CN114324266A - 一种纳米金团簇制备及其在生物小分子增敏检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种纳米金团簇制备及其在生物小分子增敏检测方法，尿酸在尿酸氧化酶催化下产生过氧化氢，利用合成的金纳米团簇的过氧化物酶活性，催化产物H2O2将底物3,3',5,5'‑四甲基联苯胺氧化成ox‑TMB，此时AuNCs的发射光谱与ox‑TMB的吸收光谱重叠，强荧光的AuNCs与ox‑TMB之间发生了一种荧光共振能量转移，BSA‑AuNCs荧光信号达到猝灭的效果，该方法不仅解决了传统酶法使用条件受制约的问题，同时降低检测线，实现了对尿酸分子的增敏检测。由于AuNCs的发射光谱与ox‑TMB的吸收光谱重叠，强荧光的AuNCs与ox‑TMB之间发生了一种荧光共振能量转移，使AuNCs荧光信号显著降低，达到增敏检测尿酸含量的目的。
Description
技术领域
本发明属于纳米金团簇技术领域，尤其涉及一种具有检测血液中尿酸含量作用的纳米金团簇制备方法。
背景技术
近几十年来，纳米金团簇(AuNCs)作为一种新型无毒、无害的发光纳米材料已被广泛用于生物医学研究，并且纳米级技术的进步有助于疾病的诊断、治疗和预防。[UpadhyayY,Kumar R,Kumar S A,et al.Vitamin B6 cofactors conjugated ovalbumin-stabilized gold nanoclusters:Application in alkaline phosphatase activitydetection and generating white-light emission[J].Microchemical Journal,2020,156:104859.]AuNCs是一种超小型新型的荧光纳米材料,[杨群峰,刘建云,陈华萍,等.贵金属纳米团簇的制备及在生物检测中的应用[J].化学进展,2011,23(5):880-892.]。因尺寸超小(一般＜2nm)而具有类分子的性质。AuNCs除了具有纳米金粒子所有的生物相容性好、光学特性等特点外，还可以在紫外激发下具有荧光。AuNCs相对于传统的有机染料荧光分子，大大改善了荧光性质(如高量子产率、尺寸依赖且可调的荧光发射和耐光漂白等)，使其更有利于进行生物样本中的长时间的荧光跟踪。相比于使用有毒金属合成的半导体量子点[Michalet X,Pinaud F F,Bentolila L A,et al.Quantum Dots for Live Cells,InVivo Imaging,and Diagnostics[J].Science,2005,307(5709):538-544.]碳纳米量子点等[Luminescent Carbon.Nanodots:Emergent Nanolights[J].Angewandte ChemieInternational Edition,2010,49(38):6726-6744.]，AuNCs作为新型的荧光探针，具有光稳定性好、大的斯托克位移、制备条件简单温和、无毒、水溶性好、易于修饰、生物相容性好，表面易功能化等优点。
过氧化氢(H2O2)是几乎所有氧化酶(如尿酸氧化酶，葡萄糖氧化酶，胆固醇氧化酶，乳酸氧化酶，胆碱氧化酶，黄嘌呤氧化酶和单胺氧化酶)催化的酶促反应的主要产物之一，并且是诸如辣根过氧化物酶和过氧化氢酶之类酶的底物[Deng H H,Wu G W,Dong H,etal.Fenton reaction-mediated fluorescence quenching of N-acetyl-l-cysteine-protected gold nanoclusters:analytical applications of hydrogen peroxide,glucose,and catalase detection[J].Analyst,2015,140(22).]。此外，H2O2在各种细胞生化过程中发挥着重要作用，已被证实是一种次级代谢产物[Georgiou G,Masip L.AnOveroxidation Journey with a Return Ticket[J].Science,2003,300(5619):592-594.]。迄今为止，已有多种H2O2的分析方法，如分光光度法、荧光法、电化学法、化学发光法、共振光散射法和色谱法被用于H2O2的检测。其中，荧光检测比其他技术具有许多优点，包括高的空间和时间分辨率、敏感性、特异性、快速性和简便性。
