。
步骤b所述的稀土上转换纳米颗粒为NaYF4:Yb3+，Er3+；其中Yb的摩尔掺杂量为15％，Er的摩尔掺杂量为5％；所述的稀土上转换纳米颗粒的表面包覆有油酸，采用油相的溶剂热法合成，粒径为15-25nm，其TEM照片如图1所示。
油胺中文别名9-十八烯胺，CAS号为112-90-3，分子量267.5。
四甲基联苯胺英文名称3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，CAS号为64285-73-0，分子式:C16H22Cl2N2，分子量313.2653。
辣根过氧化物酶酶学分类号为EC 1.11.1.7。
上述制得的基于亲水性上转换纳米颗粒的传感器的TEM照片如图2所示。
采用上述制得的基于亲水性上转换纳米颗粒的传感器进行葡萄糖检测：
a.分别配制葡萄糖氧化酶溶液和浓度为0，0.3，0.8，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0(μM)的葡萄糖溶液；
b.将葡萄糖与葡萄糖氧化酶溶液混合，在37℃培养箱中培养20min，最终形成葡萄糖氧化酶-葡萄糖溶液；
c.将上述制备的基于亲水性上转换纳米颗粒的传感器溶液分别加入步骤b配置的溶液中，再加入20mM的CH3COOH-CH3COONa缓冲溶液调节pH值为5.0，常温下混合均匀后进行光谱测试；
d.固定激发光波长为980nm，收集400-700nm波长范围内的光谱图。
不同浓度的葡萄糖存在下上述传感器的溶液标准曲线如图7所示。

Claims (5)

1.一种基于亲水性上转换纳米颗粒的传感器的制备方法，其特征在于，其具体步骤为：
a.将2.0-16.0mg的氢氧化钠加入5-15mL去离子水中，超声促使其完全溶解；
b.在1.5mL离心管中加入浓度为0.1-1.0mg/mL的油胺修饰的聚琥珀酰亚胺高分子溶液150-400μL以及浓度为0.1-0.5mmol/mL的稀土上转换纳米颗粒分散液100-300μL，用氯仿将混合液定溶至0.5-1.5mL；所述的油胺修饰的聚琥珀酰亚胺高分子溶液和稀土上转换纳米颗粒分散液均以氯仿为溶剂；
c.将步骤b得到的混合液加入步骤a配制的溶液中，在冰水浴下用超声破碎粉碎仪超声5-10min，最终得到水包油微乳液，超声功率为200-400W；然后在200-400rpm磁力搅拌条件下，45-60℃水浴中常压挥发去除溶液中的氯仿；
d.将步骤c得到的溶液在10000-12000rpm速率下离心10-30min，得到的沉淀分散在1.0-4.0mL超纯水中，即得到亲水性上转换纳米颗粒分散液；
e.取50.0-200.0μL亲水性上转换纳米颗粒分散液、25.0-200.0μL浓度为5.0-50.0mg/mL的四甲基联苯胺溶液、25.0-100.0μL浓度为0.5-5.0mg/mL的辣根过氧化物酶溶液混合均匀，即得基于亲水性上转换纳米颗粒的传感器溶液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤b所述的稀土上转换纳米颗粒为NaYF4:Yb3+，Er3+；其中Yb的摩尔掺杂量为10-18％，Er的摩尔掺杂量为2-10％；所述的稀土上转换纳米颗粒的表面包覆有油酸，其粒径为15-25nm。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤b所述的油胺修饰的聚琥珀酰亚胺高分子中聚琥珀酰亚胺高分子的单体与油胺的摩尔比为1-9，聚琥珀酰亚胺高分子的分子量为5000-7000。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法制备得到的基于亲水性上转换纳米颗粒的传感器在检测过氧化氢中的应用。
5.根据权利要求1-3任一所述的方法制备得到的基于亲水性上转换纳米颗粒的传感器在检测葡萄糖中的应用。
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