CN111778013B - 一种用于检测四环素残留的荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于检测四环素残留的荧光探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测四环素残留的壳层隔绝纳米粒子及适配体修饰的荧光探针的制备方法及其制备的荧光探针和应用，该制备方法包括：银纳米粒子制备，硅包覆银纳米制备，氨基官能化银纳米制备，碲化镉量子点制备，适配体修饰的荧光探针的合成。本发明制备工艺简单、原料易得、成本低，易于规模化生产。本发明制备的用于检测四环素残留的荧光探针灵敏度高，同时具有高选择性和特异性，仅对四环素有荧光响应，对其他抗生素均无反应。采用本发明制备的用于检测四环素残留的荧光探针可有效定量检测四环素残留，并且更加高效、节约成本、更加精确，对控制食品安全、保护人体健康具有重要的意义。

Description

一种用于检测四环素残留的荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于药物分析，具体涉及一种用于检测四环素残留的壳层隔绝纳米粒子及适配体修饰的荧光探针的制备方法及其制备的荧光探针和应用。
背景技术
四环素是第一代四环素类天然抗生素，因其广谱、使用方便、经济等特点被长期广泛用于治疗人及动物的细菌感染及立克次氏体、衣原体、支原体等引起的感染。随着四环素在我国畜牧业中的不断使用，动物源性食品中会不可避免的产生抗生素残留，而这些残留存在潜在的致癌特性，并会导致机体免疫力下降以及过敏反应，从而引起了人们的高度重视。近年来，食品安全检测技术迅速发展，如高效液相色谱法、液质联用法以及酶联免疫法等，这些方法往往存在操作复杂，或仪器昂贵或检测受环境干扰较大的缺点。随着时代的发展，寻求一种更加便捷高效、灵敏度高、成本低的检测方法来满足更加严格的检测要求，对控制食品安全、保护人体健康具有重要的意义。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明一种用于检测四环素残留的壳层隔绝纳米粒子及适配体修饰的荧光探针的制备方法，本发明制备的探针可以有效解决现有四环素检测操作复杂，或仪器昂贵或检测受环境干扰较大的缺点。
本发明还提供一种用于检测四环素残留的壳层隔绝纳米粒子及适配体修饰的荧光探针和应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种用于检测四环素残留的壳层隔绝纳米粒子及适配体修饰的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)银纳米粒子制备：将硝酸银溶解在水中加热至沸腾，加入柠檬酸钠，继续加热沸腾得到银纳米粒子溶液；
(2)硅包覆银纳米制备：将步骤(1)制得银纳米粒子、氢氧化铵、正硅酸四乙酯反应生成硅包覆银纳米粒子溶液；
(3)氨基官能化的硅包覆银纳米制备：将步骤(2)制得的硅包覆银纳米粒子和3-氨基丙基三甲氧基硅烷反应生成表面氨基官能化的硅包覆银纳米溶液；
(4)碲化镉量子点制备：将碲粉、硼氢化钠、水通气反应得到碲氢化钠前驱体；将氯化镉、巯基丙酸、水混合再加入碲氢化钠前驱体继续反应，得到碲化镉量子点；
(5)适配体修饰的荧光探针的合成：将碲化镉量子点、氨基官能化的硅包覆银纳米粒子、四环素适配体、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐胺混合反应制成荧光探针。
其中，步骤(1)所述加热沸腾得到银纳米粒子为在沸腾条件下保持1-2h。
优选地，所述柠檬酸钠为质量分数1％的柠檬酸钠溶液。
其中，步骤(2)所述银纳米粒子、氨水、正硅酸四乙酯(TEOS)在乙醇溶液中室温反应10-12h，静置老化20-24h，其中银纳米粒子溶液与氨水体积比为100:7-100:8，银纳米粒子溶液与正硅酸四乙酯的体积比为100:10-13。
