CN112964683B - 叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点/银纳米荧光探针的制备方法和应用 - Google Patents

叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点/银纳米荧光探针的制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点/银纳米荧光探针的制备方法和应用。将柠檬酸、双氰胺溶于超纯水，反应获得氮掺杂石墨烯量子点；将1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺、羟基琥珀酰亚胺、叶酸与PBS缓冲液混合均匀，在室温及搅拌条件下，加入氮掺杂石墨烯量子点固体粉末，反应得到的叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点并将其分散于超纯水中，超声并加热处理得到备用溶液；银盐的水溶液中滴加氨水，加热后与上述备用溶液混合，加热搅拌，反应完成后滤液经冷冻干燥得叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点/银纳米固体粉末。本发明用于构建同时测定Hg2+和GSH的开关型荧光探针，此外该探针可通过受体介导的内吞作用靶向癌细胞成像。

Description

叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点/银纳米荧光探针的制备方法 和应用
技术领域
本发明属于纳米材料制备及应用技术领域，具体涉及一种叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点/银纳米复合材料荧光探针的制备方法。
背景技术
重金属离子中汞离子（Hg2+）是自然界最稳定，最难降解的，也是毒性较大和最为普遍存在的离子之一，广泛存在于水、土壤和食品中，它可以通过食物链的形式富集，导致Hg2+含量超标引起许多不良的生理和环境效应。谷胱甘肽（GSH）作为一种重要的生物硫醇，具有抗氧化性和解毒性，在人体可逆氧化还原反应、细胞信号转导、解毒和代谢等方面有着重要的作用；但若体内GSH水平异常会引起糖尿病、艾滋病、心脏病和癌症等多种疾病，因此，检测Hg2+和GSH含量是至关重要。
对于Hg2+含量检测的方法包括电感耦合等离子体质谱法（ICPMS）、原子吸收/发射光谱法、电化学法等；GSH含量分析的方法有电化学脉冲伏安法和高效液相色谱法等。在这些方法中ICPMS、高效液相色谱法和原子吸收光谱法虽具有优良的准确性和选择性，但对样品的要求较高，仪器昂贵，耗时；电化学法虽仪器简单、分析时间短但选择性较差，这些不足限制了它们的应用。与上述方法相比，荧光法作为一种绿色安全有效的方法在物质检测中表现出独特的优势，如可特异性识别目标物质，对目标物质响应时间短，检测成本低等。
荧光成像具有价格低廉、成像快速的特点，且具有分子水平的敏感性单分子成像，能对肿瘤的生长进行靶向标记和示踪。应用于荧光成像的肿瘤靶向探针能够实现在肿瘤组织中的选择性蓄积，故而高选择性靶向探针的构建是靶向肿瘤成像研究的重点和难点。目前报道较多的肿瘤靶向探针主要是基于抗体、多肽、适配子等构建的，这些探针通常存在成本高、免疫原性、亲和力低、半衰期短等缺点，一定程度上限制了它们的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点/银纳米荧光探针的制备方法和应用，该荧光探针对Hg2+和GSH的检测具有高选择性、高灵敏度的特点；而且该荧光探针生物相容性好、低毒，可用于癌细胞靶向成像。
为解决以上技术问题，根据本发明的一个方面，提供一种叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点/银纳米荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，将柠檬酸（CA）、双氰胺（DCD）溶于超纯水，反应温度为160~200℃，反应获得的产物稀释后过滤，将过滤后的溶液透析冷冻干燥得氮掺杂石墨烯量子点（N-GQDs）；
