CN113999679A - 一种基于上转换纳米材料“关-开”型荧光传感器高灵敏检测甲砜霉素的方法 - Google Patents

一种基于上转换纳米材料“关-开”型荧光传感器高灵敏检测甲砜霉素的方法 Download PDF

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Abstract

一种基于上转换纳米材料NaYF4:Yb,Er‑金纳米粒子荧光探针开关系统的甲砜霉素高灵敏度检测方法，它涉及一种甲砜霉素检测方法。本发明的目的是要解决现有的甲砜霉素检测方法灵敏度低、选择性低的问题，一些紫外可见波长激发的荧光材料在生物分析中背景荧光较强，不利于生物样品的分析检测等问题。制备方法：一、制备油酸盐前驱体；二、制备NaYF4:Yb,Er；三、NaYF4:Yb,Er的表面修饰；四、制备金纳米粒子；五、制备NaYF4:Yb,Er‑金纳米粒子荧光探针。应用方法：将甲砜霉素标准溶液加入到经孵育的NaYF4:Yb,Er‑金纳米粒子荧光探针溶液中，进行荧光检测；将加标后处理好的鸡蛋样品加入到经孵育的NaYF4:Yb,Er‑金纳米粒子荧光探针溶液中，进行荧光检测；本发明制备的NaYF4:Yb,Er‑金纳米粒子荧光探针荧光性能好，建立的方法选择性好，检测限低，准确度高。

Description

一种基于上转换纳米材料“关-开”型荧光传感器高灵敏检测 甲砜霉素的方法
技术领域
本发明属于荧光纳米材料、荧光传感技术领域，涉及一种基于上转换纳米材料NaYF4:Yb,Er-金纳米粒子荧光探针开关系统的甲砜霉素高灵敏检测方法。
背景技术
甲砜霉素是一种类似氯霉素的广泛性抗菌剂，近年来在人类疾病和动物疾病的治疗中发挥了重要作用。甲砜霉素可以通过与生物体内的核糖体亚基结合，抑制易感细菌的蛋白质合成，从而阻止氨基酸转移和蛋白质进一步形成，进而达到抗菌效果。然而与蛋白质结合的甲砜霉素在体内停留较长时间会产生一定量的游离甲砜霉素，游离的甲砜霉素会在一定时间内随粪便、尿液及产生的物质(牛乳、鸡蛋等)排出体外。人体排出的抗生素加上兽药残留的排出作为有机肥进入土壤，然后在植物源食物中积累，长期循环会对人体健康造成严重危害。
现有的检测甲砜霉素的方法如高效液相色谱、高效液相色谱-质谱、免疫法以及电化学等。在这些方法中电化学选择性差，高效液相色谱法分离时间长，且对氯霉素、甲砜霉素与氟苯尼考的区分不明显，免疫法会出现假阳性或假阴性现象。荧光法具有灵敏度高、操作简单等优点，但是直接荧光猝灭法抗干扰能力弱。发明专利CN202110156639.9虽然公开了一种检测甲砜霉素的荧光方法，检出限为27.5μg/L，灵敏度较低不利于痕量甲砜霉素的分析。因此，建立一种灵敏度高、选择性高、检测限低的甲砜霉素定量分析方法是非常必要的。
上转换纳米粒子(UCNPs)具有可调发射，高荧光稳定性，高荧光寿命，良好的生物相容性，低背景荧光和易于修饰等优点，在金属离子、药物和生物大分子等分析检测方面都有广泛的应用前景。制备上转换纳米粒子的方法包括水热法、高温热解法、热溶剂法、微波辅助合成法等。其中以NaF为基质，Yb3+为激活剂，Er3+为敏化剂的上转换纳米粒子是小分子药物分析中最常用的上转换颗粒。此外，将上转换与其他材料的协同作用可以进一步提高其灵敏度与选择性，其中以上转换纳米粒子做能量供体，金纳米粒子做能量受体时，金纳米粒子的紫外吸收与上转换纳米粒子的荧光发射峰重叠，在加上粒子尺寸的原因，二者之间的荧光共振能量转移可以有效的进行。因此可以将上转换纳米粒子与金纳米粒子结合建立“关-开”型荧光传感器，并能够消除外界干扰引起的假阳性结果，提高灵敏度。
发明内容