作为优选，银纳米粒子、氨水、与三种体积的正硅酸四乙酯分别在乙醇溶液中反应生成三种壳层厚度的硅包覆银纳米粒子；银纳米粒子溶液与三种正硅酸四乙酯TEOS的体积比为100:10:11:13。
其中，步骤(3)所述硅包覆银纳米粒子和3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)在乙醇溶液中室温反应3-5h，在50℃加热1-2h，其中硅包覆银纳米粒子与APTMS体积比为10:1-11:1。
作为优选，步骤(3)所述硅包覆银纳米粒子和3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)室温反应5h，在50℃加热1h，其中硅包覆银纳米粒子与APTMS体积比为10:1。
其中，步骤(4)所述碲粉、硼氢化钠的摩尔比例为1:15-1:20；所述通气反应得到碲氢化钠前驱体为室温通氩气磁力搅拌反应20-30min，当溶液由黑色变为白色时，得到碲氢化钠前驱体溶液。本发明中的磁力搅拌一般为120转/min。
作为优选，步骤(4)所述将氯化镉、巯基丙酸、水混合再加入碲氢化钠前驱体为将碲氢化钠前驱体溶液加入到氩气饱和的氯化镉和巯基丙酸混合水溶液中，室温搅拌反应，之后再回流反应。
作为优选，步骤(4)所述将氯化镉、巯基丙酸、水混合再加入碲氢化钠前驱体为将碲氢化钠前驱体溶液加入到氩气饱和的氯化镉和巯基丙酸混合水溶液中，pH为10，室温搅拌反应，之后在100℃条件下回流反应2h。
进一步地，步骤(4)所述氯化镉、碲粉和巯基丙酸的摩尔比1：0.5：2.4。
其中，步骤(5)所述将碲化镉量子点、氨基官能化的硅包覆银纳米粒子、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐混合冰浴反应1-2h，室温反应3-4h，再将所得溶液与四环素适配体，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液室温200r/min振荡1-2h，其中碲化镉量子点溶液，氨基官能化的硅包覆银纳米粒子溶液与第一次加入的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液的体积比为20:10:1-25:10:1；所得溶液、四环素适配体与第二次加入的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液的体积比为10:1:15-30。
作为优选，所述步骤(5)所述将碲化镉量子点、氨基官能化的硅包覆银纳米粒子、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐胺混合冰浴反应2h，室温反应4h，再将所得溶液与四环素适配体，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液室温振荡2h，其中碲化镉量子点溶液，硅包覆银纳米粒子溶液与1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液的体积比为20:10:1；所得溶液、四环素适配体与第二次加入的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液的体积比为10:1:15。
进一步地，步骤(5)制得的荧光探针离心后用乙醇和超纯水洗涤，并在真空干燥后保存。
本发明所述的用于检测四环素残留的壳层隔绝纳米粒子及适配体修饰的荧光探针的制备方法所制备的壳层隔绝纳米粒子及适配体修饰的荧光探针。
其中，所述的壳层隔绝纳米粒子及适配体修饰的荧光探针在四环素浓度的定量检测中的应用。