步骤二，将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）、羟基琥珀酰亚胺（NHS）、叶酸（FA）与PBS缓冲液混合均匀，在室温及搅拌条件下，加入步骤一所述的氮掺杂石墨烯量子点（N-GQDs）固体粉末，将反应得到的产物离心，过滤，透析，最终冷冻干燥得到叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点（FA-N-GQDs）；
步骤三，取步骤二合成的叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点（FA-N-GQDs）固体粉末分散于超纯水中，超声处理并在温度为40~60℃条件下加热，备用；
步骤四，向银盐的水溶液中滴加30%的氨水，直至水溶液中没有沉淀变为澄清，在温度为40~60℃条件下加热后备用；
步骤五，将所述步骤三和步骤四配制好的溶液混合，温度为40~60℃条件下加热搅拌，反应完成后过滤收集滤液，溶液经冷冻干燥得叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点/银纳米（FA-N-GQDs/AgNPs）固体粉末。
进一步地，步骤一中，所述的柠檬酸与双氰胺的投料比为(1~3)：(0.5~1.5)。
进一步地，步骤二中，所述的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、羟基琥珀酰亚胺、叶酸、氮掺杂石墨烯量子点的投料比为1:(1~2):(2~3):(0.2~0.6)。
进一步地，步骤二中，PBS的pH值为7.0~7.8。
进一步地，步骤一和步骤二中，透析时，透析袋的截留分子量为500~1000 Da。
根据本发明的另一方面，提供一种叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点/银纳米荧光探针，由以上所述的方法制备而成。
根据本发明的另一方面，还要求保护所述的叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点/银纳米荧光探针在测定Hg2+或GSH中的应用。
基于此，本发明提供一种检测Hg2+或GSH浓度的方法。
检测Hg2+的浓度时，首先取以上所述的叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点/银纳米荧光探针溶液，在溶液中加入不同浓度的Hg2+，用磷酸盐缓冲溶液定容，在荧光仪下测定其荧光光谱；随着Hg2+的浓度增加，该荧光探针的荧光发射强度逐渐下降，由此可制作标准曲线，从而通过该探针荧光强度的变化检测Hg2+的浓度。
检测GSH浓度时，首先取Hg2+溶液和以上所述的叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点/银纳米荧光探针溶液混合，在溶液中加入不同浓度的GSH，用磷酸盐缓冲溶液定容，在荧光仪下测定其荧光光谱；随着GSH的浓度增加，该体系的荧光发射强度逐渐升高，由此制作标准曲线，从而通过该体系荧光强度的变化检测GSH的浓度。
根据本发明的另一方面，还要求保护所述的叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点/银纳米荧光探针在癌细胞靶向荧光成像中的应用。
本发明提供一种癌细胞靶向荧光成像方法，癌细胞孵育贴壁，然后将所述的叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点/银纳米荧光探针加入细胞培养基，混匀，孵育细胞结束后，采用激光共聚焦显微镜在不同波长下拍摄细胞图片，即完成癌细胞的靶向成像。
本发明公开的叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点/银纳米荧光探针（FA-N-GQDs/AgNPs），通过Hg2+可以有效猝灭FA-N-GQDs/AgNPs的荧光，而GSH可以恢复FA-N-GQDs/AgNPs-Hg2+体系的荧光，从而构建了用于同时测定Hg2+和GSH的开关型荧光探针，可实现对Hg2+和GSH的有效检测，并用于癌细胞靶向成像，该探针在环境、化学、生物和医学等领域具有很好的应用价值和应用前景。具体而言，本发明具有以下特点：