本发明的目的是要解决现有的甲砜霉素检测方法灵敏度低、选择性差的问题，以及一些紫外可见波长激发的荧光材料在生物分析中背景荧光较强，不利于生物样品的分析检测等问题。本专利采用高温热解法制备NaYF4:Yb,Er，并将其与金纳米粒子结合构建“关-开”型荧光传感器应用于检测鸡蛋中的甲砜霉素。
一种NaYF4:Yb,Er-金纳米粒子荧光探针的制备方法，具体是按照以下步骤完成：
一、制备油酸盐前驱体：将10mmol～30mmol稀土金属氯化物、30mmol～90mmol油酸钠、15mL～45mL蒸馏水、20mL～60mL乙醇和35mL～105mL正己烷的混合溶液加入烧瓶中，磁力搅拌下加热到70℃保持4h～5h，然后冷却至室温，将混合溶液倒入分液漏斗静置5min～7min，将上层液体用蒸馏水洗涤三次，在80℃～85℃下水浴烘干，得到的固体蜡状物质为含有Y、Er和Yb元素的油酸盐前驱体；步骤一中所述的稀土金属氯化物为YCl3、ErCl3和YbCl3；
二、制备NaYF4:Yb,Er：将NaF、Y(OA)3、Yb(OA)3、Er(OA)3按照物质量比为1：0.785：0.20：0.15或1：0.795：0.20：0.005与15mL～20mL油酸、15mL～20mL十八烯混合后加入到三口烧瓶中，真空条件下反应40min～60min，温度为280℃～310℃；反应结束后冷却至室温，用乙醇与环己烷交替洗涤后，分散于10mL环己烷中；
三、NaYF4:Yb,Er的表面修饰：将步骤二所得油溶性NaYF4:Yb,Er通过表面修饰转化为水溶性材料，取2mL步骤二中合成的NaYF4:Yb,Er分散在20mL蒸馏水中，加入0.1g～0.15g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，剧烈搅拌10h～24h，即获得CTAB修饰的NaYF4:Yb,Er；
四、制备金纳米粒子：在250mL圆底烧瓶中加入500μL～1000μL，50mmol/L的HAuCl4和100mL的超纯水，在油浴中加热至沸腾，保持7min～10min，将1mL～2mL新配制的柠檬酸钠水溶液滴加到上述煮沸溶液中，保持10min～15min，溶液由淡黄色变为酒红色，将该酒红色溶液在无加热条件下搅拌10min～15min，冷却至室温，得到的金纳米粒子，置于冰箱保存；
五、制备NaYF4:Yb,Er-金纳米粒子荧光探针：分别量取步骤三中制备的CTAB修饰的NaYF4:Yb,Er溶液50μL～70μL与步骤四中制备的金纳米粒子180μL～200μL溶液，在2.23mL～2.47mL的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液(pH＝6)孵育10min～15min后，得到NaYF4:Yb,Er-金纳米粒子荧光探针。
一种基于NaYF4:Yb,Er-金纳米粒子荧光探针开关系统检测甲砜霉素的方法，具体按照以下步骤完成的：
一、甲砜霉素标准溶液的检测：取不同浓度(0.01μmol/L～1μmol/L)的甲砜霉素标准溶液500μL与2.5mL加入NaYF4:Yb,Er-金纳米粒子荧光探针在室温下孵育10min～15min，使用稳态瞬态荧光光谱仪在980nm的激发波长下，检测上述不同浓度甲砜霉素加入后溶液的荧光光谱，并记录在650nm处的荧光强度；
二、鸡蛋样品中甲砜霉素的检测：将一定量的甲砜霉素添加到10mL～15mL混合均匀的鸡蛋液中，超声溶解，加入10mL～15mL质量分数10％的三氯乙酸处理鸡蛋中的蛋白质，超声15min～30min离心后取澄清液，用1mol/L～2mol/L NaOH溶液500～1000μL调节混合液的pH至5～7，此时甲砜霉素的加标浓度为(0.01μmol/L～1μmol/L)按照上述步骤一甲砜霉素标准溶液的检测方法对加标样品进行测试。
