CN109852383B - 基于富勒烯的快速高效响应谷胱甘肽的荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于富勒烯的快速高效响应谷胱甘肽的荧光探针及其制备方法和应用。该荧光探针是基于富勒烯量子点和二氧化锰纳米片的复合物，通过静电吸附和配位的作用形成具有谷胱甘肽响应的荧光探针，表达成FQD‑MnO2，富勒烯量子点结构式为C60(OH)x(NH2)yOz。该荧光探针合成简单，荧光稳定不易淬灭，并且能够与谷胱甘肽(GSH)快速反应，可用于定量检测溶液及细胞内的GSH含量。在GSH存在的条件下，二氧化锰纳米片快速还原成锰离子，同时恢复FQD的荧光。通过建立GSH浓度与FQD荧光恢复强度的线性关系，可以定量检测溶液和细胞内谷胱甘肽的浓度。本发明可以高效快速检测GSH含量，灵敏度高，测量浓度范围广。
Description
技术领域
本发明属于分析化学中的蛋白检测技术领域，具体涉及基于富勒烯的快速高效响应谷胱甘肽的荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
C60分子是由五元环和六元环组成的封闭球体，具有高度对称的结构，因此具有独特的理化性质，成为研究的焦点。因其安全高效，C60作为载体和光敏剂渐渐应用在生物医学领域。尽管C60分子在水中不溶，很多研究者通过对富勒烯的表面进行基团修饰能够很好解决水溶性问题。C60分子因其高度对称几乎没有荧光，最近也有研究表明通过氧化可以打破富勒烯的高度对称结构，产生荧光。富勒烯类荧光物质具有高度生物相容性，可以用于活体成像和生物检测。
二氧化锰纳米片是一种半导体材料，且有很大的表面积，常被作为载体承载光敏剂和药物用于生物诊断，成像以及治疗。二氧化锰还可以和谷胱甘肽反应，可控性地释放药物和光敏剂。
谷胱甘肽是生物体内重要的小分子肽，由半胱氨酸，谷氨酸和甘氨酸组成。它在生物体内主要充当解毒剂和抗氧化剂，维持整个机体正常的免疫系统。谷胱甘肽在正常浓度下可以发挥极其重要的生理应用，例如清除自由基，保护组织细胞。但是异常的谷胱甘肽浓度预示着局部微环境的改变，与一些重大疾病有关，比如肿瘤。因此，精准快速高效检测谷胱甘肽是非常重要的。传统的谷胱甘肽浓度检测例如酶法，色谱法虽然可以检测谷胱甘肽浓度，但都存在很多不足，如酶法需要特定的反应条件和较长的反应时间；色谱法需要昂贵仪器，对操作者要求较高，并且灵敏度和检测范围都有限。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于富勒烯的快速高效响应谷胱甘肽的荧光探针及其制备方法和应用，属于简便快速检测谷胱甘肽的荧光分析法。
为实现上述目的，本发明提供了一种基于富勒烯的快速高效响应谷胱甘肽的荧光探针，表达为FQD-MnO2；其中，FQD为富勒烯量子点，结构式为C60(OH)x(NH2)yOz，x＝13,y＝7,z＝15。
优选本发明所述富勒烯量子点粒径小于10nm。进一步优选富勒烯量子点激发波长范围是350-500nm，富勒烯量子点荧光发射光谱是激发波长依赖型的发射光谱，其最大发射峰的范围为450-550nm。
进一步的，上述富勒烯量子点是通过以下方式制备得到的：在C60粉末中加入过氧化氢和氨水，50-80℃敞口搅拌10-14h，离心后取上清液加入上清液5-7倍体积量的乙醇，静置1-4小时，沉淀，离心后，采用乙醇和水交替洗涤沉淀3次，洗涤完成后将沉淀置于40-60℃条件下真空干燥，得到富勒烯量子点。其中，每10mg的C60加入1～10ml的过氧化氢和氨水混合液，其中过氧化氢与氨水的质量浓度分别是30％和28％，体积比为5:2。
