CN110982521B - 石墨相氮化碳量子点复合物及其合成方法和生物应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及石墨相氮化碳量子点复合物及其合成方法和生物应用，通过CNQDs掺杂S,O元素，形成S‑H和‑COOH官能团，增强了S,O‑CNQDs与二氧化锰结合的能力和亲水性。利用原位吸附法将硫氧共掺杂石墨相氮化碳量子点（S,O‑CNQDs）吸附在二氧化锰纳米片层上得到纳米复合物，纳米复合物形成后S,O‑CNQDs的荧光完全猝灭，利用谷胱甘肽（GSH）与MnO2之间的还原反应引起二氧化锰纳米片层的消解并导致掺杂石墨相氮化碳量子点的释放及其荧光的恢复。该荧光探针具有光学性质稳定，毒性低，生物相容性好等优点，在分析领域和细胞成像中具有广阔的应用前景。

Description

石墨相氮化碳量子点复合物及其合成方法和生物应用
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种基于二氧化锰-硫氧共掺杂石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs）荧光探针、其合成方法以及检测还原型谷胱甘肽和细胞成像的应用。
背景技术
谷胱甘肽（GSH）由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成，是哺乳动物、一些细菌和真核细胞中含量最丰富的硫代三肽。谷胱甘肽是一种重要的内源性抗氧化剂，可防止活性氧（如自由基和重金属）对细胞中重要成分的损伤。据报道，人体内谷胱甘肽水平与多种疾病有关，如癌症、肝损伤、艾滋病、衰老和糖尿病。
目前已有多种检测GSH的方法，包括高效液相色谱（HPLC）、电化学、电致化学发光、表面增强拉曼散射（SERS）和质谱。与其它技术相比，荧光光谱法有灵敏度高、简单、快速、成本低等优点。
目前为止，已经报道了一些用荧光光谱法检测GSH的荧光探针，如有机染料、稀土上转换发光材料、量子点和碳纳米材料等。其中有机染料由于其激发波长范围较窄，发射范围广，光稳定性差而受到限制；稀土上转换发光材料合成复杂，离子浓度掺杂不当会引起上转换效率降低；而量子点和碳纳米材料合成简单，毒性低，绿色环保，光学性质稳定，作为荧光探针受到了越来越多的关注。石墨化氮化碳量子点是一种无金属高分子新型半导体碳纳米材料，具有量子产率高、成本低、水溶性好、光致发光性能好、化学稳定性好、生物相容性好等优点。近年来，石墨化氮化碳量子点在传感、成像和光动力治疗等方面有了越来越多的应用，因此受到广泛的关注，如何提高检测方法的灵敏性、选择性等是目前需要进一步解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs）及其合成方法，基于所述MnO2-S,O-CNQDs复合物的荧光探针，用于检测GSH含量和细胞成像，能够进一步提高荧光探针的灵敏性和选择性。
为解决以上技术问题，根据本发明的一个方面，提供一种石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs），是由硫氧共掺杂石墨相氮化碳量子点（S,O-CNQDs）吸附在二氧化锰纳米片层上获得。
优选地，所述的S,O-CNQDs平均粒径为1～5nm，可进一步提高其与二氧化锰的结合能力。
根据本发明的另一方面，提供一种石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs）的合成方法，包括：
步骤一：称取乙二胺四乙酸二钠和硫脲置于研钵中研磨均匀，将获得的粉末转移到坩埚中，放入烘箱中反应；
步骤二：步骤一反应后的产物经无水乙醇洗涤后溶于超纯水中，得到溶液；
步骤三：将步骤二获得的溶液离心取上清液，过滤，透析，得到纯化的S,O-CNQDs溶液；
步骤四：将纯化的S,O-CNQDs溶液滴加到2-(N-吗啉)乙磺酸（MES）缓冲溶液的离心管中；
步骤五：将高锰酸钾溶液滴加到上述离心管中，用超纯水定容获得反应混合液；
步骤六：将步骤五获得的反应混合液超声直至形成棕色胶体溶液，然后经过离心，洗涤，冷冻干燥后得到固体粉末即为二氧化锰-硫氧共掺杂的石墨相氮化碳量子点（MnO2-S,O-CNQDs）复合物。
优选地，步骤一中，乙二胺四乙酸二钠和硫脲按质量比1:2.45研磨均匀。