本发明制备的一种壳层隔绝纳米粒子及适配体修饰的荧光探针可以用于检测四环素，实现四环素特异性、快速、高灵敏荧光检测。量子点在溶液中通常具有很高的量子产率(QY)，所以被广泛用于分析测定，生物成像等领域，但在实际应用，组装时它们不仅容易淬灭，而且量子产率也会减少，这种现象是由激子从量子点到衬底或表面缺陷部位的能量转移引起的。因此，为了克服这种缺陷，可以使用表面增强荧光(SEF)，也称为金属增强荧光(MEF)。本发明以不同壳层厚度的硅包覆银纳米粒子作为等离子增强荧光纳米粒子，以绿色发射的碲化镉量子点为响应荧光探针，并对其进行适配体修饰，这样以硅包覆银纳米粒子作为核心，而量子点接枝在表面的结构，既可以防止量子点组装时因团聚而发生自淬灭，也因核心为金属银纳米粒子产生了金属增强荧光现象，从而解决了量子产率减少的问题。根据不同壳层厚度等离子增强荧光纳米粒子实现对响应荧光探针不同程度的荧光增强，并选取最佳荧光增强的壳层隔绝纳米粒子建立四环素浓度与荧光强度之比的线性关系，从而实现四环素特异性、高灵敏、快速荧光定量检测。结果表明，此荧光探针检测四环素的线性范围为0.2-400μM，检测时间约20-30min完成。通过对金霉素，氯霉素，头孢氨苄，盐酸万古霉素等四环素结构类似物及其他种类抗生素的分析，以及牛奶中可能存在的干扰分析物如葡萄糖，乳糖，L-谷氨酸和牛血清白蛋白的测定，这些物质均不干扰四环素的检测，具有较高的特异性。本荧光探针不需要复杂的合成步骤，不需要苛刻的合成条件，且荧光稳定利于长期保存，检测时间短(30min)，同时本发明的荧光探针制备原料易得、工艺简单、成本低，易于规模化生产。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明提出了一种全新的用于检测四环素残留的壳层隔绝纳米粒子及适配体修饰的荧光探针的制备方法，制备工艺简单、原料易得、成本低，易于规模化生产。
本发明制备的用于检测四环素残留的壳层隔绝纳米粒子及适配体修饰的荧光探针选择性好、灵敏度高，检测速度快，仅对四环素有荧光响应，对其他抗生素包括金霉素，氯霉素，头孢氨苄和盐酸万古霉素均无反应，另外对牛奶基质中可能存在的葡萄糖，乳糖，L-谷氨酸和牛血清白蛋白均无反应，具有很好的选择性和特异性，检测时间短，检测方法简便快速。
采用本发明制备的用于检测四环素残留的壳层隔绝纳米粒子及适配体修饰的荧光探针可有效定量检测四环素残留，并且更加便捷高效、灵敏度高、节约成本，对控制食品安全、保护人体健康具有重要的意义。
附图说明
图1为本发明用于检测四环素残留的壳层隔绝纳米粒子及适配体修饰的荧光探针与四环素反应的荧光响应图；
图2为本发明不同壳层厚度的Ag@SiO2/QD纳米复合材料的透射电镜图如图；
图3为本发明用于检测四环素残留的壳层隔绝纳米粒子及适配体修饰的荧光探针在不同时间时荧光强度稳定性检测图；
图4为本发明用于检测四环素残留的壳层隔绝纳米粒子及适配体修饰的荧光探针与四环素反应的荧光强度线性关系图；
图5为本发明不同壳层厚度的硅包覆银纳米粒子与碲化镉量子点响应后的等离子荧光增强响应图；
图6为本发明用于检测四环素残留的壳层隔绝纳米粒子及适配体修饰的荧光探针与其他抗生素类药物的荧光响应分析示意图；
图7为本发明用于检测四环素残留的壳层隔绝纳米粒子及适配体修饰的荧光探针与牛奶中可能存在的其他物质的荧光响应分析示意图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明中的原料均市售可得。其中3nmol的四环素适配体(5’-NH2-(CH2)-CGTACGGAATTCGCTAGCCCCCCGGCAGGCCACGGCTTGGGTTGGTCCCACTGCGCGTGGATCCGAGCTCCACGTG-3’)购于金斯瑞生物科技股份有限公司；四环素固体购于上海源叶生物技术有限公司，其他市售均可。
实施例1
检测四环素的荧光探针的制备，包括以下步骤：
(1)银纳米粒子制备：将AgNO3(35mg)溶解在200mL水中并将溶液加热至沸腾。加入4mL质量分数1％柠檬酸钠溶液，并将溶液保持沸腾1h，合成的Ag纳米粒子溶液呈黄绿色。