随着人们生活水平的提高，饮食结构的变化，嘌呤的摄入量也明显增加，UA是嘌呤代谢的主要终产物，通常存在于血清或尿液等生物液体中，由于其溶解性差，易在人体内积聚，高尿酸血症患者明显增多引发了一系列疾病。临床上，生物体液中UA的含量过高与高尿酸血症、痛风、代谢综合征、肾结石等疾病密切相关，而血清中UA异常低可能是帕金森病或多发性硬化等疾病，因此在临床标本中检测UA对早期诊断和治疗具有重要意义。目前，尿酸的测定方法主要包括高效液相色谱，质谱，紫外分光光度，电化学，化学发光和毛细管电泳法[Li W Q,Qiu Y,Han W,et al.Determination of uric acid in biological samplesby high performance liquid chromatography-electrospray ionization-tandem massspectrometry and study on pathogenesis of pulmonary arterial hypertension inpulmonary artery endothelium cells[J].RSC Advances,2018,8(45):25808-25814.]。然而上述方法普遍存在繁琐的衍生、修饰和复杂的前处理等问题，且仪器价格昂贵、成本高和特异性低，限制了其在临床试验中尿酸检测的潜在应用。
由于H2O2是尿酸(uric acid,UA)经尿酸氧化酶催化氧化后的产物[Huang S,YangE,Yao J,et al.Nitrogen,Cobalt Co-doped Fluorescent Magnetic Carbon Dots asRatiometric Fluorescent Probes for Cholesterol and Uric Acid in Human BloodSerum[J].ACS Omega,2019,4(5):9333-9342.]。BSA-AuNCs能够模拟过氧化物酶发挥酶活性，它们可以催化产物H2O2将底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)氧化成ox-TMB，此时AuNCs的发射光谱与ox-TMB的吸收光谱重叠，强荧光的AuNCs与ox-TMB之间发生了一种荧光共振能量转移(FRET)。AuNCs充当供体，将激发能量转移到受体ox-TMB，从而使ox-TMB产生荧光，同时AuNCs的荧光强度明显低于单独存在时的强度，增强了AuNCs的荧光猝灭，从而大大提高了检测灵敏度。使得该方法简便快速，灵敏度高。
纳米金团簇在制备过程中Au3+在溶液中被还原更倾向于生成较大粒径的纳米粒子而不是具有荧光的小粒径纳米簇，这是由于金属纳米簇表面积大，表面活化能高，更容易聚集。因此，在纳米簇表面需要有特定基团的保护才可以避免其在溶液中进一步聚集成没有荧光的纳米粒子，另外，合适的保护剂和模板分子能很好地控制纳米金团簇的尺寸，并且能显著影响纳米金团簇的荧光等理化性质。作为模板分子的保护剂中含有富电子原子，如N、O或富电子基团，如-COOH、-NH2，这类模板分子可以在一定程度上提高被保护的纳米金团簇的荧光强度。本专利开发了一种尿酸传感器，以血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、谷胱苷肽(L-glutathione in the reduced form,GSH)和鸡蛋清白蛋白(chicken eggwhite,CEW)作为模板，经水浴法简单、绿色地合成了BSA-AuNCs、GSH-AuNCs、CEW-AuNCs三种荧光探针。基于BSA-AuNCs、GSH-AuNCs、CEW-AuNCs开发了一种具有高度选择性、高灵敏度且可视化的尿酸(uric acid,UA)传感器。由于传统尿酸检测方法主要为色谱法、电化学法、和酶法。色谱法需要昂贵的仪器,电化学方法操作较复杂,酶法主要用到2种酶(尿酸氧化酶和过氧化物酶)和色源物质,酶的价格昂贵且储存不方便,并且酶的活性受外界条件影响较大(如温度,pH值,尤其是有机溶剂),这都限制了这些方法的应用。
发明内容
本发明的技术目的在于，尿酸在尿酸氧化酶催化下产生过氧化氢，利用合成的金纳米团簇的过氧化物酶活性，催化产物H2O2将底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)氧化成ox-TMB，此时AuNCs的发射光谱与ox-TMB的吸收光谱重叠，强荧光的AuNCs与ox-TMB之间发生了一种荧光共振能量转移(FRET)，BSA-AuNCs荧光信号达到猝灭的效果，该方法不仅解决了传统酶法使用条件受制约的问题，同时降低检测线，实现了对尿酸分子的增敏检测。
本发明采用的技术方案一种纳米金团簇制备及其在生物小分子增敏检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)纳米金团簇制备