优选地，步骤四中，所述的S,O-CNQDs溶液的浓度为0.1-4mg/mL。
优选地，步骤五中，所述的高锰酸钾水溶液的浓度为0.1-18mM。
优选地，步骤六中，所述的超声时间为5-50分钟。
本发明的另一方面要求保护所述的石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs）在检测谷胱甘肽含量和细胞成像中的应用。
基于本发明所述的石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs），提供一种检测谷胱甘肽的含量的方法，包括如下步骤：
步骤一：将石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs）用作检测液，并将其和一定浓度梯度的谷胱甘肽标准溶液混合，测定加入GSH前检测液的荧光强度F0以及不同GSH浓度下检测体系的荧光强度F，计算相对荧光强度F/F0，然后以GSH标准溶液的浓度为横坐标，相对荧光强度F/F0为纵坐标，确定标准液中谷胱甘肽浓度和相对荧光强度的关系；
步骤二：将检测液和未知浓度的谷胱甘肽待测样品混合，记录荧光强度值；
步骤三：计算待测样品中谷胱甘肽的含量。
S,O-CNQDs和二氧化锰纳米片的复合极大地提高了谷胱甘肽的响应性。二氧化锰能够使S,O-CNQDs荧光几乎完全猝灭。在GSH存在下，二氧化锰和GSH发生氧化还原反应，S,O-CNQDs荧光逐渐恢复，GSH浓度在10-270 μM范围内，F0/F与GSH浓度之间呈现良好的线性关系，检出限（LOD）为0.307 μM，通过平行测定11次二氧化锰-硫氧共掺杂石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs）的荧光强度计算得到的相对标准偏差（RSD）为4.20%，说明该方法重现性良好，该荧光探针具有高的灵敏性和好的选择性，线性响应范围宽的优点。
本发明所述复合物具有低毒性和良好的光稳定性，应用于细胞成像，可实现荧光“开启”。基于本发明所述的石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs），提供一种细胞成像方法，包括如下步骤：
步骤一：采用MTT法测定所述的石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs）的细胞毒性；HepG2细胞接种于96孔板中，置于孵箱中孵育，分别以不同浓度的石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs）孵育细胞；
步骤二：PBS洗涤后，每孔加入MTT孵育细胞；
步骤三：加二甲亚砜(DMSO)溶解每孔形成的甲瓒晶体；
步骤四：摇匀后，用酶标仪测定吸光度；
步骤五：细胞成像；HepG2细胞接种于激光共聚焦培养皿中置于孵箱中孵育；
步骤六：用N-乙基马来酰亚胺（NEM）预处理清除细胞内的GSH，之后，以石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs）孵育的细胞作为对照，然后用PBS洗涤。
步骤七：以步骤六中石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs）的浓度孵育细胞作为实验组，然后用PBS洗涤。
步骤八：细胞用多聚甲醛固定，最后，在激光共聚焦扫描显微镜下记录荧光成像图像。
本发明公开了一种二氧化锰-硫氧共掺杂的石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs），通过CNQDs掺杂S, O元素，形成S-H和-COOH官能团，增强了S,O-CNQDs与二氧化锰结合的能力和亲水性。利用原位吸附法将S,O-CNQDs吸附在二氧化锰纳米片层上得到纳米复合物，纳米复合物形成后S,O-CNQDs的荧光完全猝灭，利用谷胱甘肽（GSH）与MnO2之间的还原反应引起二氧化锰纳米片层的消解并导致S,O-CNQDs的释放及其荧光的恢复。该荧光探针具有光学性质稳定，毒性低，生物相容性好等优点，已成功应用于检测GSH和细胞成像分析方面。该荧光探针在分析领域和细胞成像中具有广阔的应用前景。
此外，本发明S,O-CNQDs制备所用原料绿色环保，合成过程简单，无需复杂的元素掺杂和过多的提纯处理，不仅简化了S,O-CNQDs的工艺步骤，提高了S,O-CNQDs的产率，使其产率达到46.2%，而且节约了资源，降低了成本，可实现大批量生产。
