CN112375561B - 上转换荧光纳米探针及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种上转换荧光纳米探针及其应用，通过以上转换荧光纳米颗粒(UCNPs)为能量供体、有机染料FAM为能量受体，基于分子信标模型构建检测卵巢癌标志物CA125的荧光分析体系。基于UCNPs与FAM二者间的荧光共振能量转移引起UCNPs上转换荧光猝灭，而CA125与适配体序列的特异性识别打开DNA的发卡型结构，从而抑制FRET过程并恢复UCNPs的上转换荧光强度。本发明制得的纳米探针对CA125具有较高的灵敏度及选择性，其检出限可达0.017U/mL，因此可用于人血清中CA125的定量检测，并有望用于临床上卵巢恶性肿瘤的早期诊断。

Description

上转换荧光纳米探针及其应用
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种上转换荧光纳米探针及其应用。
背景技术
恶性肿瘤(癌症)具有细胞无限增殖、易转移等特点，是致死率最高的重大疾病。其中，卵巢癌是致死率较高的妇科恶性肿瘤。目前，卵巢癌患者多在肿瘤发展晚期才得以确诊，确诊后患者存活超过5年的比例不到50％(Webb P M,Jordan S J.Epidemiology ofepithelial ovarian cancer[J].Best Practice&Research Clinical Obstetrics&Gynaecology,2017,41:3-14.)。早期确诊可使患者存活超过5年的比例提升到90％(BaciD,Bosi A,Gallazzi M,et al.The ovarian cancer tumor immune microenvironment(TIME)as Target for Therapy:A Focus on Innate Immunity Cells as TherapeuticEffectors[J].International Journal of Molecular Sciences,2020,21:3125.)，且卵巢癌的早期诊断是提高其治愈率的重要手段。因此，开发卵巢癌早期诊断的策略具有重要意义。CA125是美国食品药品监督管理局(FDA)批准的卵巢癌标志物，其浓度与卵巢癌的发生、发展密切相关。绝大部分卵巢癌患者血清中的CA125浓度偏高(正常人一般低于35U/mL)，因此可作为卵巢癌早期诊断的辅助手段。
目前，已经发展了多种检测CA125的方法，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、光电免疫分析、微流控芯片电泳等方法。但是这些方法具有检测步骤繁琐、灵敏度低等缺点，限制了其在实际样品检测分析中的应用。
基于FRET(荧光共振能量转移)策略的荧光探针是一种操作简单的均相荧光分析技术，其检测过程不需样品预处理，可直接进行血清内生物组分的定量分析。通过将待测目标物与探针反应后抑制或促进FRET过程引起探针荧光信号增强或减弱，进而可根据荧光强度变化计算出目标物浓度。其中，荧光增强型FRET探针具有更高的灵敏度，将其用于CA125的分析检测将具有重要价值。然而，现有的FRET荧光分析体系多采用可见光激发的荧光材料为能量供体。在可见光激发下，生物样品会产生较强的自发荧光，从而给检测结果带来严重干扰，而致使上转换探针在分析中的准确性严重受限。
发明内容
为了改善上述技术问题，本发明提供一种基于上转换荧光材料耦合FAM染料的探针及其在检测CA125中的应用，只需通过简单混合上转换荧光纳米探针和待测目标物，即可实现血清中的CA125的精准检测，具有快速简易、高灵敏度、高选择性和低成本等优点。
本发明的技术方案如下：
本发明提供一种上转换荧光纳米探针，其包括UCNPs、有机染料FAM(即羧基荧光素)以及发卡型DNA；UCNPs与FAM分别连接于发卡型DNA的两端，满足FRET发生的距离要求；所述UCNPs指镧系元素掺杂的上转换荧光纳米颗粒，UCNPs的发射光谱与FAM的吸收光谱相匹配。
其中，UCNPs为FRET过程的能量供体，FAM为FRET过程的能量受体。
根据本发明的实施方案，所述UCNPs为水溶性镧系元素掺杂的上转换荧光纳米颗粒，可以以化学式NaYF4:Ln3+表示，其中Ln可以选自稀土元素La、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu中的一种、两种或更多种。
根据本发明示例性的实施方案，所述UCNPs可以选自NaYF4:Yb3+:Tm3+或NaYF4:Er3+,Yb3+。
根据本发明的实施方案，所述UCNPs可以选自平均粒径7～200nm的纳米颗粒，如10～80nm；示例性地，粒径可以为10nm、20nm、25nm、40nm、50nm、80nm、100nm、150nm、200nm。
优选地，所述水溶性镧系元素掺杂的上转换荧光纳米颗粒的表面带有羧酸基团，例如所述羧酸基团可以通过PAA(聚丙烯酸)、己二酸、柠檬酸、3-巯基丙酸等对表面无配体修饰的UCNPs进行包覆引入。优选地，所述水溶性镧系元素掺杂的上转换荧光纳米颗粒可以为PAA-UCNPs，例如可以为PAA-NaYF4:Yb3+:Tm3+。
根据本发明的实施方案，所述发卡型DNA具有与待测目标物CA125的适配体Apt、以及与UCNPs表面的羧基相反应的-NH2。例如，所述适配体Apt的序列为CTCACTATAGGGAGACAAGAATAAACGCTCAA。优选地，所述发卡型DNA为AACAACCTCACTATAGGGAGACAAGAATAAACGCTCAAAGGTTG-NH2。
根据本发明的实施方案，所述上转换荧光纳米探针可以以FAM-Apt-UCNPs表示，其通过UCNPs表面的羧基与FAM-Apt-NH2末端-NH2之间的酰胺化反应制备得到。
根据本发明的实施方案，所述上转换荧光纳米探针和UCNPs的上转换荧光强度的峰值在470-485nm处，优选475-483nm，示例性为478nm。