(2)硅包覆银纳米制备：在250r/min搅拌下将40mL乙醇加入到10mL银纳米粒子溶液中，随后向悬浮液中加入0.7mL氨水(质量分数28％)，并将混合物在250r/min下搅拌5分钟。为了获得各种二氧化硅壳厚度，向悬浮液中分别加入不同量(1.0，1.1，1.3mL)的TEOS的乙醇溶液(10mM)，在室温下150r/min缓慢搅拌12h，然后在不搅拌的情况下老化24h，得到三种不同壳层的硅包覆银纳米粒子溶液(Ag@SiO2)。
(3)氨基官能化的硅包覆银纳米制备：将1mL APTMS加入到10mL步骤(1)新制备的三种不同壳层的硅包覆银纳米颗粒溶液中，并将混合物在室温200rpm振荡5h，然后无需振荡在50℃加热1h，得到三种不同壳层的氨基官能化的硅包覆银纳米溶液(Ag@SiO2)。
(4)碲化镉量子点制备：在250mL的三颈圆底烧瓶中加入0.25mmol氯化镉，0.6mmol巯基丙酸，180mL纯水，然后用1mol/L的NaOH调pH＝10。在10mL圆底烧瓶中加入0.0636g Te粉，0.363g硼氢化钠NaBH4，以及8mL的纯水，通氩气磁力室温磁力搅拌约20-30min，当溶液由黑色变为白色时，得到NaHTe前驱体溶液。取2.0mL的NaHTe前驱体溶液加入到上述氩气饱和的氯化镉和巯基丙酸混合溶液中，室温磁力搅拌30min，之后100℃回流反应2h，得到绿色CdTe量子点溶液(CdTe QDs)。
(5)适配体修饰的荧光探针的合成：在冰浴条件下将0.5mL的EDC溶液(10mM)加入到步骤(4)10mL的CdTe量子点溶液中，将混合物200r/min搅拌15min，然后分别加入5mL三种不同壳层的氨基官能化的Ag@SiO2溶液。将混合的悬浮液在0℃下200r/min搅拌2h，并在室温下继续200r/min搅拌4h，得到三种不同壳层的Ag@SiO2/QD纳米复合材料溶液。将1.5mLEDC溶液(10mM)加入到1mL Ag@SiO2/QD溶液中，将混合溶液超声(180W)20min。然后，将四环素适配体用超纯水中并配置成浓度为100μM的溶液，然后取100μL四环素适配体分散在上述溶液中，将溶液在室温下进一步200r/min振荡2h。最后，通过在离心机12000rpm，离心10min，除去未反应的适配体和过量的试剂，并取沉淀，然后在真空下干燥得到荧光探针(Ag@SiO2/QDs-Apt)。通过超声将合成好的探针全部分散到4mL纯净水中，得到分散良好的溶液，并在4℃下保存。
试验例1
实施例1中制得的三种不同壳层的氨基官能化的硅包覆银纳米粒子与碲化镉量子点反应后的荧光光谱测试：
在冰浴条件下将0.5mL的EDC溶液(10mM)加入到10mL的CdTe量子点溶液中，将混合物搅拌15min，然后分别加入5mL三种不同壳层的氨基官能化Ag@SiO2溶液。空白对照组(Control group)为不加入Ag@SiO2溶液。将混合的悬浮液在0℃下搅拌2h，并在室温下继续反应4h，得到三种不同壳层的Ag@SiO2/QD纳米复合材料溶液，及时测量400-800nm波长范围荧光发射光谱。测量时将光电倍增管电压调节至700V，将激发波长设定为400nm，并且激发和发射的狭缝宽度均为5nm的情况下进行荧光检测实验。三种不同壳层的硅包覆银纳米粒子与碲化镉量子点反应后的荧光光谱图见图1，不同壳层厚度的Ag@SiO2/QD纳米复合材料的透射电镜图如图2。
该结果表明，不同壳层厚度等离子增强荧光纳米粒子可以实现对响应荧光探针不同程度的荧光增强，其中相比于空白对照，9nm壳层的Ag@SiO2/QD纳米复合材料实现了3.9倍的荧光增强，而5nm和25nm壳层的Ag@SiO2/QD纳米复合材料仅分别实现了2.7和3.3倍的荧光增强，所以9nm壳层的Ag@SiO2/QD纳米复合材料被选为最佳荧光增强的壳层隔绝纳米粒子，所制得的荧光探针检测其分别在0，6，12，24，36，48，60，72小时的荧光强度，测量时将光电倍增管电压调节至700V，将激发波长设定为400nm，并且激发和发射的狭缝宽度均为5nm的情况下，在室温中进行荧光检测实验，结果见图3，说明其荧光稳定利于长期保存。建立四环素浓度与荧光强度之比的线性关系，从而实现四环素特异性、高灵敏、快速荧光定量检测，具体见试验例2。