附图说明
图1为常见离子（a）、氨基酸和糖类（b）对二氧化锰-硫氧共掺杂石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs）检测GSH的影响。
图2 (a)、(b) 、(c)分别为MnO2纳米片、S,O-CNQDs和二氧化锰-硫氧共掺杂石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs）复合材料的TEM图。
图3为S,O-CNQDs、MnO2纳米片和二氧化锰-硫氧共掺杂石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs）复合物的FT-IR图（a）和XRD图（b）。
图4为S,O-CNQDs和二氧化锰-硫氧共掺杂石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs）的XPS图，及MnO2-S,O-CNQDs复合物的XPS精细谱图。
图5为不同浓度GSH对二氧化锰-硫氧共掺杂石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs）荧光强度的影响（GSH浓度为0-270μM），内插图为GSH浓度与二氧化锰-硫氧共掺杂石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs）荧光强度的Stern-Volmer标准曲线。
图6 对照组先经谷胱甘肽清除剂NEM处理，再用100μg/mL MnO2-S,O-CNQDs孵育2h，实验组直接用100μg/ mL 二氧化锰-硫氧共掺杂石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs）孵育2 h，（a）和（b）分别是在405nm和488nm激发下明场和暗场的细胞图像；（c）是明场和暗场重叠的细胞图。
具体实施方式
实施例1：二氧化锰-硫氧共掺杂石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs）的合成
实施例1-1
S,O-CNQDs溶液的制备：准确称取乙二胺四乙酸二钠0.3722 g，硫脲0.9134 g，置于研钵中研磨均匀，然后将粉末转移到坩埚中，放入烘箱中200 ℃反应2 h。反应完成后待坩埚自然冷却，将棕色胶状产物用无水乙醇洗涤三次，将洗涤后的产物溶于10 mL超纯水中，得到棕红色溶液。将上述溶液离心取上清液，再用0.22 μm的微孔滤膜过滤，将滤液置于透析袋（截留分子量500 Da）中用超纯水透析8 h，得到纯化的S,O-CNQDs溶液。
二氧化锰-硫氧共掺杂石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs）的合成：将500 μL S,O-CNQDs溶液（3 mg/mL）滴加到含有1.5 mL MES（0.1M, pH 6.0）缓冲溶液的离心管中，然后将1 mL高锰酸钾溶液（15 mM）滴加到上述离心管中，用超纯水定容至5 mL，超声30 min直至形成棕色胶体溶液。将上述溶液离心10 min，用超纯水洗涤三次，得到纯净的二氧化锰-硫氧共掺杂石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs），经冷冻干燥后得到MnO2-S,O-CNQDs复合物固体粉末。图2 (a)、(b) 、(c)分别为MnO2纳米片、S,O-CNQDs和二氧化锰-硫氧共掺杂石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs）的TEM图。图3a展示了S,O-CNQDs、MnO2纳米片和二氧化锰-硫氧共掺杂石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs）的FT-IR图。图3b给出了MnO2纳米片、S,O-CNQDs和二氧化锰-硫氧共掺杂石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs）的XRD图，图4表示了 S,O-CNQDs和二氧化锰-硫氧共掺杂石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs）的XPS图。上述表征结果表明，本实验成功制备了二氧化锰-硫氧共掺杂石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs）。