根据本发明的实施方案，所述有机染料FAM的吸收峰与UCNPs的发射峰相匹配，例如在470-495nm处，优选475-490nm，示例性为488nm。
本发明还提供上述上转换荧光纳米探针的制备方法，包括如下步骤：在交联剂存在下，将FAM-Apt-NH2与UCNPs共价偶联，制备得到所述上转换荧光纳米探针。
根据本发明的实施方案，所述交联剂包括EDC·HCl和Sulfo-NHS。
根据本发明的实施方案，所述UCNPs具有如上文所述的含义，优选为表面带有羧酸基团的UCNPs。
根据本发明的实施方案，所述表面带有羧酸基团的UCNPs的制备过程包括：将表面无配体修饰的UCNPs纳米颗粒与有机酸反应，得到所述表面带有羧酸基团的UCNPs。例如，所述表面无配体修饰的UCNPs纳米颗粒为稀土元素掺杂的NaYF4纳米材料，所述稀土元素选自La、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu中的一种、两种或更多种。
例如，所述有机酸可以为聚丙烯酸、己二酸、柠檬酸或3-巯基丙酸等。优选地，所述表面无配体修饰的UCNPs纳米颗粒与有机酸的用量比为1mg：(0.1～5)nmol；优选为1mg：(0.1～1)nmol；示例性为1mg：0.1nmol、1mg：0.5nmol、1mg：1nmol、1mg：2nmol、1mg：5nmol。
优选地，所述表面无配体修饰的UCNPs纳米颗粒可以通过酸洗表面带有油酸和/或油胺等的UCNPs纳米颗粒制备得到。
例如，所述酸洗处理包括如下步骤：
a)配制pH在0.5～1.5之间的乙醇酸溶液；
b)将表面带有油酸和/或油胺等的UCNPs纳米颗粒溶解于步骤a)所述乙醇酸溶液中，超声、洗涤后，得到表面无配体修饰的UCNPs纳米颗粒；
优选地，所述表面带有油酸和/或油胺等的UCNPs纳米颗粒在乙醇酸溶液中的浓度为1～3mg/mL，所述超声的时间为1～4h，所述洗涤可以依次用乙醇和去离子水洗涤数次。
根据本发明的实施方案，所述共价偶联的温度为30～50℃，优选为35～40℃；根据本发明示例性的实施方案，所述共价偶联的温度为37℃。
根据本发明的实施方案，所述共价偶联的时间为1～24h；优选为4～18h；根据本发明示例性的实施方案，所述共价偶联的时间为12h。
根据本发明的实施方案，所述上转换荧光纳米探针的制备方法还包括在共价偶联之前，需要先活化表面带有羧酸基团的UCNPs表面的羧基。例如，活化方法包括：通过先将表面带有羧酸基团的UCNPs、EDC·HCl和Sulfo-NHS依次溶于MES缓冲溶液中振摇，以活化UCNPs表面的羧基。
根据本发明的实施方案，所述表面带有羧酸基团的UCNPs(例如PAA-UCNPs)、EDC·HCl和Sulfo-NHS的用量比为1mg:(0.1-0.8)mg:(0.2-2)mg；优选为1mg:(0.1-0.5)mg:(0.5-1)mg；根据本发明示例性的实施方案，所述表面带有羧酸基团的UCNPs(例如PAA-UCNPs)、EDC·HCl和Sulfo-NHS的用量比为1mg:0.2mg:0.6mg。
根据本发明的实施方案，所述活化的温度为30～50℃；优选为35～40℃；根据本发明示例性的实施方案，所述活化的温度为37℃。
根据本发明的实施方案，所述活化的时间为0.5～2h；优选为0.5～1h；根据本发明示例性的实施方案，所述活化的时间为1h。
根据本发明的实施方案，所述上转换荧光纳米探针的制备方法还包括对表面羧基活化后的UCNPs进行固液分离得到反应产物的过程。例如，所述固液分离可以采用本领域已知手段，比如离心。
优选地，所述表面羧基活化后的UCNPs可以以固体形式加入FAM-Apt-NH2的缓冲溶液中。
根据本发明的实施方案，所述UCNPs(例如PAA-UCNPs)与FAM-Apt-NH2的用量比为1mg：(0.1-2)nmol；优选为1mg：(0.5-1)nmol；示例性为1mg：0.1nmol、1mg：0.1nmol、1mg：0.5nmol、1mg：1nmol、1mg：2nmol。
根据本发明的实施方案，所述上转换荧光纳米探针的制备方法还包括待反应结束后，加入封闭剂封闭剩余的Sulfo-NHS；例如，通过将Tris-HCl添加到混合物中封闭剩余的Sulfo-NHS。优选地，所述Tris-HCl与Sulfo-NHS的用量比为10mg:(0.2-2)mg；优选为10mg:(0.5-1)mg；根据本发明示例性的实施方案，所述Tris-HCl与Sulfo-NHS的用量比为10mg:0.6mg。
根据本发明的实施方案，所述上转换荧光纳米探针的制备方法还包括待反应结束后，对反应体系进行固液分离得到反应产物的过程。例如，所述固液分离可以采用本领域已知手段，比如离心。
根据本发明的实施方案，所述上转换荧光纳米探针的制备方法还包括对固液分离得到的反应产物进行洗涤。例如，采用能够溶解所述FAM-Apt-UCNPs的溶剂对反应产物进行洗涤。优选地，所述溶剂可以为水。又如，所述洗涤的次数可以为一次、两次或更多次，优选为三次。
根据本发明示例性的方案，所述上转换荧光纳米探针的制备方法，包括如下步骤：
将100μL(10mg/mL)PAA-UCNPs、0.2mg EDC·HCl和0.6mg Sulfo-NHS依次加入到700μL(10mmol/L，pH 5.5)MES缓冲溶液中，37℃摇动1小时以活化PAA-UCNPs表面的羧基。离心收集活化的纳米颗粒，分散于含有1nmol NH2-Apt-FAM的1mL HEPES缓冲溶液(10mmol/L，pH 7.4)缓冲溶液中，37℃孵育12h后，将10mg Tris-HCl添加到混合物中封闭剩余的Sulfo-NHS。离心收集沉淀，并用水洗涤3次，最后将得到的上转换荧光纳米探针(FAM-Apt-UCNPs)分散于1mL HEPES缓冲溶液(10mmol/L，pH 7.4)缓冲溶液中，4℃保存。
本发明还提供上述上转换荧光纳米探针在检测待测目标物CA125中的应用。