试验例2
实施例1中制得的荧光探针与四环素反应的荧光光谱测试：
将0.5mL具有不同浓度(0μM，0.2μM，2μM，20μM，50μM，100μM，200μM，300μM，400μM)的四环素储备溶液添加到上述0.5mL荧光探针溶液中，摇床25℃晃动30min，及时测量400-800nm波长范围荧光发射光谱。测量时将光电倍增管电压调节至700V，将激发波长设定为400nm，并且激发和发射的狭缝宽度均为5nm的情况下进行荧光检测实验。在荧光探针中加入不同浓度四环素荧光光谱图见图4。该实验结果表明，随着四环素浓度的增加，荧光探针在539nm处的荧光强度被连续淬灭。以539nm处荧光强度为测试波长，荧光强度与0.2-400μM范围内的四环素浓度呈线性关系，线性关系曲线见图5。线性曲线拟合方程为得到的相应的线性回归方程为：Y＝5007.522-11.100×CTc(R2＝0.999)其中，Y是在Tc存在下荧光探针(Ag@SiO2/QDs-Apt)的荧光强，CTc是以摩尔浓度(μmol/L)表示的Tc浓度，说明本发明制备的探针可以用于四环素含量的定量分析检测。
试验例3
将实施例1制得的荧光探针与其他抗生素和牛奶中常见物质反应状况分析：
将0.5mL的不同抗生素溶液分别添加到上述0.5mL荧光探针溶液中，在摇床中25℃晃动30min后及时测量其荧光发射光谱。其中，四环素(Tc)，金霉素(CTc)，氯霉素(Chl)，头孢氨苄(Lex)，盐酸万古霉素(Van)，葡萄糖(Glucose)，乳糖(Lactose)，L-谷氨酸(L-Glutamic)和牛血清白蛋白(BSA)的最终浓度均为300μmol/L。荧光发射光谱测定以400nm激发：激发与发射的狭缝宽度为5nm/5nm，测量电压为700V。根据荧光探针539nm处荧光强度与其他抗生素和干扰物的荧光响应所得荧光光谱图见图6和图7。
将实施例1制得的荧光探针加标回收实验分析：
将超市购买的纯牛奶样品12000r/min超速离心5min，加入四环素固体，配置成浓度分别为0.2μM，1μM，3μM，5μM的四环素牛奶溶液，各取500μL，加入500μL乙腈，超声沉淀5min除去生物样品中的蛋白质，12000r/min超速离心两次，吸取上层清液添加到上述0.5mL荧光探针溶液中，并在摇床中25℃晃动30min。将光电倍增管电压调节至700V，将激发波长设定为400nm，并且激发和发射的狭缝宽度均为5nm的情况下进行荧光光谱测试，根据539nm处荧光强度之比与四环素浓度之间的线性关系，计算加标回收液的浓度，从而得到回收率，结果见表1。该实验结果表明该荧光探针用于牛奶中四环素的检测，回收率为96.50％-101.80％，此方法准确性高。
表1牛奶中四环素浓度检测及其加标回收测定
Figure BDA0002598311850000071
Figure BDA0002598311850000081
以上结果表1和图4和图5表明：实施例1制得的荧光探针能够实现四环素快速荧光定量检测，检测范围为0.2-400μM，检出限为16.2nM，回收率为96.50％-101.80％。且可以实现四环素的定量测定，快速简便，检测线性范围宽，检出限低，灵敏度高，对四环素具有高度的选择性和特异性，并且在上述条件下，能够从金霉素，氯霉素，头孢氨苄和盐酸万古霉素等抗生素中区分出四环素，而且牛奶中可能存在的其他物质如葡萄糖，乳糖，L-谷氨酸和牛血清白蛋白不干扰四环素的测定。
此外，本发明的检测方法只需要30min即可(反应时间)，而采用普通高效液相色谱法检测四环素，检测方法步骤复杂，测试时间长至3h以上。本发明所需原料都易得，价格低廉，单个样品分析速度与液相，液质相比，速度更快，回收率实验表明，此方法能够准确用于四环素的定量检测。
实施例2
检测四环素的荧光探针的制备，包括以下步骤：
(1)银纳米粒子制备：将AgNO3(35mg)溶解在200mL水中并将溶液加热至沸腾。加入4mL质量分数1％柠檬酸钠溶液，并将溶液保持沸腾2h，合成的Ag纳米粒子溶液呈黄绿色。