实施例1-2
S,O-CNQDs溶液的制备同实施例1-1。
二氧化锰-硫氧共掺杂石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs）的合成：将500 μL S,O-CNQDs溶液（0.1 mg/mL）滴加到含有1.5 mL MES（0.1M, pH 6.0）缓冲溶液的离心管中，然后将1 mL高锰酸钾溶液（0.1mM）滴加到上述离心管中，用超纯水定容至5 mL，超声5min直至形成棕色胶体溶液。将上述溶液离心10 min，用超纯水洗涤三次，得到纯净的MnO2-S,O-CNQDs复合物，经冷冻干燥后得到MnO2-S,O-CNQDs复合物固体粉末。
实施例1-3
S,O-CNQDs溶液的制备同实施例1-1。
二氧化锰-硫氧共掺杂石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs）的合成：将500 μL S,O-CNQDs溶液（4mg/mL）滴加到含有1.5 mL MES（0.1M, pH 6.0）缓冲溶液的离心管中，然后将1 mL高锰酸钾溶液（18 mM）滴加到上述离心管中，用超纯水定容至5 mL，超声50min直至形成棕色胶体溶液。将上述溶液离心10 min，用超纯水洗涤三次，得到纯净的MnO2-S,O-CNQDs复合物，经冷冻干燥后得到MnO2-S,O-CNQDs复合物固体粉末。
实施例2：
荧光光谱法检测GSH：将二氧化锰-硫氧共掺杂石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs）用作检测液，并将其和一定浓度梯度的谷胱甘肽标准溶液混合，测定GSH加入前检测液的荧光强度F0以及不同GSH浓度下检测体系的荧光强度F（如图5所示），计算相对荧光恢复值F/F0，然后以GSH标准溶液的浓度为横坐标，相对荧光恢复值F/F0为纵坐标，确定标准溶液中GSH浓度与相对荧光恢复强度的关系（内插图），GSH浓度在10-270μM范围内时，F0/F与GSH浓度之间呈现良好的线性关系。线性相关系数（R2）为0.997，检出限（LOD）为0.307μM，通过平行测定11次MnO2-S,O-CNQDs的荧光强度计算得到的相对标准偏差（RSD）为4.20%，说明该方法重现性良好。
实施例3：
血清中GSH的检测：将健康受试者的血浆与乙腈体积比为1:1的比例混合均匀，静置3min后用4000r/min离心机离心30min，取上清液，用0.45μm的过滤膜过滤。滤液用10mM，pH=6.4的PBS缓冲溶液稀释100倍后使用。将同等浓度的检测液均分为三份，各加入等体积10μM，180μM，250μM 的GSH标准溶液，按本发明提供的方法进行检测，结果见表1，加标回收率在99.9%-101.7%之间，说明MnO2-S,O-CNQDs可以作为荧光探针用于血清中GSH的检测。
表1 血样中GSH的回收率实验结果
Figure 13012DEST_PATH_IMAGE002
实施例4：
尿样中GSH的检测：将健康受试者的尿样用离心机（4000r/min）离心20min，测定时取一定体积的尿样用二次蒸馏水将其稀释1000倍后直接使用。将同等浓度的检测液均分为三份，各加入等体积10μM，180μM，250μM的GSH标准溶液，按本发明提供的方法进行检测，结果见表2，加标回收率在99.2%-101.0%之间，说明MnO2-S,O-CNQDs可以作为荧光探针用于尿样中GSH的检测。
表2 尿样中GSH的回收率实验结果
Figure 71098DEST_PATH_IMAGE004
实施例5：
还原型谷胱甘肽注射液中GSH的检测：还原型谷胱甘肽注射液是将注射用谷胱甘肽用0.9%氯化钠注射液配制而成。将同等浓度的检测液均分为三份，各加入等体积10.33μM，180.67μM，250.33μM的GSH标准溶液，按本发明提供的方法进行检测，结果见表3，加标回收率在92.2%-101.6%之间，说明MnO2-S,O-CNQDs可以作为荧光探针用于还原型谷胱甘肽中GSH的检测。
表3 还原型GSH注射液中GSH的回收率实验结果