本发明还提供上述上转换荧光纳米探针检测CA125的方法，该方法包括将待测目标物CA125与所述上转换荧光纳米探针混合。
根据本发明实施方案，所述待测目标物选自离体血清或全血中的CA125。
根据本发明的实施方案，该方法还包括含有待测目标物的待测试样品与所述上转换荧光纳米探针混合后，测定混合液的发光强度，计算待测目标物的浓度。其中，所述上转换荧光纳米探针在待测试样品中的浓度为0.01-1.0mg/ml，例如0.03-0.08mg/ml，示例性为0.05mg/ml。
优选地，所述待测目标物的浓度通过代入待测目标物的浓度依赖型标准曲线计算得到。
根据本发明的实施方案，所述方法还包括配制不同浓度的纳米探针水溶液和待测目标物溶液。
根据本发明的实施方案，所述方法具体包括以下步骤：
1)将水溶性镧系元素掺杂的上转换荧光纳米颗粒UCNPs分散于水溶液中，得到不同浓度的纳米材料水溶液；
2)合成FAM-Apt-NH2；
3)制备纳米探针:将纳米材料水溶液和FAM-Apt-NH2溶液按不同体积比混合后，孵育，得到纳米探针，测定各混合液的发光强度，并且计算出发光猝灭效率，得到荧光猝灭效率最大的混合液中所对应的纳米材料水溶液浓度和FAM-Apt-NH2的浓度值；
4)配制不同浓度的待测目标物溶液；
优选地，配制不同浓度的CA125溶液；
5)绘制待测目标物的浓度依赖型标准曲线；
优选地，所述待测目标物的浓度依赖型标准曲线绘制的步骤如下：取荧光猝灭效率最大时对应浓度的纳米材料水溶液和FAM-Apt-NH2溶液的混合液，以其中一组混合液为空白样，向其余各组混合液中分别加入已知浓度的待测目标物溶液混合，孵育，测定混合液的发光强度，空白样的荧光强度为F0，加入待测目标物溶液后的各组混合液的荧光强度为F，以
Figure BDA0002745856460000071
为纵坐标，待测目标物溶液浓度的对数为横坐标，做出待测目标物的浓度依赖型标准曲线；
示例性地，所述待测目标物的浓度依赖型标准曲线由以下步骤绘制得到：取荧光猝灭效率最大时对应浓度的纳米材料水溶液和FAM-Apt-NH2溶液的混合液，以其中一组混合液为空白样，向其余各组混合液中分别加入已知浓度的CA125溶液混合，孵育，测定混合液的发光强度，空白样的荧光强度为F0，加入CA125溶液后的各组混合液的荧光强度为F，以
Figure BDA0002745856460000072
为纵坐标，CA125溶液浓度的对数为横坐标，做出CA125溶液的浓度依赖型标准曲线；
6)检测待测目标物的浓度；
优选地，所述待测目标物的浓度具体通过以下步骤测得：取荧光猝灭效率最大时对应浓度的纳米材料水溶液和FAM-Apt-NH2溶液的混合液和未知浓度的待测目标物溶液混合，孵育，测定混合液的发光强度，代入步骤5)绘制的待测目标物的浓度依赖型标准曲线，得出待测目标物的浓度；
示例性地，所述待测目标物的浓度具体通过以下步骤得到：取荧光猝灭效率最大时对应浓度的纳米材料水溶液和FAM-Apt-NH2溶液的混合液和未知浓度的CA125溶液混合，孵育，测定混合液的发光强度，代入步骤5)所绘制的待测目标物的浓度依赖型标准曲线，得出CA125的浓度；
根据本发明的实施方案，步骤4)中所述待测目标物溶液由待测目标物与缓冲溶液混合得到；
优选地，所述缓冲溶液可以选自pH值为7～11的缓冲溶液；例如，所述缓冲溶液可以选自HEPES水溶液、MES缓冲溶液、Tris-HCl缓冲液、NaOH-H3BO3缓冲液、NaCO3-NaHCO3缓冲液、磷酸盐缓冲液等；根据本发明示例性的实施方案，所述缓冲溶液选自HEPES水溶液(10mmol/L，pH 7.4，NaCl，0.15mol/L)；MES缓冲溶液(10mmol/L，pH 5.5)；
根据本发明示例性的实施方案，所述CA125溶液由CA125与HEPES水溶液混合得到；所述CA125的浓度大于0且小于等于100U/mL，优选为0.02-100U/mL。
根据本发明的实施方案，步骤5)中所述孵育的温度可以选自30～50℃，优选地，所述孵育的温度选自35～40℃，根据本发明示例性的实施方案，所述孵育的温度为37℃；
所述孵育的时间可以选自5～90min，优选地，所述孵育的时间选自60～90min；根据本发明示例性的实施方案，所述孵育的时间为70min；
优选地，所述纳米材料水溶液、FAM-Apt-NH2溶液和不同浓度的CA125溶液的浓度和体积可以按任意比例混合。
根据本发明的实施方案，步骤5)、6)中所述混合液的发光强度的测定在F-7000荧光分光光度计(日本日立)中进行。
本发明还提供了上述检测方法的用途，其用于CA125肿瘤标志物的检测；
优选地，所述检测方法用于血清或全血样品中的CA125肿瘤标志物的检测。
本发明还提供了一种试剂盒，其包含上述上转换荧光纳米探针。
本发明还提供了一种生物传感器，其包含上述上转换荧光纳米探针。
本发明还提供上述试剂盒和/或生物传感器在检测CA125肿瘤标志物中的用途。
本发明的有益效果：
本发明通过以上转换荧光纳米颗粒(UCNPs)为能量供体、有机染料FAM为能量受体，基于分子信标模型构建检测卵巢癌标志物CA125的荧光分析体系。UCNPs与FAM分别标记于目标分子适配体(发卡型DNA)两端，二者间经荧光共振能量转移(FRET)引起UCNPs上转换荧光猝灭，猝灭效率可高达83％。CA125与目标分子适配体序列特异性结合后，打开其发卡型结构，使UCNPs与FAM的距离增大，抑制FRET过程，导致上转换荧光增强。上转换荧光强度与CA125浓度的对数具有良好的线性关系，线性范围为0.02-100U/mL，检出限为0.017U/mL。该荧光分析系统具有快速简易、高灵敏度、高选择性、高稳定性和低成本等优点，可成功用于人血清中CA125的定量检测，有望成为卵巢癌早期诊断的有力工具。
附图说明
图1为基于UC-FRET的CA125探针构建及响应机理示意图。
图2为OA-UCNPs的透射电子显微镜图像(A)及X-射线衍射谱图(B)。
图3为UCNPs，OA-UCNPs和PAA-UCNPs的傅里叶变换红外光谱。