上述制备方法优选的工艺为：在C60粉末中加入过氧化氢和氨水，60℃敞口搅拌12h，离心后取上清液加入上清液7倍体积量的乙醇，静置2小时沉淀，离心后，采用乙醇和水交替洗涤沉淀3次，洗涤完成后将沉淀放在60℃真空干燥过夜，得到富勒烯量子点。
本发明所述荧光探针是富勒烯量子点与二氧化锰纳米片通过静电吸附及配位键复合而成。优选富勒烯量子点与二氧化锰纳米片通过静电吸附及配位键复合方法为：向富勒烯量子点水溶液中渐渐加入二氧化锰纳米片水溶液，直到量子点的荧光刚好淬灭接近于0；其中，两溶液混合时，富勒烯量子点和二氧化锰纳米片的质量比是4:1。
上述二氧化锰纳米片是通过以下方式制备得到的：将含3％的过氧化氢的0.6M的四甲基氢氧化铵水溶液，快速加入到0.3M的氯化锰的水溶液中，四甲基氢氧化铵水溶液和氯化锰水溶液的体积比为2:1，敞口快速搅拌过夜，将溶液离心弃去上清，分别用乙醇和水交替洗涤沉淀3次，将洗好的沉淀放在60℃下真空干燥，得到二氧化锰纳米片。
上述基于富勒烯的快速高效响应谷胱甘肽的荧光探针的制备方法，包括富勒烯量子点的合成、二氧化锰纳米片的制备、富勒烯量子点和二氧化锰纳米片的复合。
上述基于富勒烯的快速高效响应谷胱甘肽的荧光探针的制备方法包括以下步骤：
a.富勒烯量子点的合成：在C60粉末中加入过氧化氢和氨水，50-80℃敞口搅拌10-14h，离心后取上清液加入上清液5-7倍体积量的乙醇，静置1-4小时，沉淀，离心后，采用乙醇和水交替洗涤沉淀3次，然后将沉淀置于40-60℃条件下真空干燥，得到富勒烯量子点；
b.二氧化锰纳米片的制备：将含3％的过氧化氢的0.6M的四甲基氢氧化铵水溶液，快速加入0.3M的氯化锰的水溶液中，四甲基氢氧化铵水溶液和氯化锰水溶液的体积比为2:1，敞口快速搅拌过夜，将溶液离心弃去上清，分别用乙醇和水交替洗涤沉淀3次，将洗好的沉淀放在60℃下真空干燥，得到二氧化锰纳米片。
c.富勒烯量子点和纳米二氧化锰的复合：将富勒烯量子点和二氧化锰纳米片分别在水中溶解，向富勒烯量子点水溶液中渐渐加入二氧化锰纳米片水溶液，直到量子点的荧光淬灭趋于0；其中，富勒烯量子点和二氧化锰纳米片的质量比是4:1。
优选上述基于富勒烯的快速高效响应谷胱甘肽的荧光探针的制备方法具体包括以下步骤：
a.富勒烯量子点的合成：在C60粉末中加入过氧化氢和氨水，50-80℃敞口搅拌10-14h，黑色固体溶解，溶液变成黄棕色，将得到的黄棕色溶液离心后，取上清液加入上清液5-7倍体积量的乙醇，沉淀产物，离心后，肉眼可见上清无色，沉淀呈黄棕色，弃去上清，依次加入乙醇和水洗涤沉淀3次，洗涤完成后将沉淀放在60℃真空干燥过夜。得到的黄棕色固体即为富勒烯量子点；
b.二氧化锰纳米片的制备：将含3％的过氧化氢的0.6M的四甲基氢氧化铵水溶液，快速加入到0.3M的氯化锰的水溶液中，敞口快速搅拌过夜，将溶液离心弃去上清，分别用乙醇和水洗涤沉淀3次，将洗好的沉淀放在60℃下真空干燥，得到的黑色固体即为二氧化锰纳米片；
c.富勒烯量子点和纳米二氧化锰的复合：将得到的富勒烯量子点和二氧化锰纳米片固体先各自溶于纯水中，在富勒烯量子点溶液中渐渐加入二氧化锰纳米片溶液，直到富勒烯量子点的荧光淬灭趋于0即得。
上述制备步骤a中,过氧化氢与氨水的质量浓度分别是30％和28％，体积比为5:2，每10mg的C60加入1～10ml的过氧化氢和氨水混合液；所制备的富勒烯量子点粒径小于10nm，激发光谱是350-500nm，荧光发射光谱是激发波长依赖型的，最大发射峰的范围为450-550nm。