将10-200mg模板(BSA、GSH或CEW)加入到1-10mL超纯水中，于25-40℃水浴中搅拌至溶解，在剧烈搅拌下迅速向BSA溶液中加入HAuCl4水溶液(1-100mmol/L，1-10mL)混匀3-10min后，加入NaOH溶液(0.5-2mol/L，0.1-0.5mL)，在37℃下温和搅拌10-40h。所得AuNCs溶液的颜色开始为浅黄色，随后变为浅棕色，最后变为深棕色。
(2)金纳米团簇分离纯化
将获得的AuNCs溶液在黑暗中静置12-48小时，之后倒入20000MWCO透析袋中透析12-48小时(每4-8小时更换一次水)，以除去未反应的小分子HAuCl4和NaOH。将透析后的混合溶液用注射器经过0.22μm的微孔滤膜滤过除去多余的大粒径的杂质。将最终获得的溶液在黑暗中于0-4℃下保存。
与现有技术相比较，本发明提出了一种用血清白蛋白(BSA)、谷胱苷肽(L-glutathione in the reduced form,GSH)和鸡蛋清白蛋白(chicken egg white,CEW)为模板分子的纳米金团簇荧光探针，研究了荧光探针的合成条件和应用，成功建立了基于FRET法灵敏检测生物小分子尿酸的方法。
本发明的金纳米团簇可作为尿酸传感器。利用尿酸在尿酸氧化酶催化下产生过氧化氢，利用合成的金纳米团簇的过氧化物酶活性，催化产物H2O2将底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)氧化成ox-TMB，避免了过氧化物酶价格昂贵、储存不便的问题。由于AuNCs的发射光谱与ox-TMB的吸收光谱重叠，强荧光的AuNCs与ox-TMB之间发生了一种荧光共振能量转移(FRET)，使AuNCs荧光信号显著降低，达到增敏检测尿酸含量的目的。因此，金纳米团簇可作为尿酸传感器，用于尿酸增敏检测。
附图说明
图1中，(A)为BSA-AuNCs对不同量的UA和TMB共存的荧光光谱图，(B)为线性关系Stern-Volmer图。
图2中，(A)为GSH-AuNCs对不同量的UA和TMB共存的荧光光谱图，(B)为线性关系Stern-Volmer图。
图3中，(A)为CEW-AuNCs对不同量的UA和TMB共存的荧光光谱图，(B)为线性关系Stern-Volmer图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1
纳米金团簇制备
配制100mmol/L HAuCl4和2mol/L的NaOH溶液。将200mg BSA加入到10mL超纯水中，于40℃水浴中搅拌至溶解，在剧烈搅拌下迅速向BSA溶液中加入10mL 100mmol/L HAuCl4水溶液混匀10min后，加入2mol/L的NaOH溶液0.5mL，在37℃下温和搅拌40h。
纳米团簇分离纯化
将制备好的纳米金团簇，避光保存48小时，之后倒入20000MWCO透析袋中透析48小时(每8小时更换一次水)。透析后，将混合溶液用注射器经过0.22μm的微孔滤膜滤过除去多余的大粒径的杂质。将最终获得的溶液在黑暗中于4℃下保存。
实验材料
样品：
上述实施例1生产的BSA-AuNCs。血液样本取自3名健康的成年人。
实验方法：
基于FRET生物传感器的建立以及UA标准曲线制定
配制20mmol/LUA储备液，用柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液稀释UA储备液至不同浓度，将700μL柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH 6.0，20mmol/L)、100μL稀释后的BSA-AuNCs溶液、100μL5mmol/L TMB溶液、15μL尿酸酶(10mg/mL)和不同浓度(0，0.7，2.0，15，40，65，70，80，100，150，200μmol/L)的UA在37℃黑暗中温育15min。然后用FL以500nm激发波长记录荧光光谱。
人血液样品分析
首先将血样(来自3名健康志愿者)，以3500rpm离心5min，随后，将一定体积的上层血清样品与10mg/mL的尿酸酶在37℃下温育10min，然后取100μL上述氧化后的溶液与700μL柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH 6.0，20mmol/L)，100μL稀释后的BSA-AuNCs溶液、100μL 5mmol/LTMB溶液混合摇匀，在37℃黑暗中温育15min。最后，在FL上进行血清中UA的分析。
实施例2
纳米金团簇制备
配制1mmol/L HAuCl4和0.5mol/L的NaOH溶液。将10mg GSH加入到1mL超纯水中，于25℃水浴中搅拌至溶解，在剧烈搅拌下迅速向GSH溶液中加入1mL 1mmol/L HAuCl4水溶液混匀3min后，加入0.5mol/L的NaOH溶液0.1mL，在37℃下温和搅拌10h。