（1）本发明的FA-N-GQDs/AgNPs在Hg2+的存在下使得其荧光猝灭，并且FA-N-GQDs/AgNPs的相对荧光强度与Hg2+浓度呈良好的线性关系；
（2）在FA-N-GQDs/AgNPs-Hg2+中加入GSH后，FA-N-GQDs/AgNPs的荧光恢复，并且FA-N-GQDs/AgNPs相对荧光强度与GSH浓度具有较好的线性关系；
（3）本发明中FA-N-GQDs/AgNPs对Hg2+和GSH表现出较强的选择性，可有效减少其他的金属离子或氨基酸类物质对检测的干扰；
（4）本发明中FA-N-GQDs/AgNPs制备过程简单，产品性能稳定，信号响应强，灵敏度高，重现性好；
（5）本发明中FA-N-GQDs/AgNPs具有良好的水溶性、毒性小、生物相容性好等优点，可以同时实现对Hg2+和GSH的检测，不会造成环境污染。
（6）本发明基于FA受体对FA有较强的亲和力，故FA-N-GQDs/AgNPs通过受体介导的内吞作用很容易进入癌细胞，实现对癌细胞靶向成像。
附图说明
图1为本发明实施例1的TEM图（内插图为HRTEM图），其中图a为FA-N-GQDs，图b为AgNPs，图c为FA-N-GQDs/AgNPs。
图2为实施例1中FA-N-GQDs/AgNPs的紫外吸收光谱图、荧光激发、发射光谱图。
图3为实施例1中FA-N-GQDs/AgNPs在不同激发波长下的荧光发射光谱图。
图4为 (a) 不同浓度Hg2+ 对FA-N-GQDs/AgNPs荧光强度的影响。
(b) FA-N-GQDs/AgNPs的荧光强度与Hg2+ 浓度的Lineweaver-Burk标准曲线。
图5为(a)不同浓度GSH对FA-N-GQDs/AgNPs+Hg2+体系荧光强的影响。(b) FA-N-GQDs/AgNPs+Hg2+体系的荧光强度与GSH浓度的标准曲线。
图6为(a) 不同离子对FA-N-GQDs/AgNPs荧光强度的影响和不同离子与Hg2+共存时对FA-N-GQDs/AgNPs荧光的影响。(b) 常见氨基酸和还原性物质对FA-N-GQDs/AgNPs+Hg2+荧光的影响以及常见氨基酸和还原性物质与GSH共存时对FA-N-GQDs/AgNPs+Hg2+荧光的影响。
图7为不同浓度的FA-N-GQDs/AgNPs对MCF-7细胞的毒性大小的测定。
图8为卵巢细胞（CHO）经FA-N-GQDs/AgNPs处理后的激光共聚焦图：(a-c)未经FA-N-GQDs/AgNPs处理的明场、暗场和重叠图；(d-i) 经FA-N-GQDs/AgNPs处理后的明场、暗场和重叠图（蓝色和绿色通道的激发波长分别是405 nm和488 nm）。
图9为人乳腺癌细胞（MCF-7）经FA-N-GQDs/AgNPs处理后的激光共聚焦图：(a-c)未经FA-N-GQDs/AgNPs处理的明场、暗场和重叠图；(d-i) 经FA-N-GQDs/AgNPs处理后的明场、暗场和重叠图（蓝色和绿色通道的激发波长分别是405nm和488nm）。
图10为人乳腺癌细胞（MCF-7）先用过量FA孵育，然后用FA-N-GQDs/AgNPs孵育的激光共聚焦图：(a-c)未经FA-N-GQDs/AgNPs处理时的明场、暗场和重叠图；(d-f) 经FA-N-GQDs/AgNPs处理后的明场、暗场和重叠图（激发波长为405nm）；(g-i) 经FA-N-GQDs/AgNPs处理后的明场、暗场和重叠图（激发波长为488nm）。
图11为人乳腺癌细胞（MCF-7）经过量FA处理后的激光共聚焦图：(a-c)未经FA处理时的明场、暗场和重叠图；(d-f) 经FA处理后在405 nm激发波长下的明场、暗场和重叠图；(g-i) 经FA处理后在488 nm激发波长下的明场、暗场和重叠图。
图12是FA-N-GQDs/AgNPs的合成和开关检测Hg2+与GSH以及靶向荧光成像示意图。
具体实施方式
本发明一种典型的实施方式提供的叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点/银纳米荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，将柠檬酸（CA）、双氰胺（DCD）溶于超纯水，反应温度为160~200℃，反应获得的产物稀释后过滤，将过滤后的溶液透析、冷冻干燥得氮掺杂石墨烯量子点（N-GQDs）固体粉末。