本发明优点：1、本发明以上转换纳米粒子为荧光探针的发光主体，相较于其他荧光材料如碳点这种具有自身荧光的纳米材料对甲砜霉素的检测，上转换纳米粒子无背景荧光，对生物样品的检测更加友好，灵敏度更高；2、本发明以上转换纳米粒子与金纳米粒子协同作用，通过金纳米粒子对上转换纳米粒子的荧光猝灭并且甲砜霉素的加入使得金纳米粒子团聚，导致上转换纳米粒子荧光恢复从而形成荧光开关的过程，避免了直接荧光猝灭导致的选择性差，灵敏度低，检测效果差的现象；3、本发明对甲砜霉素的检出限达到3nmol/L,与现有技术相比，本发明灵敏度相对较高；4、建立的方法准确度高，回收率为98.2％-105.0％。
附图说明
图1(a)是实施例1中CTAB修饰的NaYF4:Yb,Er透射电镜图，由图1(a)可以看出，CTAB修饰的NaYF4:Yb,Er为球状或六边形结构且分散性好；图1(b)是实施例1中金纳米粒子透射电镜图；由图1(b)可以看出，金纳米粒子为球状结构且分散十分均匀；
图2(a)是实施例1NaYF4:Yb,Er-金纳米粒子荧光探针透射电镜图，由图2(a)可以看出金纳米粒子被吸附在NaYF4:Yb,Er表面；图2(b)是实施例1甲砜霉素溶液加入NaYF4:Yb,Er-金纳米粒子溶液后的透射电镜图，由图2(b)可以看出甲砜霉素的加入引起了金纳米粒子在NaYF4:Yb,Er表面的聚集；
图3是实施例1中甲砜霉素溶液对金纳米粒子与上转换纳米粒子荧光探针溶液的荧光响应图；本实施例2步骤一混合溶液中甲砜霉素浓度为0.01μmol/L～1μmol/L，上转换纳米粒子的荧光强度随甲砜霉素浓度增加而增强；
图4是实施例1中甲砜霉素浓度与上转换纳米粒子荧光强度变化率(F-F0)/F0的线性关系图；F为添加甲砜霉素后上转换纳米粒子荧光强度，F0为未添加甲砜霉素时上转换纳米粒子荧光强度，C为甲砜霉素浓度；以上转换荧光强度变化率(F-F0)/F0为纵坐标，甲砜霉素浓度C为横坐标，通过Origin8.0软件作图，结果如图4所示；甲砜霉素与上转换纳米粒子荧光强度变化率(F-F0)/F0展现两阶段线性关系；甲砜霉素浓度在0.01μmol/L～0.1μmol/L范围内线性回归方程为(F-F0)/F0＝13.06C+1.09(R2＝0.980)，在0.1μmol/L～1μmol/L范围内线性回归方程为(F-F0)/F0＝3.17C+0.04(R2＝0.998)，该方法对甲砜霉素的检出限为3nmol/L；
图5是对甲砜霉素检测的选择性实验图；甲砜霉素(TAP)，红霉素(Ery)，氯霉素(CHL)，氟苯尼考(Flo)，以及鸡蛋中可能对甲砜霉素的检测有影响的氨基酸类物质如赖氨酸(Lys)，酪氨酸(Tyr)，色氨酸(Trp)，组氨酸(His)，和几种离子分别是Ca2+，Fe2+，K+，Mg2+，PO4 3-，上述用于考察NaYF4:Yb,Er-金纳米粒子荧光探针对甲砜霉素检测的灵敏度的物质浓度均为1μmol/L；如图5所示，除甲砜霉素外，其他测试物对NaYF4:Yb,Er-金纳米粒子荧光探针强度变化影响可以忽略不计，这表明建立的方法选择性高；
图6是本发明定量检测甲砜霉素的原理图；首先利用上转换纳米粒子与金纳米粒子设计一种“关-开”型纳米荧光探针。金纳米粒子在520nm处与上转换纳米粒子荧光光谱重叠，两者可发生荧光共振能量转移，上转换纳米粒子荧光猝灭。加入了甲砜霉素的金纳米粒子在680nm处产生新的紫外光谱吸收峰，与上转换纳米粒子在652nm处的荧光光谱发生重叠，影响上转换纳米粒子的发光，上转换纳米粒子荧光恢复。上转换纳米粒子的荧光恢复程度与甲砜霉素浓度呈线性关系，据此建立了对甲砜霉素的高灵敏度、高选择性且方便快捷的检测方法。
具体实施方式
实施例1：
本实施方式是NaYF4:Yb,Er-金纳米粒子荧光探针的制备方法，具体是按以下步骤完成的：