上述制备步骤b中，四甲基氢氧化铵水溶液和氯化锰水溶液的体积比为2:1；所制得的二氧化锰为纳米尺寸片状结构。
上述制备过程c中，FQD-MnO2的荧光接近于0。
上述基于富勒烯的快速高效响应谷胱甘肽的荧光探针在谷胱甘肽检测和肿瘤区域可视化检测试剂中的应用，优选适用于溶液和细胞内的谷胱甘肽检测试剂中。
与现有技术比较，本发明的有益效果是：
(1)本发明首次制备了富勒烯量子点，与现有的其他探针相比，富勒烯量子点可以激发多波长的荧光。将C60与过氧化氢和氨水反应，一方面增加了C60的亲水能力，氨基的引入有助于使整个结构带上正电荷，有助于被细胞摄取，进行细胞内的检测。另一方面，富勒烯因此也带有很强的荧光，激发波长范围为350-500nm，相应的最大发射峰范围为450-550nm。
(2)本发明制备富勒烯量子点的工艺比起现有的其他碳基量子点制备工艺条件温和，现有的碳基量子点合成温度均需在100°以上，本发明所需温度大大降低，且所制备的富勒烯量子点在中高温条件下不被破坏，在日光及各种光照条件下能够保持荧光稳定，不发生淬灭。
(3)本发明特定的富勒烯量子点和二氧化锰纳米片的复合配比极大地提高了谷胱甘肽的响应性。二氧化锰能够使量子点荧光几乎完全淬灭。在含有GSH的体系中，二氧化锰与GSH发生氧化还原反应而分解，富勒烯量子点荧光逐渐恢复，且与GSH的浓度在0-1mM范围内呈线性相关。量子点的荧光从几乎完全没有到几乎完全恢复的这一效果，明显提高灵敏度和可视化检测的信噪比。
(4)本发明将富勒烯量子点和二氧化锰纳米片简单混合即得GSH响应型荧光探针，无需复杂的制备及纯化过程，操作简单高效。制备得到的GSH响应型荧光探针荧光稳定，可以高效快速的检测出样品内的GSH含量。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例，结合附图对本发明作进一步详细的说明。
图1为本发明的实施例中FQD的荧光光谱图。
图2为本发明的实施例中FQD荧光稳定性研究。
图3为本发明的实施例中MnO2的紫外光谱图和FQD的最佳荧光发射光谱对比图。
图4为本发明的实施例中FQD-MnO2的荧光光谱图。
图5为本发明的实施例中FQD-MnO2的X射线光电子能谱图。
图6为本发明的实施例中FQD-MnO2的透射电镜图。
图7为本发明的实施例中FQD-MnO2响应GSH的荧光光谱图。
图8为本发明的实施例中FQD-MnO2对GSH响应的反应时间研究。
图9为本发明的实施例中FQD-MnO2对GSH响应的特异性研究。
图10为本发明的实施例中FQD-MnO2在肿瘤细胞内的荧光成像图
具体实施方式
以下通过具体实施例结合附图对本发明的制备以及检测进行详细的解释说明：
实施例1
一种基于富勒烯的快速高效响应谷胱甘肽的荧光探针，表达为FQD-MnO2；其中，FQD为富勒烯量子点，结构式为C60(OH)x(NH2)yOz，x＝13,y＝7,z＝15。
本实施例所述富勒烯量子点激发波长范围是350-500nm，富勒烯量子点荧光发射光谱是激发波长依赖型的发射光谱，其最大发射峰的范围为450-550nm，富勒烯量子点粒径小于10nm。
本实施例所述荧光探针是富勒烯量子点与二氧化锰纳米片通过静电吸附及配位键复合而成。该制备方法具体包括以下步骤：