(2)硅包覆银纳米制备：在250r/min搅拌下将40mL乙醇加入到10mL银纳米粒子溶液中，随后向悬浮液中加入0.8mL氨水(质量分数28％)，并将混合物在250r/min下搅拌5分钟。为了获得各种二氧化硅壳厚度，向悬浮液中分别加入不同量(1.0，1.1，1.3mL)的TEOS的乙醇溶液(10mM)，在室温下150r/min缓慢搅拌10h，然后在不搅拌的情况下老化20h，得到三种不同壳层的硅包覆银纳米粒子溶液(Ag@SiO2)。
(3)氨基官能化的硅包覆银纳米制备：将1mL APTMS加入到11mL步骤(1)新制备的三种不同壳层的硅包覆银纳米颗粒溶液中，并将混合物在室温200rpm振荡3h，然后无需振荡在60℃加热2h，得到三种不同壳层的氨基官能化的硅包覆银纳米溶液(Ag@SiO2)。
(4)碲化镉量子点制备：在250mL的三颈圆底烧瓶中加入0.25mmol氯化镉，0.6mmol巯基丙酸，180mL纯水，然后用1mol/L的NaOH调pH＝10。在10mL圆底烧瓶中加入0.0636g Te粉，0.363g硼氢化钠NaBH4，以及8mL的纯水，通氩气磁力室温磁力搅拌约20-30min，当溶液由黑色变为白色时，得到NaHTe前驱体溶液。取2.0mL的NaHTe前驱体溶液加入到上述氩气饱和的氯化镉和巯基丙酸混合溶液中，室温磁力搅拌30min，之后100℃回流反应2h，得到绿色CdTe量子点溶液(CdTe QDs)。
(5)适配体修饰的荧光探针的合成：在冰浴条件下将0.5mL的EDC溶液(10mM)加入到步骤(4)12.5mL的CdTe量子点溶液中，将混合物200r/min搅拌15min，然后分别加入5mL三种不同壳层的氨基官能化的Ag@SiO2溶液。将混合的悬浮液在0℃下200r/min搅拌1h，并在室温下继续200r/min搅拌3h，得到三种不同壳层的Ag@SiO2/QD纳米复合材料溶液。将3mLEDC溶液加入到1mL Ag@SiO2/QD溶液中，将混合溶液超声20min。然后，将四环素适配体溶解于超纯水中配置成浓度为100μM的溶液，然后取100μL四环素适配体分散在上述溶液中，将溶液在室温下进一步200r/min振荡1h。最后，通过在离心机12000rpm，离心10min，除去未反应的适配体和过量的试剂，并取沉淀，然后在真空下干燥得到荧光探针(Ag@SiO2/QDs-Apt)。通过超声将合成好的探针全部分散到4mL纯净水中，得到分散良好的溶液，并在4℃下保存。
实施例3
实施例3与实施例1的制备方法相同，不同之处在于：步骤(4)所述碲粉、硼氢化钠的摩尔比为1：15。
序列表
<110> 南京师范大学
<120> 一种用于检测四环素残留的荧光探针及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgtacggaat tcgctagccc cccggcaggc cacggcttgg gttggtccca ctgcgcgtgg 60
atccgagctc cacgtg 76

Claims (10)

1.一种用于检测四环素残留的壳层隔绝纳米粒子及适配体修饰的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)银纳米粒子制备：将硝酸银溶解在水中加热至沸腾，加入柠檬酸钠，继续加热沸腾得到银纳米粒子溶液；
(2)硅包覆银纳米制备：将步骤(1)制得银纳米粒子、氨水、正硅酸四乙酯反应生成硅包覆银纳米粒子溶液；
(3)氨基官能化的硅包覆银纳米制备：将步骤(2)制得的硅包覆银纳米粒子和3-氨基丙基三甲氧基硅烷反应生成表面氨基官能化的硅包覆银纳米溶液；
(4)碲化镉量子点制备：将碲粉、硼氢化钠、水通气反应得到碲氢化钠前驱体；将氯化镉、巯基丙酸、水混合再加入碲氢化钠前驱体继续反应，得到碲化镉量子点；