相对具体地，是将柠檬酸（CA）、双氰胺（DCD）溶于超纯水，加入到聚四氟乙烯反应釜，至烘箱加热得到产物稀释后过滤，将溶液透析冷冻干燥得N-GQDs固体粉末。
优选地，所述的柠檬酸（CA）与双氰胺（DCD）的投料比（质量比）为(1~3)：(0.5~1.5)。烘箱种加热反应温度为160~200℃，反应时间为10~15 h，透析膜的截留分子量为500~1000 Da。
步骤二，将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）、羟基琥珀酰亚胺（NHS）、叶酸（FA）与PBS缓冲液混合均匀，在室温及搅拌条件下，加入步骤一所述的氮掺杂石墨烯量子点（N-GQDs）固体粉末，将反应得到的产物离心，过滤，透析，最终冷冻干燥得到叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点（FA-N-GQDs）固体粉末。
相对具体地，是将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）、羟基琥珀酰亚胺（NHS）、叶酸（FA）与PBS缓冲液混合于圆底烧瓶，在室温下用磁力搅拌器搅拌，加入所述步骤一所述的N-GQDs继续搅拌，将得到的产物离心，过滤，透析，最终冷冻干燥得到FA-N-GQDs固体粉末。
优选地，所述的ECD、NHS、FA、N-GQDs的投料比（质量比）为1:(1~2):(2~3):(0.2~0.6)，PBS的PH值为7.0~7.8。ECD、NHS、FA与PBS缓冲液的反应时间为10~20h，加入N-GQDs继续搅拌20~30 h。透析膜的截留分子量为500~1000 Da。
步骤三，取步骤二合成的叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点（FA-N-GQDs）固体粉末分散于超纯水中，超声处理并在温度为40~60℃条件下加热，备用。
优选地，所述的超声时间为1.5~3 h，所述的超纯水用量为8~15ml。
步骤四，向银盐的水溶液中滴加30%的氨水，直至水溶液中没有沉淀变为澄清，在温度为40~60℃条件下加热后备用。所述的银盐选用硝酸银或醋酸银。
步骤五，将所述步骤三和步骤四配制好的溶液混合，温度为40~60℃条件下加热搅拌，搅拌时间为搅拌时间为0.5~1h，反应完成后过滤收集滤液，溶液经冷冻干燥得叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点/银纳米（FA-N-GQDs/AgNPs）固体粉末。
以上所述的荧光探针制备方法简单、条件温和、制备成本较低。
本发明提供的另一典型的实施方式提供一种叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点/银纳米荧光探针（FA-N-GQDs/AgNPs），是由以上所述的方法制备而成。
在上述荧光探针中，石墨烯量子点（GQDs）是一种尺寸小于100 nm的零维石墨烯材料，具有优异的溶解性、易于修饰的表面和显著的物理化学性质等特点。
纳米银（AgNPs）作为一种功能性纳米材料，水溶性好、比表面积大和表面活性高。AgNPs还具有良好的荧光性，不易被光漂白的特点。因此，将石墨烯量子点与纳米银制备成纳米复合材料具有良好的分散性，抗光漂白性，生物相容性好等特点。
上述FA-N-GQDs/AgNPs在Hg2+的存在下使得其荧光猝灭，并且FA-N-GQDs/AgNPs的相对荧光强度与Hg2+浓度呈良好的线性关系；在FA-N-GQDs/AgNPs-Hg2+中加入GSH后，FA-N-GQDs/AgNPs的荧光恢复，并且FA-N-GQDs/AgNPs相对荧光强度与GSH浓度具有较好的线性关系。在其他的金属离子、氨基酸类物质或还原性物质存在情况下，该荧光探针对Hg2+和GSH仍具有较高的选择性和灵敏度。
基于此，本发明另一典型的实施方式提供了叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点/银纳米荧光探针（FA-N-GQDs/AgNPs）在测定Hg2+和GSH中的应用。
叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点/银纳米复合材料（FA-N-GQDs/AgNPs）用于溶液中Hg2+和GSH的检测方法如下。