a.富勒烯量子点的合成：在C60粉末中加入质量浓度为30％的过氧化氢和质量浓度为28％的氨水，每10mg的C60加入10ml的过氧化氢和氨水混合液，其中，过氧化氢与氨水体积比为5:2。60℃敞口搅拌12h，黑色固体溶解，溶液变成黄棕色，将得到的黄棕色溶液离心后，取上清液加入上清液7倍体积量的乙醇，静置4小时，沉淀，离心后，肉眼可见上清无色，沉淀呈黄棕色，弃去上清，依次加入乙醇和水洗涤沉淀3次，洗涤完成后将沉淀放在60℃真空干燥过夜，得到的黄棕色固体即为富勒烯量子点；
b.二氧化锰纳米片的制备：将10ml含3％的过氧化氢的0.6M的四甲基氢氧化铵水溶液，快速加入到5ml的0.3M的氯化锰的水溶液中，敞口剧烈搅拌过夜，将溶液离心弃去上清，分别用乙醇和水洗涤沉淀3次，将洗好的沉淀放在60℃下真空干燥，得到的黑色固体即为二氧化锰纳米片；
c.富勒烯量子点和纳米二氧化锰的复合：将得到的富勒烯量子点和二氧化锰纳米片固体先各自溶于纯水中，在富勒烯量子点溶液中渐渐加入二氧化锰纳米片溶液，直到富勒烯量子点的荧光刚好淬灭趋于0即得；其中，富勒烯量子点和二氧化锰纳米片的质量比是4:1。
实施例2
一种基于富勒烯的快速高效响应谷胱甘肽的荧光探针，表达为FQD-MnO2；其中，FQD为富勒烯量子点，结构式为C60(OH)x(NH2)yOz，x＝13,y＝7,z＝15。
本实施例所述富勒烯量子点激发波长范围是350-500nm，富勒烯量子点荧光发射光谱是激发波长依赖型的发射光谱，其最大发射峰的范围为450-550nm，富勒烯量子点粒径小于10nm。
制备方法具体包括以下步骤：
a.富勒烯量子点的合成：在C60粉末中加入质量浓度为30％的过氧化氢和质量浓度为28％的氨水，每10mg的C60加入1ml的过氧化氢和氨水混合液，其中过氧化氢与氨水体积比为5:2。50℃敞口搅拌12h，黑色固体溶解，溶液变成黄棕色，将得到的黄棕色溶液离心后，取上清液加入上清液5倍体积量的乙醇，静置2小时，沉淀，产物离心后，肉眼可见上清无色，沉淀呈黄棕色，弃去上清，依次加入乙醇和水洗涤沉淀3次，洗涤完成后将沉淀放在60℃真空干燥过夜，得到的黄棕色固体即为富勒烯量子点；
b.二氧化锰纳米片的制备：将10ml含3％的过氧化氢的0.6M的四甲基氢氧化铵水溶液，快速加入到5ml的0.3M的氯化锰的水溶液中，敞口剧烈搅拌过夜，将溶液离心弃去上清，分别用乙醇和水交替洗涤沉淀3次，将洗好的沉淀放在60℃下真空干燥，得到的黑色固体即为二氧化锰纳米片；
c.富勒烯量子点和纳米二氧化锰的复合：将得到的富勒烯量子点和二氧化锰纳米片先各自溶于纯水中，在富勒烯量子点溶液中渐渐加入二氧化锰纳米片溶液，直到富勒烯量子点的荧光刚好淬灭接近于0即得；其中，富勒烯量子点和二氧化锰纳米片的质量比是4:1。
下面对上述实施例1制备过程中的产物进行表征：
图1为单一富勒烯量子点的荧光光谱图。富勒烯量子点可以被360nm～500nm的激发光激发，而且发射光谱会因激发波长的变化发生不同程度的位移。这种激发波长依赖型的发射光谱是富勒烯量子点的特征之一。本发明经过筛选，以440nm为激发波长，得到最大发射峰在500nm。
图2为富勒烯量子点在室温日光照射下的荧光强度变化情况。与未照射前相比，照射24h后荧光强度几乎没有变化，稳定保留在99％以上。这表明用该荧光探针检测GSH时无需严格的避光操作，减少由于日光导致的荧光淬灭带来的误差。
图3为实施例1样品中二氧化锰纳米片紫外图谱和富勒烯量子点荧光发射谱。富勒烯量子点在400-600nm范围内都有荧光发射，其最大发射峰在500nm左右。二氧化锰纳米片的紫外吸收较宽泛，在200-600nm内都有吸收。因此基于二氧化锰纳米片紫外吸收光谱可以与量子点的发射光谱大部分重叠，富勒烯量子点的荧光能够被二氧化锰有效地淬灭。