Figure 427999DEST_PATH_IMAGE006
实施例6：
细胞成像的应用：HepG2细胞（5×105细胞/孔）接种于激光共聚焦培养皿中，在5%CO2、37℃孵箱中孵育24 h。细胞用1mL, 500μM N-乙基马来酰亚胺（NEM）预处理30分钟清除细胞内的GSH，后加入100μg/ mL 二氧化锰-硫氧共掺杂石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs）孵育2h作为对照，然后用PBS洗涤2-3次，结果见图6对照组。细胞在100μg/ mL二氧化锰-硫氧共掺杂石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs）孵育2h作为实验组，然后用PBS洗涤2-3次。细胞用4％的多聚甲醛固定10分钟。按本发明合成的二氧化锰-硫氧共掺杂石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs）孵育细胞，在激光共聚焦扫描显微镜下展现明亮的荧光见图6实验组，说明还原型谷胱甘肽GSH可实现二氧化锰-硫氧共掺杂石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs）的荧光开启。

Claims (5)

1. 一种石墨相氮化碳量子点复合物，其特征在于，是由硫氧共掺杂石墨相氮化碳量子点S,O-CNQDs吸附在二氧化锰纳米片层上获得，所述的S,O-CNQDs平均粒径为1～5nm ；包括以下步骤：
步骤一：称取乙二胺四乙酸二钠和硫脲按质量比1:2.45置于研钵中研磨均匀，将获得的粉末转移到坩埚中，放入烘箱中200 ℃反应2 h反应；
步骤二：步骤一反应后的产物经无水乙醇洗涤后溶于超纯水中，得到溶液；
步骤三：将步骤二获得的溶液离心取上清液，过滤，透析，得到纯化的S,O-CNQDs溶液；
步骤四：将纯化的500 μL浓度为3mg/mL的S,O-CNQDs溶液滴加到2-(N-吗啉)乙磺酸（MES）缓冲溶液的离心管中；
步骤五：将1 mL浓度为15 mM的高锰酸钾溶液滴加到上述离心管中，用超纯水定容获得反应混合液；
步骤六：将步骤五获得的反应混合液超声直至形成棕色胶体溶液，然后经过离心，洗涤，冷冻干燥后得到固体粉末即为二氧化锰-硫氧共掺杂的石墨相氮化碳量子点复合物（MnO2-S,O-CNQDs）。
2.根据权利要求1所述的石墨相氮化碳量子点复合物，其特征在于：步骤六中，所述的超声时间为5-50分钟。
3.权利要求1所述的石墨相氮化碳量子点复合物在检测谷胱甘肽含量和细胞成像中的应用。
4.一种检测谷胱甘肽的含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：将权利要求1获得的石墨相氮化碳量子点复合物用作检测液，并将其和一定浓度梯度的谷胱甘肽标准溶液混合，测定加入GSH前检测液的荧光强度F0以及不同GSH浓度下检测体系的荧光强度F，计算相对荧光强度F/F0，然后以GSH标准溶液的浓度为横坐标，相对荧光强度F/F0为纵坐标,确定标准液中谷胱甘肽浓度和相对荧光恢复强度的关系；
步骤二：将检测液和未知浓度的谷胱甘肽待测样品混合，记录荧光强度；
步骤三：计算待测样品中谷胱甘肽的含量，检测谷胱甘肽的范围为10-270 μM。
5.一种细胞成像方法，其特征在于，采用权利要求1所述的石墨相氮化碳量子点复合物，包括如下步骤：
步骤一：采用MTT法测定所述的石墨相氮化碳量子点复合物的细胞毒性；HepG2细胞接种于96孔板中，置于孵箱中孵育，分别以不同浓度的石墨相氮化碳量子点复合物孵育细胞；
步骤二：PBS洗涤后，每孔加入MTT孵育细胞；
步骤三：加二甲亚砜(DMSO)溶解每孔形成的甲瓒晶体；
步骤四：摇匀后，用酶标仪测定吸光度；
步骤五：细胞成像；HepG2细胞接种于激光共聚焦培养皿中置于孵箱中孵育；
步骤六：用N-乙基马来酰亚胺（NEM）预处理清除细胞内的GSH，之后以石墨相氮化碳量子点复合物孵育细胞作为对照，然后用PBS洗涤；
步骤七：以步骤六中石墨相氮化碳量子点复合物的浓度孵育细胞作为实验组，然后用PBS洗涤；
步骤八：细胞用多聚甲醛固定，最后，在激光共聚焦扫描显微镜下记录荧光图像。
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