检测Hg2+的浓度，首先取FA-N-GQDs/AgNPs溶液，在溶液中加入不同浓度的Hg2+，用磷酸盐缓冲溶液定容，在荧光仪下测定其荧光光谱。随着Hg2+的浓度增加，该荧光探针的荧光发射强度逐渐下降。由此可制作标准曲线，从而通过该探针荧光强度的变化检测Hg2+的浓度。
检测GSH的浓度，首先取Hg2+溶液和FA-N-GQDs/AgNPs溶液混合，在溶液中加入不同浓度的GSH，用磷酸盐缓冲溶液定容，在荧光仪下测定其荧光光谱。随着GSH的浓度增加，该体系的荧光发射强度逐渐升高。由此可制作标准曲线，从而通过该体系荧光强度的变化检测GSH的浓度。
本发明合成的叶酸修饰的复合纳米材料荧光探针（FA-N-GQDs/AgNPs）能够特异性靶向癌细胞中的叶酸受体并在肿瘤组织选择性蓄积，同时具有高灵敏度、高光稳定性、良好的生物相容性、低细胞毒性和低成本等优点，可对癌细胞进行靶向成像。
叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点/银纳米复合材料荧光探针用于癌细胞靶向成像，由下述步骤组成：首先癌细胞孵育贴壁，之后将具有靶向功能的FA-N-GQDs/AgNPs荧光探针加入细胞培养基，混匀，孵育细胞结束后，采用激光共聚焦显微镜在不同波长下拍摄细胞图片，即完成癌细胞的靶向成像。
作为一种优选方案，所述的癌细胞为人乳腺癌细胞MCF-7细胞。
下面通过一些实施例对本发明要求保护的技术方案作进一步说明。除非另作特殊说明，本发明中所用材料、试剂均可从本领域商业化产品中获得。
实施例1
制备N-GQDs
将2.0 g CA和1.0 g DCD放入25 mL的聚四氟乙烯反应釜中，向其中加入5 mL 超纯水混合均匀，转移至180℃烘箱加热12 h。反应结束后，反应釜冷却至室温。
将反应釜中的溶液置入烧杯，在烧杯中加入100 mL 超纯水进行稀释，搅拌均匀。用微孔滤膜（0.22 μm）进行过滤，采用截留分子量（MWCO）为1000 Da的透析膜在超纯水进行净化24 h。最后，透析袋中的溶液经冷冻干燥得到N-GQDs固体粉末，以备后续实验使用。
制备FA-N-GQDs
1.0 mg的ECD，1.5 mg的NHS和2.3 mg的FA与10 mL PBS（pH=7.4）缓冲液共同混合于50 mL的圆底烧瓶。在室温下，用磁力搅拌器搅拌15 h后，加入1 mL上述合成N-GQDs（0.4mg/mL）继续搅拌24 h。
最后得到的FA-N-GQDs混合物经离心去掉悬浮物，用微孔滤膜（0.22 μm）进行过滤后，用透析膜（1000 Da）在超纯水中透析24 h。透析后的溶液经冷冻干燥得到FA-N-GQDs固体粉末。
制备FA-N-GQDs/AgNPs
取40 mL FA-N-GQDs（0.25 mg/mL）分散于10 mL 超纯水中，超声处理2 h，获得均匀的溶液加热至50℃。
然后，向2 mL AgNO3（8.5 mg/mL）水溶液中缓慢滴入30%的氨水，直至水溶液中没有沉淀变为澄清，加热至50℃。
将配置好的溶液混合，在50℃下搅拌0.5 h。用0.45 μm的微孔膜进行过滤，收集滤液，得到的FA-N-GQDs/AgNPs溶液经冷冻干燥为固体粉末，以备后续实验使用。
实施例2
制备N-GQDs
将4.0 g CA和2.0 g DCD放入25 mL的聚四氟乙烯反应釜中，向其中加入10 mL 超纯水混合均匀，转移至190℃烘箱加热24h。反应结束后，反应釜冷却至室温。
将反应釜中的溶液置入烧杯，在烧杯中加入100 mL 超纯水进行稀释，搅拌均匀。用微孔滤膜（0.22 μm）进行过滤，采用截留分子量（MWCO）为1000 Da的透析膜在超纯水进行净化48 h。最后，透析袋中的溶液经冷冻干燥得到N-GQDs固体粉末，以备后续实验使用。
制备FA-N-GQDs以及制备FA-N-GQDs/AgNPs同实施例1。
实施例3
制备N-GQDs
将1.0 g CA和1.0 g DCD放入25 mL的聚四氟乙烯反应釜中，向其中加入5 mL 超纯水混合均匀，转移至160℃烘箱加热15 h。反应结束后，反应釜冷却至室温。
将反应釜中的溶液置入烧杯，在烧杯中加入100 mL 超纯水进行稀释，搅拌均匀。用微孔滤膜（0.22 μm）进行过滤，采用截留分子量（MWCO）为1000 Da的透析膜在超纯水进行净化24 h。最后，透析袋中的溶液经冷冻干燥得到N-GQDs固体粉末，以备后续实验使用。