图4为FAM的紫外-可见吸收光谱(a)和UCNPs的发射光谱(b)。
图5为相同浓度PAA-UCNPs和FAM-Apt-UCNPs的吸收光谱(A)及上转换荧光光谱(B)。
图6为FAM-Apt-UCNPs与CA125孵育不同时间后478nm处的上转换荧光强度。
图7中(A)为HEPES缓冲溶液中FAM-Apt-UCNPs与不同浓度CA125反应后的上转换荧光光谱图；(B)为478nm处上转换荧光强度增强倍数[(F–F0)/F0]与CA125浓度对数的关系曲线。
图8中(A)为FAM-Apt-UCNPs在37℃孵育不同时间的上转换荧光强度；(B)为FAM-Apt-UCNPs的选择性测试。
图9中(A)为FAM-Apt-UCNPs与人血清中不同浓度的CA125反应后的上转换荧光光谱图；(B)为FAM-Apt-UCNPs探针在478nm处上转换荧光强度与CA125浓度对数的线性关系。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
主要仪器：980nm P2型可调半导体激光器一体化光源(海特光电有限责任公司)；FT-IR红外光谱仪(美国尼高力)；TGL-16M型高速冷冻离心机(上海卢湘仪器离心仪器有限公司)；UV-vis分光光度计(日本岛津)；Tecnai G2 20 ST透射电子显微镜(捷克FEI)；F-7000荧光分光光度计(日本日立)；THZ-C台式恒温振荡器(苏州培英实验设备有限公司)。
主要试剂：氧化钇、氧化铒、氧化镱、氟化钠、油酸(OA)、1-十八烯(ODE)购买于国药集团化学试剂有限公司，纯度均为分析纯；聚丙烯酸(PAA)、N-羟基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸EDC·HCl购买于Sigma-Aldrich；免疫球蛋白(IgG)、癌胚抗原(YA)、人附睾蛋白4(HE4)、甲胎蛋白(AFP)、CA125购买于上海领潮；NH2-Apt-FAM(FAM-AACAACCTCACTATAGGGAGACAAGAATAAACGCTCAAAGGTTG-NH2)购买于生工生物工程有限公司；正常人及病人血清由湖北省人民医院提供；文中所用的水均为超纯水，检测所用缓冲液均为HEPES水溶液(10mmol/L，pH 7.4，NaCl，0.15mol/L)。
参照图1，基于上转换荧光共振能量转移(UC-FRET)机理，采用分子信标模型，构建荧光增强型CA125荧光分析系统。上转换荧光纳米探针由UCNPs、有机染料FAM以及发卡型DNA三部分组成。UCNPs发射光谱与FAM吸收光谱匹配，可分别充当FRET过程的能量供体和能量受体；UCNPs与FAM分别连接于发卡型DNA的两端，满足FRET发生的距离要求，此时UCNPs的上转换荧光被FAM猝灭。当CA125存在时，CA125与适配体序列结合，迫使DNA的发卡型结构打开，构型变化增大了UCNPs与FAM的距离，进而抑制FRET作用，引起UCNPs的上转换荧光增强。该探针具有良好的选择性与稳定性，不仅适用于缓冲溶液中CA125的分析检测，还可用于人血清样品中的CA125定量分析，有望成为卵巢癌早期诊断的有效工具。
实施例1稀土油酸盐(Ln(oleate)3)合成
将稀土金属氧化物Y2O3:Yb2O3:Tm2O3(2.5mmol)以物质的量79.8:20:0.2的比例加入到单口瓶中，滴入适量盐酸，加热至溶液澄清。蒸馏除去溶剂，得到稀土盐酸盐。加入7.5mL超纯水、10mL乙醇、17.5mL正己烷，70℃加热5小时，待冷却至室温后萃取三次，旋蒸除去溶剂，将产物溶于体积比1:1的油酸和1-十八烯的溶剂中。
实施例2油酸(OA)包覆的UCNPs(OA-UCNPs)合成
将1mmol Ln(oleate)3(稀土离子摩尔比为Y3+:Yb3+:Tm3+＝79.8:20:0.2)、20mmolNaF、6mL油酸(OA)和6mL 1-十八烯(ODE)依次加入三口烧瓶，在氩气氛围下将温度升高至50℃，加热搅拌1h，以除去混合物中的水和氧气。升温至320℃，并在该温度下继续搅拌2h，随后将混合物在240℃退火1h，以减少纳米颗粒表面的缺陷，增强上转换发光效率。冷却至室温后，用12000rpm/min的转速离心，收集所得的纳米颗粒，用己烷洗涤3次，将得到的OA-UCNPs分散在环己烷中待用。
对本实施例制得的OA-UCNPs进行透射电子显微镜(TEM)表征，结果如图2中(A)所示。图中结果表明，本实施例制得的OA-UCNPs为形貌均一的球形，直径约为41nm。
采用X-射线衍射(XRD)对本实施例制得的OA-UCNPs的晶相结构进行表征，结果如图2中(B)所示，其XRD谱图与标准六方相NaFY4晶体(β-NaYF4-16-0334)一致，表明其晶相为六方相。六方相的UCNPs上转换发光效率比立方相的高一个数量级，因此可保证探针具有足够的上转换荧光强度。
实施例3 PAA包覆的UCNPs(PAA-UCNPs)合成
向装有100mg实施例2制得的OA-UCNPs的单口瓶中加入50mL乙醇，用浓盐酸调节至pH＝1。超声3h，去除纳米颗粒表面修饰的油酸配体。离心后收集沉淀，并依次用乙醇、水洗涤，得到表面无配体修饰的UCNPs纳米颗粒。将所得UCNPs加入到含有50nmol PAA的10mL超纯水中，室温下搅拌12h，离心水洗，收集并提纯，得PAA-UCNPs，分散在超纯水中，4℃储存。
OA-UCNPs难以分散于水相中，且缺乏与DNA偶联的活性基团，故需对实施例2中所合成的OA-UCNPs进行表面配体交换。PAA的羧基可经酰胺化反应与DNA等生物分子偶联，且具有良好的水溶性，采用PAA替换OA-UCNPs表面的油酸分子可同时解决上述问题。PAA-UCNPs的制备分为两步：(1)在盐酸的乙醇溶液中超声去除UCNPs表面油酸配体；(2)利用羧基与表面稀土离子间的配位作用在UCNPs表面包覆PAA。通过傅立叶变换红外光谱(FT-IR)表征PAA-UCNPs的制备过程，结果如图3所示。从图中结果可以看出，去除纳米颗粒表面修饰的油酸配体后，归属于油酸分子的COO-基团的对称和反对称伸缩振动峰(1565cm-1)消失，表明油酸配体已成功移除；当使用聚丙烯酸(PAA)进一步修饰后，PAA-UCNPs的FT-IR谱图中出现COO-基团的对称和反对称伸缩振动峰(1565cm-1)和C＝O的伸缩振动(1709cm-1)，由此表明PAA-UCNPs制备成功。