图4为实施例1样品的荧光光谱图。在160μg/mL的富勒烯量子点溶液中加入不同浓度的二氧化锰纳米片溶液，500nm处的荧光值逐渐降低。在二氧化锰浓度为0时，荧光强度最高，当二氧化锰浓度增至16μg/mL时，荧光强度急剧降低，接近于0。这不仅证明了富勒烯量子点和二氧化锰纳米片的成功结合，而且也说明二氧化锰在较低浓度就可以几乎完全淬灭富勒烯量子点的荧光。
图5为实施例1样品的X射线光电子能谱图。根据FQD-MnO2的X射线光电子能谱图显示，该荧光探针的元素构成含有Mn,C,O,N。其中的Mn全来源于二氧化锰纳米片，C、N全来源于富勒烯量子点。再次证明该荧光探针既含有富勒烯量子点，也含有二氧化锰纳米片。
图6为实施例1样品的透射电镜图。FQD-MnO2其结构特征是黑色的片状上有很多聚集黑点。黑色的片状代表二氧化锰纳米片，聚集的小黑点代表富勒烯量子点。小黑点都在片状的二氧化锰上，说明二氧化锰纳米片很大的表面积可以承载很多量子点，实现有效的荧光淬灭。
实施例3
本实施例研究了本发明所述荧光探针测试GSH浓度的方法。
图7为样品的GSH响应的荧光光谱图和线性相关回归线。探针(180μg/mL)与不同浓度的GSH溶液在室温下快速混合，即可观察荧光变化情况。在GSH浓度为0的条件下，FQD-MnO2几乎没有荧光。随着GSH浓度逐渐增加达到1mM，量子点的荧光逐渐恢复。线性回归线和方程式都证明在0-1mM的GSH浓度范围内，量子点的荧光强度与GSH浓度成线性相关，其计算方程式为FL＝0.06285CGSH+13.815(r2＝0.992)。主要机制：在该GSH响应型荧光探针中，二氧化锰纳米片可以通过荧光共振能量转移有效地淬灭富勒烯量子点的荧光。GSH存在时，GSH先与二氧化锰纳米片发生氧化还原反应。二氧化锰被消耗后，量子点渐渐恢复荧光。恢复的荧光强度与GSH浓度呈线性相关。因此该荧光探针可精准检测GSH的浓度。图8为该荧光探针响应GSH的时间曲线。180μg/mL的荧光探针与1mM的GSH在室温条件下混合，在特定时间点检测500nm处的荧光强度。数据显示在前80s,该探针的荧光强度能达到最大值，80s后处于稳定的平台期。这表明FQD-MnO2响应GSH的时间很短，80s内就可以反应完全，明显缩短了检测时间，可以快速高效检测大批量样品。该荧光探针可以在很短时间内快速响应GSH的主要原因是二氧化锰纳米片具有很大的比表面积，增加其与GSH的接触率，能够同时多点反应，缩短了反应时间。
实施例4
为进一步确定本发明所述荧光探针的选择性，测定了在各种氨基酸以及离子的条件下该荧光探针(按实施例1制备)的响应情况。图9为该荧光探针的特异性研究图。该图表明该荧光探针能够对GSH有最高的荧光响应。
实施例5
为了确定本发明所述荧光探针在肿瘤细胞内的可视化检测，通过荧光成像的方法反映肿瘤细胞(Hela)内的GSH含量。图10为该荧光探针(按实施例1制备)在肿瘤细胞内的荧光成像图。FQD-MnO2组：在37℃，5％的CO2的培养条件下，将荧光探针(按实施例1制备)与Hela细胞共孵育2h；FQD-MnO2+BSO组：相同的培养条件下，将荧光探针与预先经过BSO(GSH抑制剂)处理的Hela细胞共孵育2h；FQD-MnO2+NMM组：将荧光探针与预先经过NMM(GSH清除剂)处理的Hela细胞共孵育2h；FQD-MnO2+LPA组：将荧光探针与预先经过LPA(GSH增强剂)处理的Hela细胞共孵育2h。接着使用激光共聚焦对以上细胞进行成像，激发波长为405nm。结果显示该荧光探针可以有效地响应肿瘤细胞内的GSH，并且荧光强度与肿瘤细胞内的GSH含量呈正相关。