制备FA-N-GQDs
1.0 mg的ECD，1.0 mg的NHS和2.0 mg的FA与10 mL PBS（pH=7.4）缓冲液共同混合于50 mL的圆底烧瓶。在室温下，用磁力搅拌器搅拌10 h后，加入1 mL上述合成N-GQDs（0.42mg/mL）继续搅拌24 h。
最后得到的FA-N-GQDs混合物经离心去掉悬浮物，用微孔滤膜（0.22 μm）进行过滤后，用透析膜（1000 Da）在超纯水中透析24 h。透析后的溶液经冷冻干燥得到FA-N-GQDs固体粉末。
制备FA-N-GQDs/AgNPs
取40 mL FA-N-GQDs（0.25 mg/mL）分散于8 mL 超纯水中，超声处理1.5 h，获得均匀的溶液加热至60℃。
然后，向2 mL AgNO3（8.5 mg/mL）水溶液中缓慢滴入30%的氨水，直至水溶液中没有沉淀变为澄清，加热至40℃。
将配置好的溶液混合，在50℃下搅拌0.5 h。用0.45 μm的微孔膜进行过滤，收集滤液，得到的FA-N-GQDs/AgNPs溶液经冷冻干燥为固体粉末，以备后续实验使用。
实施例4
制备N-GQDs
将1.0 g CA和1.5 g DCD放入25 mL的聚四氟乙烯反应釜中，向其中加入5 mL 超纯水混合均匀，转移至200℃烘箱加热10 h。反应结束后，反应釜冷却至室温。
将反应釜中的溶液置入烧杯，在烧杯中加入100 mL 超纯水进行稀释，搅拌均匀。用微孔滤膜（0.22 μm）进行过滤，采用截留分子量（MWCO）为500 Da的透析膜在超纯水进行净化24 h。最后，透析袋中的溶液经冷冻干燥得到N-GQDs固体粉末，以备后续实验使用。
制备FA-N-GQDs
1.0 mg的ECD，2.0mg的NHS和3.0 mg的FA与10 mL PBS（pH=7.4）缓冲液共同混合于50 mL的圆底烧瓶。在室温下，用磁力搅拌器搅拌20 h后，加入1 mL上述合成N-GQDs（0.6mg/mL）继续搅拌24 h。
最后得到的FA-N-GQDs混合物经离心去掉悬浮物，用微孔滤膜（0.22 μm）进行过滤后，用透析膜（500 Da）在超纯水中透析24 h。透析后的溶液经冷冻干燥得到FA-N-GQDs固体粉末。
制备FA-N-GQDs/AgNPs
取40 mL FA-N-GQDs（0.25 mg/mL）分散于10 mL 超纯水中，超声处理3 h，获得均匀的溶液加热至40℃。
然后，向2 mL AgNO3（8.5 mg/mL）水溶液中缓慢滴入30%的氨水，直至水溶液中没有沉淀变为澄清，加热至50℃。
将配置好的溶液混合，在60℃下搅拌0.5 h。用0.45 μm的微孔膜进行过滤，收集滤液，得到的FA-N-GQDs/AgNPs溶液经冷冻干燥为固体粉末，以备后续实验使用。
实施例5
将3.0 g CA和0.5 g DCD放入25 mL的聚四氟乙烯反应釜中，向其中加入10mL 超纯水混合均匀，转移至180℃烘箱加热12 h。反应结束后，反应釜冷却至室温。
将反应釜中的溶液置入烧杯，在烧杯中加入100 mL 超纯水进行稀释，搅拌均匀。用微孔滤膜（0.22 μm）进行过滤，采用截留分子量（MWCO）为1000 Da的透析膜在超纯水进行净化24 h。最后，透析袋中的溶液经冷冻干燥得到N-GQDs固体粉末，以备后续实验使用。
制备FA-N-GQDs
1.0 mg的ECD，1.5 mg的NHS和2.3 mg的FA与10 mL PBS（pH=7.4）缓冲液共同混合于50 mL的圆底烧瓶。在室温下，用磁力搅拌器搅拌15 h后，加入1 mL上述合成N-GQDs（0.4mg/mL）继续搅拌24 h。
最后得到的FA-N-GQDs混合物经离心去掉悬浮物，用微孔滤膜（0.22 μm）进行过滤后，用透析膜（1000 Da）在超纯水中透析24 h。透析后的溶液经冷冻干燥得到FA-N-GQDs固体粉末。
制备FA-N-GQDs/AgNPs
取40 mL FA-N-GQDs（0.25 mg/mL）分散于15 mL 超纯水中，超声处理2 h，获得均匀的溶液加热至50℃。
然后，向2 mL AgNO3（8.5 mg/mL）水溶液中缓慢滴入30%的氨水，直至水溶液中没有沉淀变为澄清，加热至60℃。