实施例4 CA125探针FAM-Apt-UCNPs制备
以EDC·HCl和Sulfo-NHS为交联剂进行NH2-Apt-FAM和PAA-UCNPs的共价偶联。具体步骤为：将100μL(10mg mL-1)实施例3制备的PAA-UCNPs水分散液、0.2mg EDC·HCl和0.6mg Sulfo-NHS依次加入到700μL MES缓冲溶液(10mmol L-1，pH 5.5)中，37℃摇动1小时以活化PAA-UCNPs表面的羧基。离心收集活化的纳米颗粒，分散于含有1nmol CA125适配体的1mL HEPES缓冲溶液(10mmol L-1，pH 7.4)中。37℃孵育12h后，将10mg Tris-HCl添加到混合物中封闭剩余的Sulfo-NHS。离心收集沉淀，并用水洗涤3次。最后将得到的FAM-Apt-UCNPs分散于1mL HEPES缓冲溶液(10mmol L-1，pH 7.4)中，4℃保存。
FAM-Apt-UCNPs探针是基于UCNPs到能量受体之间的FRET过程构建，而FRET发生需要满足两个基本条件：(1)能量供体的发射光谱与能量受体的吸收光谱匹配；(2)能量供体与能量受体的距离接近(<10nm)。故选取光物理性质匹配的能量受体是需要考虑的重要因素之一，图4为FAM的紫外-可见吸收光谱(a)和UCNPs的发射光谱(b)。从图中结果可以看出：FAM的紫外吸收峰位于488nm，其吸收光谱与UCNPs的发射光谱匹配，因此可作为优良的能量受体，与UCNPs发生荧光共振能量转移(FRET)，以提高对CA125的检测灵敏度。
利用PAA-UCNPs表面-COOH与FAM-Apt-NH2末端-NH2之间的酰胺化反应，可实现二者间偶联。图5中(A)显示，FAM-Apt-UCNPs的紫外-可见吸收光谱在260nm及488nm处存在两个明显的吸收峰，分别对应FAM-Apt-NH2中的DNA链与FAM的吸收峰，由此表明纳米探针偶联成功。
FAM-Apt-NH2的发卡型结构能够拉近UCNPs与FAM的距离，促使FRET过程的发生。由图5中(B)可知，PAA-UCNPs与FAM-Apt-NH2连接后，上转换荧光强度显著降低，根据公式(1)可以计算出其猝灭效率QE高达83％。
Figure BDA0002745856460000141
其中FPAA-UCNPs与FFAM-Apt-UCNPs分别代表PAA-UCNPs与FAM-Apt-UCNPs在峰值478nm处的上转换荧光强度。
实施例5缓冲溶液中CA125检测
将实施例4制得的纳米探针与不同浓度的CA125溶液分别加入至2mL离心管中，控制纳米探针的终浓度均为0.05mg/mL，然后分别于37℃孵育70min。以980nm连续激光器作为光源(功率1W)，测量410nm-550nm范围的上转换荧光，每组混合液平行测定3次。
CA125与适配体结合迫使DNA的发卡型结构打开，从而增大了UCNPs与有机染料FAM的距离，从而抑制FRET过程，由此导致UCNPs的上转换荧光恢复。为确保探针与CA125完全反应，首先进行了反应动力学测试。结果如图6所示，当向纳米探针溶液中加入30U/mL的CA125后，纳米探针的上转换荧光强度随时间延长而增强，并在70min左右到达最大，由此表明纳米探针与CA125在70min以内反应完全。因此，后续检测的孵育时间均选用70min。
优化孵育时间后，以其中一组纳米探针混合液为空白样，向其余各组纳米探针混合液中分别加入已知浓度的CA125溶液，再置于室温下孵育100min。在478nm激光器下测定各组混合液的上转换荧光强度，得到的上转换荧光光谱图见图7中(A)所示；并以空白样的荧光强度为F0，加入CA125溶液后的各组混合液的荧光强度为F，以
Figure BDA0002745856460000151
为纵坐标，CA125溶液浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线结果如图7中(B)所示。
图7表明本发明方法建立的检测方法能够对0.02-100U/mL的浓度范围内的CA125有所响应，且CA125的浓度越大，荧光强度也越高。图7中(A)表明在0.02-100U/mL浓度范围内，上转换探针的荧光恢复程度与CA125浓度的对数呈现良好的线性关系，其线性方程为：(F–F0)/F＝1.74lg[CA125]+3.18(R2＝0.998)，检测限可达0.017U/mL。图7结果表明，本发明基于水溶性上转换荧光纳米颗粒荧光供体与有机染料AFM荧光受体所建立的检测方法可以实现对血清中CA125的高灵敏检测。
实施例6探针选择性测试
为排除纳米探针自身上转换荧光强度改变对检测结果的干扰，本实施例考察了纳米探针的热稳定性。本实施例选择在不加任何目标物待测物的情况下，将制备好的探针置于HEPES缓冲溶液(10mM，pH＝7.4)中进行孵育。在478nm激光器下测定纳米探针不同孵育时间时的上转换荧光强度，结果如图8中(A)所示。图中结果表面：纳米探针的上转换荧光强度在100min内基本不变，可进一步表明纳米探针的上转换荧光强度增强源于FAM-Apt-UCNPs与CA125的特异性识别反应。