(5)适配体修饰的荧光探针的合成：将碲化镉量子点、氨基官能化的硅包覆银纳米粒子、四环素适配体、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐胺混合反应制成荧光探针。
2.根据权利要求1所述的用于检测四环素残留的壳层隔绝纳米粒子及适配体修饰的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述加热沸腾得到银纳米粒子为在沸腾条件下保持1-2h。
3.根据权利要求1所述的用于检测四环素残留的壳层隔绝纳米粒子及适配体修饰的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述银纳米粒子、氨水、正硅酸四乙酯(TEOS)在乙醇溶液中室温条件下保持10-12h，静置老化20-24h，其中银纳米粒子溶液与氨水体积比为100:7-100:8，银纳米粒子溶液与正硅酸四乙酯的体积比为100:10-13。
4.根据权利要求1所述的用于检测四环素残留的壳层隔绝纳米粒子及适配体修饰的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述硅包覆银纳米粒子和3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)优选室温反应3-5h，在50-60℃加热1-2h，其中硅包覆银纳米粒子与APTMS体积比为10:1-11:1。
5.根据权利要求1所述的用于检测四环素残留的壳层隔绝纳米粒子及适配体修饰的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述碲粉、硼氢化钠的摩尔比例为1:15-1:20；所述通气反应得到碲氢化钠前驱体为室温通氩气磁力搅拌反应20-30min，当溶液由黑色变为白色时，得到碲氢化钠前驱体溶液。
6.根据权利要求1所述的用于检测四环素残留的壳层隔绝纳米粒子及适配体修饰的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述将氯化镉、巯基丙酸、水混合再加入碲氢化钠前驱体为将碲氢化钠前驱体溶液加入到氩气饱和的氯化镉和巯基丙酸混合水溶液中，室温搅拌反应，之后再回流反应。
7.根据权利要求1所述的用于检测四环素残留的壳层隔绝纳米粒子及适配体修饰的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述氯化镉、碲粉和巯基丙酸的摩尔比1：0.5：2.4。
8.根据权利要求1所述的用于检测四环素残留的壳层隔绝纳米粒子及适配体修饰的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述将碲化镉量子点、氨基官能化的硅包覆银纳米粒子、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐混合冰浴反应1-2h，室温反应3-4h，再将所得溶液与四环素适配体，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液室温振荡1-2h，其中碲化镉量子点溶液，氨基官能化的硅包覆银纳米粒子溶液与第一次加入的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液的体积比为20:10:1-25:10:1；所得溶液、四环素适配体与第二次加入的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液的体积比为10:1:15-30。
9.一种权利要求1所述的用于检测四环素残留的壳层隔绝纳米粒子及适配体修饰的荧光探针的制备方法所制备的壳层隔绝纳米粒子及适配体修饰的荧光探针。
10.一种权利要求9所述的壳层隔绝纳米粒子及适配体修饰的荧光探针在四环素浓度的定量检测中的应用。
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