将配置好的溶液混合，在40℃下搅拌1 h。用0.45 μm的微孔膜进行过滤，收集滤液，得到的FA-N-GQDs/AgNPs溶液经冷冻干燥为固体粉末，以备后续实验使用。
实施例6
以实施例1得到的叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点/银纳米复合材料用于水样Hg2+的检测方法：
实验过程中的水样分别来自太原市迎泽公园的湖水和实验室自来水。取来的水样经加热煮沸30 min后除去水中的细菌等物质，冷却，用微孔滤膜（0.22 μm）过滤获得处理后的水样。
首先取30 μL FA-N-GQDs/AgNPs溶液，在溶液中分别加入高中低三个不同浓度的Hg2+标准溶液，用处理后的水样将其定容至3mL，混匀后室温下反应8 min，在荧光仪下测定其荧光光谱，检测结果如表1，加标回收率在95.3%-104.0%，说明FA-N-GQDs/AgNPs荧光探针可应用于水样中Hg2+的检测。
表1 自来水和湖水中Hg2+的检测结果
Figure 26135DEST_PATH_IMAGE001
实施例7
以实施例1得到的叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点/银纳米复合材料 “off-on”检测生物样品中GSH的方法：
生物样品尿样和血样均由健康成年志愿者捐献。尿样的处理如下：将尿样离心20min（4000 r/min-1）后，取上清液，用超纯水将其稀释1000倍。血样的制备如下: 将血清与乙腈同体积混合均匀，静置3 min后，以8000 r/min-1离心机离心10 min，上清液用0.45 μm的微孔滤膜过滤，滤液用pH = 7.0的磷酸盐缓冲溶液（PBS，10 mM）稀释 100 倍后备用。
首先取50 μL的Hg2+溶液和30 μL FA-N-GQDs/AgNPs溶液，用经磷酸盐缓冲溶液（pH=7.0，10 mM，PBS）稀释后的生物样品（尿样/血样）将其定容至3mL，混匀后室温下反应8min，在溶液中加入高中低三个不同浓度的GSH标准溶液，混匀后反应3 min，在荧光仪下测定其荧光光谱，检测结果如表2，加标回收率在97.0%-108.0%之间，说明FA-N-GQDs/AgNPs作为荧光探针检测生物样品中GSH具有较大潜力。
表2 血样和尿样中GSH的测定结果
Figure 463676DEST_PATH_IMAGE002
实施例8
以实施例1得到的FA-N-GQDs/AgNPs对癌细胞的靶向荧光成像，方法如下：
（1）用MTT法测定了FA-N-GQDs/AgNPs对MCF-7细胞的毒性大小。MCF-7细胞接种于96孔板中孵育24 h。弃去培养液，再用有不同浓度的FA-N-GQDs/AgNPs溶液（0，25、50，100，250和500 μg/mL）的1640培养基孵育20 h，之后每孔加入20 μL MTT溶液继续孕育4 h后，弃去上清液，最后每孔加入150 μL DMSO振荡10 min，然后直接用酶标仪在490 nm处测定每个孔的吸光度值。图7所示，经500 μg/mL FA-N-GQDs/AgNPs孵育后MCF-7细胞存活率仍可以达到80%以上，表明FA-N-GQDs/AgNPs具有较低的细胞毒性。
（2）经100 μg/mL FA-N-GQDs/AgNPs分别孵育正常细胞（CHO）和癌细胞（MCF-7）4h，用PBS冲洗3次后，上述的CHO细胞和MCF-7细胞均先用4%多聚甲醛固定10 min，然后用激光共聚焦显微镜在405 nm和488 nm激发波长下记录上述细胞的荧光图像。图8显示CHO细胞荧光较弱或者几乎没有荧光，而图9中的MCF-7细胞荧光图像较亮，说明FA-N-GQDs/AgNPs能够靶向识别癌细胞。
（3）为了进一步证实FA-N-GQDs/AgNPs对MCF-7细胞靶向识别作用。将MCF-7细胞先用过量的12 mM FA处理再用100 μg/mL FA-N-GQDs/AgNPs孵育，用激光共聚焦显微镜观察到的细胞呈现微弱荧光（图10），而仅用12 mM FA孵育后的MCF细胞被观察到没有荧光（图11）。上述现象都很好的表明AgNPs/FA-N-GQDs对癌细胞靶向性和成像能力（图12）。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点/银纳米荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，将柠檬酸、双氰胺溶于超纯水，反应温度为160~200℃，反应获得的产物稀释后过滤，将过滤后的溶液透析冷冻干燥得氮掺杂石墨烯量子点；