抗干扰性能是衡量上转换探针的实用性的重要指标之一。为了考察本发明所制备的上转换探针对CA125的特异性识别性能，本实施例选取了(BSA)，甘氨酸(Gly)，组氨酸(His)，谷胱甘肽(GSH)，免疫球蛋白G(IgG)，人表皮蛋白4(HE4)，半胱氨酸(Cys)，癌胚抗原(CEA)，甲胎蛋白(AFP)等作为干扰项进行选择性实验。在实施例4制备的0.05mg/mL纳米探针溶液中，分别加入等量的牛血清蛋白(BSA)，甘氨酸(Gly)，组氨酸(His)，谷胱甘肽(GSH)，免疫球蛋白G(IgG)，人表皮蛋白4(HE4)，半胱氨酸(Cys)，癌胚抗原(CEA)，甲胎蛋白(AFP)，CA19-9和CA125，并于37℃孵育70min后测量其上转换荧光强度。每组混合液平行测定3次。结果如图8中(B)所示，从图中结果可知，仅CA125能引起纳米探针上转换荧光强度的显著增强，而其他干扰物加入前后上转换探针的荧光强度值无明显变化。由此表明本发明制得的纳米探针对CA125具有较高的选择性识别性能，能够用于血清中CA125的特异性检测并满足复杂生物样品中CA125的定量检测需求，有望用于临床上卵巢恶性肿瘤的早期诊断。
实施例7正常人血清中CA125检测
基于探针在缓冲溶液中优异的检测性能，将其应用于复杂生物样品中CA125分析。将正常人血清用HEPES缓冲稀释100倍后，取相同体积加至2mL离心管中，加入纳米探针(终浓度均为0.05mg mL-1)及不同浓度的CA125溶液，37℃孵育70min后，测量混合液的上转换荧光强度，每组混合液平行检测3次。
如图9中(A)所示，随着抗原浓度的增加，上转换荧光强度逐渐增强。图9中(B)表明在0.02-100U/mL的浓度范围内，纳米探针的上转换荧光强度与CA125的浓度对数具有线性关系，其线性方程为：(F–F0)/F＝1.73lg[CA125]+3.17(R2＝0.998)，其与标准溶液中CA125的检测结果相似，由此表明本发明制得的纳米探针能够适用于人血清样品中CA125的分析检测。
实施例8病人血清中CA125检测
向实施例4制得的纳米探针的HEPES溶液中加入稀释100倍后的病人血清，37℃孵育70min后，测量混合液的上转换荧光强度。加标回收试验中，向纳米探针的HEPES溶液中，同时加入稀释100倍的病人血清及CA125标准溶液，37℃孵育70min后，测量其上转换荧光，每组平行检测3次。
利用血清中纳米探针的上转换荧光强度和CA125浓度间的线性关系曲线，可计算出四位卵巢癌患者血清稀释100倍后CA125浓度分别为1.51U/mL，1.58U/mL，2.50U/mL(即稀释前血清中浓度为151U/mL，158U/mL，250U/mL)，其检测结果与临床检测结果相近(表1)。
通过加标回收实验进一步验证检测结果的准确性，回收率为101％～102％，相对标准偏差为3.5％～5.0％，由此表明本发明基于可被近红外光激发的UCNPs能量供体、有机染料FAM能量受体，基于FRET原理构建的上转换荧光系统可用于CA125的高灵敏度、高准确性检测。且三位患者血清中CA125含量均大于临界浓度35U/mL，与卵巢癌患者血清中CA125的浓度水平相符，因此可为卵巢癌早期诊断提供重要诊断依据。结果如下表所示。
表1 FAM-Apt-UCNPs探针用于卵巢癌患者血清中CA125分析的结果
Figure BDA0002745856460000171
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (73)

1.一种上转换荧光纳米探针在检测待测目标物CA125中的应用，其特征在于，所述纳米探针其包括UCNPs、有机染料FAM以及发卡型DNA；UCNPs与FAM分别连接于发卡型DNA的两端，满足FRET发生的距离要求；所述UCNPs指镧系元素掺杂的上转换荧光纳米颗粒，UCNPs的发射光谱与FAM的吸收光谱相匹配；
所述UCNPs为水溶性镧系元素掺杂的上转换荧光纳米颗粒，以化学式NaYF4:Ln3+表示，其中Ln选自稀土元素La、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu中的一种、两种或更多种；
所述水溶性镧系元素掺杂的上转换荧光纳米颗粒的表面带有羧酸基团；
所述发卡型DNA具有与待测目标物CA125的适配体Apt、以及与UCNPs表面的羧基相反应的-NH2；
所述适配体Apt的序列为CTCACTATAGGGAGACAAGAATAAACGCTCAA；
所述发卡型DNA的序列为AACAACCTCACTATAGGGAGACAAGAATAAACGCTCAAAGGTTG-NH2；
其中，UCNPs为FRET过程的能量供体，FAM为FRET过程的能量受体；
所述应用是用于非疾病诊断治疗的。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述UCNPs选自NaYF4: Yb3 +:Tm3 +或NaYF4:Er3+,Yb3+。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述UCNPs选自平均粒径7~200 nm的纳米颗粒。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述UCNPs选自平均粒径10~80nm的纳米颗粒。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述羧酸基团通过PAA（聚丙烯酸）、己二酸、柠檬酸、3-巯基丙酸对表面无配体修饰的UCNPs进行包覆引入。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述水溶性镧系元素掺杂的上转换荧光纳米颗粒为PAA-UCNPs。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述水溶性镧系元素掺杂的上转换荧光纳米颗粒为PAA-NaYF4: Yb3 +:Tm3 +。
8.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述上转换荧光纳米探针以FAM-发卡型DNA-UCNPs表示，其通过UCNPs表面的羧基与FAM-发卡型DNA中DNA末端-NH2之间的酰胺化反应制备得到。