一、制备油酸盐前驱体：将20mmol稀土金属氯化物、60mmol油酸钠、30mL蒸馏水、40mL乙醇和70mL正己烷的混合溶液加入烧瓶中，磁力搅拌下加热到70℃保持4h，然后冷却至室温，将混合溶液倒入分液漏斗静置5min，将上层液体用蒸馏水洗涤三次，在80℃下水浴烘干，得到的固体蜡状物质为含有Y、Er和Yb元素的油酸盐前驱体；步骤一中所述的稀土金属氯化物为YCl3、ErCl3和YbCl3；
二、制备NaYF4:Yb,Er：将NaF、Y(OA)3、Yb(OA)3、Er(OA)3按照物质量比为1：0.785：0.20：0.015与15mL油酸、15mL十八烯混合后加入到三口烧瓶中，真空条件下反应60min，温度为310℃；反应结束后冷却至室温，用乙醇与环己烷交替离心后，分散于10mL环己烷中；
三、NaYF4:Yb,Er的表面修饰：将步骤二所得油溶性NaYF4:Yb,Er通过表面修饰转化为水溶性材料，取2mL步骤二中合成的NaYF4:Yb,Er分散在20mL蒸馏水中，加入0.1g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，剧烈搅拌12h，即获得CTAB修饰的NaYF4:Yb,Er；
四、制备金纳米粒子：在250mL圆底烧瓶中加入500μL，50mmol/L的HAuCl4和99.5mL的超纯水，在油浴中加热至沸腾，将2mL新配制的柠檬酸钠水溶液滴加到上述煮沸溶液中，保持10min，溶液由淡黄色变为酒红色，将该酒红色溶液在无加热条件下搅拌15min，冷却至室温，得到的金纳米粒子，置于冰箱保存；
五、制备NaYF4:Yb,Er-金纳米粒子荧光探针：分别量取步骤三中制备的CTAB修饰的NaYF4:Yb,Er溶液60μL与步骤四中制备的金纳米粒子200μL溶液，并混合，在2.24mL的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液(pH＝6)孵育10min后，得到NaYF4:Yb,Er-金纳米粒子荧光探针；
实施例2：
本实施方式是一种基于NaYF4:Yb,Er-金纳米粒子荧光探针开关系统检测甲砜霉素的方法，具体按照以下步骤完成的：
一、甲砜霉素标准溶液的检测：取不同浓度(0.01μmol/L～1μmol/L)的甲砜霉素标准溶液500μL与2.5mL加入NaYF4:Yb,Er-金纳米粒子荧光探针在室温下孵育15min，使用稳态瞬态荧光光谱仪检测980nm的激发波长下，上述不同浓度甲砜霉素加入后溶液的荧光光谱，并记录在650nm处的荧光强度；
二、鸡蛋样品中甲砜霉素的检测：将一定量的甲砜霉素添加到10mL混合均匀的鸡蛋液中，超声溶解，加入10mL质量分数10％的三氯乙酸处理鸡蛋中的蛋白质，超声30min离心后取澄清液，用2mol/L NaOH溶液500μL调节混合液的pH至7，此时甲砜霉素的加标浓度为(0.01μmol/L～1μmol/L)按照上述步骤一甲砜霉素标准溶液的检测方法对加标样品进行测试。

Claims (6)

1.一种NaYF4:Yb,Er-金纳米粒子荧光探针的制备方法，其特征在于它按以下步骤制备的：
一、制备油酸盐前驱体：将10mmol～30mmol稀土金属氯化物、30mmol～90mmol油酸钠、15mL～45mL蒸馏水、20mL～60mL乙醇和35mL～105mL正己烷的混合溶液加入烧瓶中，磁力搅拌下加热到70℃保持4h～5h，然后冷却至室温，将混合溶液倒入分液漏斗静置5min～7min，将上层液体用蒸馏水洗涤三次，在80℃～85℃下水浴烘干，得到的固体蜡状物质为含有Y、Er和Yb元素的油酸盐前驱体；步骤一中所述的稀土金属氯化物为YCl3、ErCl3和YbCl3；