步骤二，将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、羟基琥珀酰亚胺、叶酸与PBS缓冲液混合均匀，在室温及搅拌条件下，加入步骤一所述的氮掺杂石墨烯量子点固体粉末，将反应得到的产物离心，过滤，透析，最终冷冻干燥得到叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点；
步骤三，取步骤二合成的叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点固体粉末分散于超纯水中，超声处理并在温度为40~60℃条件下加热，备用；
步骤四，向银盐的水溶液中滴加30%的氨水，直至水溶液中没有沉淀变为澄清，在温度为40~60℃条件下加热后备用；
步骤五，将所述步骤三和步骤四配制好的溶液混合，温度为40~60℃条件下加热搅拌，反应完成后过滤收集滤液，溶液经冷冻干燥得叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点/银纳米固体粉末。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤一中，所述的柠檬酸与双氰胺的投料比为(1~3)：(0.5~1.5)。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤二中，所述的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、羟基琥珀酰亚胺、叶酸、氮掺杂石墨烯量子点的投料比为1:(1~2):(2~3):(0.2~0.6)。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤二中，PBS的pH值为7.0~7.8。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤一和步骤二中，透析时，透析袋的截留分子量为500~1000 Da。
6.一种叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点/银纳米荧光探针，其特征在于：由权利要求1至5任一项所述的方法制备而成。
7.权利要求6所述的叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点/银纳米荧光探针在测定Hg2+或GSH中的应用。
8.一种检测Hg2+或GSH浓度的方法，其特征在于：
检测Hg2+的浓度时，首先取权利要求6所述的叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点/银纳米荧光探针溶液，在溶液中加入不同浓度的Hg2+，用磷酸盐缓冲溶液定容，在荧光仪下测定其荧光光谱；随着Hg2+的浓度增加，该荧光探针的荧光发射强度逐渐下降，由此可制作标准曲线，从而通过该探针荧光强度的变化检测Hg2+的浓度；
检测GSH浓度时，首先取Hg2+溶液和权利要求6所述的叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点/银纳米荧光探针溶液混合，在溶液中加入不同浓度的GSH，用磷酸盐缓冲溶液定容，在荧光仪下测定其荧光光谱；随着GSH的浓度增加，该体系的荧光发射强度逐渐升高，由此制作标准曲线，从而通过该体系荧光强度的变化检测GSH的浓度。
9.权利要求6所述的叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点/银纳米荧光探针在癌细胞靶向荧光成像中的应用。
10.一种癌细胞靶向荧光成像方法，其特征在于：癌细胞孵育贴壁，然后将权利要求6所述的叶酸修饰氮掺杂石墨烯量子点/银纳米荧光探针加入细胞培养基，混匀，孵育细胞结束后，采用激光共聚焦显微镜在不同波长下拍摄细胞图片，即完成癌细胞的靶向成像。
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