9.如权利要求1-7任一项所述的应用，其特征在于，所述上转换荧光纳米探针和UCNPs的上转换荧光强度的峰值在470-485nm处。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述上转换荧光纳米探针和UCNPs的上转换荧光强度的峰值在475-483nm。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述上转换荧光纳米探针和UCNPs的上转换荧光强度的峰值为478nm。
12.如权利要求1-7任一项所述的应用，其特征在于，所述有机染料FAM的吸收峰与UCNPs的发射峰相匹配，在470-495nm处。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述有机染料FAM的吸收峰与UCNPs的发射峰相匹配，在475-490nm。
14.如权利要求13所述的应用，其特征在于，所述有机染料FAM的吸收峰与UCNPs的发射峰相匹配为488nm。
15.如权利要求1-7任一项所述的应用，其特征在于，所述上转换荧光纳米探针的制备方法，包括如下步骤：在交联剂存在下，将FAM-发卡型DNA与UCNPs共价偶联，制备得到所述上转换荧光纳米探针。
16.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述交联剂包括EDC·HCl和Sulfo-NHS。
17.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述UCNPs的制备过程包括：将表面无配体修饰的UCNPs纳米颗粒与有机酸反应，得到表面带有羧酸基团的UCNPs。
18.如权利要求17所述的应用，其特征在于，所述有机酸为聚丙烯酸、己二酸、柠檬酸或3-巯基丙酸。
19.如权利要求17所述的应用，其特征在于，UCNPs与有机酸的用量比为1mg：(0.1~5)nmol。
20.如权利要求19所述的应用，其特征在于，UCNPs与有机酸的用量比为1mg：(0.1~1)nmol。
21.如权利要求17所述的应用，其特征在于，所述表面无配体修饰的UCNPs纳米颗粒通过酸洗表面带有油酸和/或油胺的UCNPs纳米颗粒制备得到。
22.如权利要求21所述的应用，其特征在于，所述酸洗处理具体包括如下步骤：
a）配制pH在0.5~1.5之间的乙醇酸溶液；
b）将表面带有油酸和/或油胺的UCNPs纳米颗粒溶解于步骤a）所述乙醇酸溶液中，超声、洗涤后，得到表面无配体修饰的UCNPs纳米颗粒。
23.如权利要求22所述的应用，其特征在于，所述表面带有油酸和/或油胺UCNPs纳米颗粒在乙醇酸溶液中的浓度为1~3 mg/mL，所述超声的时间为1~4h，所述洗涤依次用乙醇和去离子水洗涤数次。
24.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述共价偶联的温度为30~50℃。
25.如权利要求24所述的应用，其特征在于，所述共价偶联的温度为35~40℃。
26.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述共价偶联的时间为1~24h。
27.如权利要求26所述的应用，其特征在于，所述共价偶联的时间为4~18h。
28.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述上转换荧光纳米探针的制备方法还包括在共价偶联之前，需要先活化UCNPs表面的羧基。
29.如权利要求28所述的应用，其特征在于，活化方法包括：通过先将表面带有羧基的UCNPs、EDC·HCl和Sulfo-NHS依次溶于MES缓冲溶液中振摇，以活化UCNPs表面的羧基。
30.如权利要求29所述的应用，其特征在于，所述表面带有羧基的UCNPs、EDC·HCl和Sulfo-NHS的用量比为1mg：(0.1-0.8)mg：(0.2-2)mg。
31.如权利要求30所述的应用，其特征在于，所述表面带有羧基的UCNPs、EDC·HCl和Sulfo-NHS的用量比为1mg：(0.1-0.5)mg：(0.5-1)mg。
32.如权利要求29所述的应用，其特征在于，所述活化的温度为30~50℃。
33.如权利要求32所述的应用，其特征在于，所述活化的温度为35~40℃。
34.如权利要求29所述的应用，其特征在于，所述活化的时间为0.5~2h。
35.如权利要求34所述的应用，其特征在于，所述活化的时间为0.5~1h。
36.如权利要求28所述的应用，其特征在于，所述纳荧光米探针的制备方法还包括对表面羧基活化后的UCNPs进行固液分离得到反应产物的过程。
37.如权利要求28所述的应用，其特征在于，表面的羧基活化后的UCNPs以固体形式加入FAM-发卡型DNA的缓冲溶液中。
38.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述UCNPs与FAM-发卡型DNA的用量比为1mg：(0.1-2) nmol。
39.如权利要求38所述的应用，其特征在于，所述UCNPs与FAM-发卡型DNA的用量比为1mg：(0.5-1) nmol。
40.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述上转换荧光纳米探针的制备方法还包括待反应结束后，加入封闭剂封闭剩余的Sulfo-NHS。
41.如权利要求40所述的应用，其特征在于，通过将Tris-HCl添加到混合物中封闭剩余的Sulfo-NHS。
42.如权利要求41所述的应用，其特征在于，所述Tris-HCl与Sulfo-NHS的用量比为10mg: (0.2-2)mg。
43.如权利要求42所述的应用，其特征在于，所述Tris-HCl与Sulfo-NHS的用量比为10mg: (0.5-1)mg。
44.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述上转换荧光纳米探针的制备方法还包括待反应结束后，对反应体系进行固液分离得到反应产物的过程。
45.如权利要求44所述的应用，其特征在于，所述制备方法还包括对固液分离得到的反应产物进行洗涤。