二、制备NaYF4:Yb,Er：将NaF、Y(OA)3、Yb(OA)3、Er(OA)3按照物质量比为1：0.785：0.20：0.15或1：0.795：0.20：0.005与15mL～20mL油酸、15mL～20mL十八烯混合后加入到三口烧瓶中，真空条件下反应40min～60min，温度为280℃～310℃；反应结束后冷却至室温，用乙醇与环己烷交替离心后，分散于10mL环己烷中；
三、NaYF4:Yb,Er的表面修饰：将步骤二所得油溶性NaYF4:Yb,Er通过表面修饰转化为水溶性材料，取2mL步骤二中合成的NaYF4:Yb,Er分散在20mL蒸馏水中，加入0.1g～0.15g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，剧烈搅拌10h～24h，即获得CTAB修饰的NaYF4:Yb,Er；
四、制备金纳米粒子：在250mL圆底烧瓶中加入500μL～1000μL，40mmol/L～50mmol/L的HAuCl4和99mL～99.5mL的超纯水，在油浴中加热至沸腾，保持7min～10min，将1.8mL～2mL新配制的柠檬酸钠水溶液滴加到上述煮沸溶液中，保持10min～15min，溶液由淡黄色变为酒红色，将该酒红色溶液在无加热条件下搅拌10min～15min，冷却至室温，得到的金纳米粒子，置于冰箱保存；
五、制NaYF4:Yb,Er-金纳米粒子荧光探针：分别量取步骤三中制备的CTAB修饰的NaYF4:Yb,Er溶液50μL～70μL与步骤四中制备的金纳米粒子180μL～200μL溶液，在2.23mL～2.47mL的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液(pH＝6)孵育10min～15min后，得到NaYF4:Yb,Er-金纳米粒子荧光探针。
2.根据权利要求1所述的一种NaYF4:Yb,Er-金纳米粒子荧光探针的制备方法，其特征在于步骤一中所述在80℃～85℃下水浴烘干至蜡状后留用。
3.根据权利要求1所述的一种NaYF4:Yb,Er-金纳米粒子荧光探针的制备方法，其特征在于步骤二中所述反应结束后冷却至室温，用乙醇与环己烷交替洗涤。
4.根据权利要求1所述的一种NaYF4:Yb,Er-金纳米粒子荧光探针的制备方法，其特征在于步骤三中所述加入0.1g～0.15g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，剧烈搅拌10h～24h。
5.根据权利要求1所述的一种NaYF4:Yb,Er-金纳米粒子荧光探针的制备方法，其特征在于步骤四中所述将1.8mL～2mL新配制的柠檬酸钠水溶液滴加到上述煮沸溶液中，保持10min～15min，溶液由淡黄色变为酒红色。
6.利用权利要求1所述的一种NaYF4:Yb,Er-金纳米粒子荧光探针检测甲砜霉素的方法，其特征在于它按以下步骤完成的：
一、甲砜霉素标准溶液的检测：取不同浓度(0.01μmol/L～1μmol/L)的甲砜霉素标准溶液500μL与2.5mL加入NaYF4:Yb,Er-金纳米粒子荧光探针在室温下孵育10min～15min，使用稳态瞬态荧光光谱仪在980nm的激发波长下，检测上述不同浓度甲砜霉素加入后溶液的荧光光谱，并记录在650nm处的荧光强度；
二、鸡蛋样品中甲砜霉素的检测：将一定量的甲砜霉素添加到10mL～15mL混合均匀的鸡蛋液中，超声溶解，加入10mL～15mL质量分数10％的三氯乙酸处理鸡蛋中的蛋白质，超声15min～30min离心后取澄清液，用1mol/L～2mol/L NaOH溶液500～1000μL调节混合液的pH至5～7，此时甲砜霉素的加标浓度为(0.01μmol/L～1μmol/L)按照上述步骤一甲砜霉素标准溶液的检测方法对加标样品进行测试。
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