由上述实施例可知，上述实施例制备的FQD-MnO2荧光探针，制备方法简单，基于富勒烯的快速高效响应谷胱甘肽的荧光探针能够高效快速识别GSH，定量检测GSH浓度，且该探针荧光稳定，检测条件简单易操作，具有很大的应用价值。
Claims (5)
1.一种基于富勒烯的快速高效响应谷胱甘肽的荧光探针，其特征在于该荧光探针表达为FQD-MnO2；其中，FQD为富勒烯量子点，结构式为C60(OH)x (NH2)y Oz， x=13， y=7， z=15，所述富勒烯量子点粒径小于10 nm；所述荧光探针是富勒烯量子点与二氧化锰纳米片通过静电吸附及配位键复合而成；
富勒烯量子点与二氧化锰纳米片通过静电吸附及配位键复合方法为：向富勒烯量子点水溶液中渐渐加入二氧化锰纳米片水溶液，直到量子点的荧光刚好淬灭接近于0；其中，富勒烯量子点和二氧化锰纳米片的质量比是4:1；所述的二氧化锰纳米片是通过以下方式制备得到的：将含3%的过氧化氢的0.6M的四甲基氢氧化铵水溶液，快速加入0.3M的氯化锰的水溶液中，四甲基氢氧化铵水溶液和氯化锰水溶液的体积比为2:1，敞口快速搅拌过夜，将溶液离心弃去上清，分别用乙醇和水交替洗涤沉淀3次，将洗好的沉淀放在 60℃下真空干燥，得到二氧化锰纳米片；
所述的富勒烯量子点是通过以下方式制备得到的：在C60粉末中加入过氧化氢和氨水，50-80℃敞口搅拌10-14h，离心后取上清液加入上清液5-7倍体积量的乙醇，静置1-4小时，沉淀，离心后，采用乙醇和水交替洗涤沉淀3次，然后将沉淀置于40-60℃条件下真空干燥，得到富勒烯量子点。
2.根据权利要求1所述的基于富勒烯的快速高效响应谷胱甘肽的荧光探针，其特征在于将每10mg的C60加入1~10 ml的过氧化氢和氨水混合液，其中过氧化氢与氨水的质量浓度分别是30%和28%，体积比为5:2。
3.一种权利要求1所述的基于富勒烯的快速高效响应谷胱甘肽的荧光探针的制备方法，其特征在于该方法包括富勒烯量子点的合成、二氧化锰纳米片的制备、富勒烯量子点和二氧化锰纳米片的复合。
4.根据权利要求3所述的基于富勒烯的快速高效响应谷胱甘肽的荧光探针的制备方法，其特征在于该方法具体包括以下步骤：
a.富勒烯量子点的合成：在C60粉末中加入过氧化氢和氨水，50-80℃敞口搅拌10-14h，离心后取上清液加入上清液5-7倍体积量的乙醇，静置1-4小时沉淀，离心后，采用乙醇和水交替洗涤沉淀3次，洗涤完成后将沉淀放在40-60℃真空干燥过夜，得到富勒烯量子点；
b.二氧化锰纳米片的制备：将含3%的过氧化氢的0.6M的四甲基氢氧化铵水溶液，快速加入到0.3M的氯化锰的水溶液中，敞口剧烈搅拌过夜，将溶液离心弃去上清，分别用乙醇和水交替洗涤沉淀3次，将洗好的沉淀放在 60℃下真空干燥，得到二氧化锰纳米片；
c.富勒烯量子点和二氧化锰纳米片的复合：将得到的富勒烯量子点和二氧化锰纳米片先各自溶于水中，在富勒烯量子点溶液中渐渐加入二氧化锰纳米片溶液，直到量子点的荧光淬灭趋于0；其中，富勒烯量子点和二氧化锰纳米片的质量比是4:1。
5.权利要求1所述的基于富勒烯的快速高效响应谷胱甘肽的荧光探针在谷胱甘肽检测和在制备肿瘤区域可视化检测试剂中的应用。
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