46.如权利要求45所述的应用，其特征在于，采用能够溶解所述FAM-发卡型DNA-UCNPs的溶剂对反应产物进行洗涤。
47.如权利要求46所述的应用，其特征在于，所述溶剂为水。
48.如权利要求46所述的应用，其特征在于，所述洗涤的次数为一次、两次或更多次。
49.如权利要求16-48任一项所述的应用，其特征在于，所述上转换荧光纳米探针的制备方法，包括如下步骤：
将100 μL 10 mg/mLPAA-UCNPs、0.2 mg EDC·HCl和0.6 mg Sulfo-NHS依次加入到700μL10 mmol/L，pH 5.5MES缓冲溶液中，37 °C摇动1小时以活化PAA-UCNPs表面的羧基；离心收集活化的纳米颗粒，分散于含有1nmol FAM-发卡型DNA的1 mL 10 mmol/L，pH 7.4 HEPES缓冲溶液中，37 oC孵育12 h后，将10mg Tris-HCl添加到混合物中封闭剩余的Sulfo-NHS；离心收集沉淀，并用水洗涤3次，最后将得到的上转换荧光纳米探针FAM-发卡型DNA-UCNPs分散于1 mL 10 mmol/L，pH 7.4 HEPES缓冲溶液中，4℃保存。
50.如权利要求1-49任一项所述上转换荧光纳米探针检测CA125的方法，其特征在于，该方法包括将待测目标物CA125与所述上转换荧光纳米探针混合；
所述方法是用于非疾病诊断治疗的。
51.如权利要求50所述的检测方法，其特征在于，所述待测目标物选自离体血清或全血中的CA125。
52.如权利要求50所述的检测方法，其特征在于，该方法还包括含有待测目标物的待测试样品与上转换荧光纳米探针混合后，测定混合液的发光强度，计算待测目标物的浓度。
53.如权利要求52所述的检测方法，其特征在于，所述待测目标物的浓度通过代入待测目标物的浓度依赖型标准曲线计算得到。
54.如权利要求50所述的检测方法，其特征在于，所述方法还包括配制不同浓度的纳米探针水溶液和待测目标物溶液。
55.如权利要求50-54任一项所述的检测方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
1）将水溶性镧系元素掺杂的上转换荧光纳米颗粒UCNPs分散于水溶液中，得到不同浓度的纳米材料水溶液；
2）合成FAM-发卡型DNA；
3）制备纳米探针: 将纳米材料水溶液和FAM-发卡型DNA溶液按不同体积比混合后，孵育，得到纳米探针，测定各混合液的发光强度，并且计算出发光猝灭效率，得到荧光猝灭效率最大的混合液中所对应的纳米材料水溶液浓度和FAM-发卡型DNA的浓度值；
4）配制不同浓度的待测目标物溶液；
5）绘制待测目标物的浓度依赖型标准曲线；
6）检测待测目标物的浓度。
56.如权利要求55所述的检测方法，其特征在于，步骤4）中为配制不同浓度的CA125溶液。
57.如权利要求55所述的检测方法，其特征在于，步骤5）中，所述待测目标物的浓度依赖型标准曲线绘制具体步骤如下：取荧光猝灭效率最大时对应浓度的纳米材料水溶液和FAM-发卡型DNA溶液的混合液，以其中一组混合液为空白样，向其余各组混合液中分别加入已知浓度的待测目标物溶液混合，孵育，测定混合液的发光强度，空白样的荧光强度为
Figure DEST_PATH_IMAGE002
，加入待测目标物溶液后的各组混合液的荧光强度为
Figure DEST_PATH_IMAGE004
，以
Figure DEST_PATH_IMAGE006
为纵坐标，待测目标物溶液浓度的对数为横坐标，做出待测目标物的浓度依赖型标准曲线。
58.如权利要求55所述的检测方法，其特征在于，步骤6）中，所述待测目标物的浓度具体通过以下步骤测得：取荧光猝灭效率最大时对应浓度的纳米材料水溶液和FAM-发卡型DNA溶液的混合液和未知浓度的待测目标物溶液混合，孵育，测定混合液的发光强度，代入步骤5）绘制的待测目标物的浓度依赖型标准曲线，得出待测目标物的浓度。
59.如权利要求55所述的检测方法，其特征在于，步骤4）中所述待测目标物溶液由待测目标物与缓冲溶液混合得到。
60.如权利要求59所述的检测方法，其特征在于，所述缓冲溶液选自pH值为7~11的缓冲溶液。
61.如权利要求60所述的检测方法，其特征在于，所述缓冲溶液选自HEPES水溶液、MES缓冲溶液、Tris-HCl缓冲液、NaOH-H3BO3缓冲液、NaCO3-NaHCO3缓冲液、磷酸盐缓冲液。
62.如权利要求61所述的检测方法，其特征在于，所述缓冲溶液选自HEPES水溶液10mmol/ L，pH 7.4，NaCl，0.15mol/L。
63.如权利要求56所述的检测方法，其特征在于，所述CA125溶液由CA125与HEPES水溶液混合得到；所述CA125的浓度大于0且小于等于100U/mL。
64.如权利要求55所述的检测方法，其特征在于，步骤5）中所述孵育的温度选自30~50℃。
65.如权利要求64所述的检测方法，其特征在于，所述孵育的温度选自35~40℃。
66.如权利要求55所述的检测方法，其特征在于，所述孵育的时间选自5~90min。
67.如权利要求66所述的检测方法，其特征在于，所述孵育的时间选自60~90min。
68.如权利要求55所述的检测方法，其特征在于，步骤5）、6）中所述混合液的发光强度的测定在荧光分光光度计中进行。
69.如权利要求50-68任一项所述检测方法的用途，其用于CA125肿瘤标志物的检测；所述应用是用于非疾病诊断治疗的。
70.如权利要求69所述的应用，其特征在于，所述检测方法用于血清或全血样品中的CA125肿瘤标志物的检测。
71.一种试剂盒，其包含权利要求1-49任一项所述上转换荧光纳米探针。
72.一种生物传感器，其包含权利要求1-49任一项所述上转换荧光纳米探针。
73.权利要求71所述试剂盒和/或权利要求72所述生物传感器在检测CA125肿瘤标志物中的用途；所述应用是用于非疾病诊断治疗的。
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