纳米团簇分离纯化
将制备好的纳米金团簇，避光保存12小时，之后倒入20000MWCO透析袋中透析12小时(每4小时更换一次水)。透析后，将混合溶液用注射器经过0.22μm的微孔滤膜滤过除去多余的大粒径的杂质。将最终获得的溶液在黑暗中于0℃下保存。
上述实施例1生产的GSH-AuNCs。血液样本取自3名健康的成年人。
实验方法：
基于FRET生物传感器的建立以及UA标准曲线制定
配制20mmol/LUA储备液，用柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液稀释UA储备液至不同浓度，将700μL柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH 6.0，20mmol/L)、100μL稀释后的GSH-AuNCs溶液、100μL5mmol/L TMB溶液、15μL尿酸酶(10mg/mL)和不同浓度(0，0.7，2.0，15，40，65，70，80，100，150，200μmol/L)的UA在37℃黑暗中温育15min。然后用FL以500nm激发波长记录荧光光谱。
人血液样品分析
首先将血样(来自3名健康志愿者)，以3500rpm离心5min，随后，将一定体积的上层血清样品与10mg/mL的尿酸酶在37℃下温育10min，然后取100μL上述氧化后的溶液与700μL柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH 6.0，20mmol/L)，100μL稀释后的GSH-AuNCs溶液、100μL 5mmol/LTMB溶液混合摇匀，在37℃黑暗中温育15min。最后，在FL上进行血清中UA的分析。
实施例3
纳米金团簇制备
配制10mmol/L HAuCl4和1mol/L的NaOH溶液。将125mg CEW加入到2.5mL超纯水中，于37℃水浴中搅拌至溶解，在剧烈搅拌下迅速向CEW溶液中加入2.5mL 10mmol/L HAuCl4水溶液混匀5min后，加入1mol/L的NaOH溶液0.25mL，在37℃下温和搅拌24h。
纳米团簇分离纯化
将制备好的纳米金团簇，避光保存24小时，之后倒入20000MWCO透析袋中透析24小时(每8小时更换一次水)。透析后，将混合溶液用注射器经过0.22μm的微孔滤膜滤过除去多余的大粒径的杂质。将最终获得的溶液在黑暗中于4℃下保存。
实验材料
上述实施例1，2，3中生产的CEW-AuNCs。血液样本取自3名健康的成年人。
实验方法：
基于FRET生物传感器的建立以及UA标准曲线制定
配制20mmol/L UA储备液，用柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液稀释UA储备液至不同浓度，将700μL柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH 6.0，20mmol/L)、100μL稀释后的CEW-AuNCs溶液、100μL5mmol/L TMB溶液、15μL尿酸酶(10mg/mL)和不同浓度(0，0.7，2.0，15，40，65，70，80，100，150，200μmol/L)的UA在37℃黑暗中温育15min。然后用FL以500nm激发波长记录荧光光谱。
人血液样品分析
首先将血样(来自3名健康志愿者)，以3500rpm离心5min，随后，将一定体积的上层血清样品与10mg/mL的尿酸酶在37℃下温育10min，然后取100μL上述氧化后的溶液与700μL柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH 6.0，20mmol/L)，100μL稀释后的CEW-AuNCs溶液、100μL 5mmol/LTMB溶液混合摇匀，在37℃黑暗中温育15min。最后，在FL上进行血清中UA的分析。
结果：
以BSA为模板合成AuNCs
UA标准曲线
在2.0～100μmol/L范围内，猝灭程度呈线性关系。
表示为(F0-F)/F0＝0.00585cUA+0.10364，线性相关系数为0.9954，检出限为0.26μmol/L。其中F0和F分别是不存在UA和存在UA的荧光强度。
临床血液样本的分析
由于该方法具有的高灵敏度、高度选择性和高特异性，因此将本方法应用于实际临床血样中UA的测定，结果如表1，采用标准加样回收的方法检测血样中的UA，加标回收率为97.3％～104.7％，相对标准偏差RSD为2.4％～3.2％，表明此方法可以应用于临床血液样本中UA的灵敏检测。
表1血液样本UA回收率结果
以GSH为模板合成AuNCs
UA标准曲线
随UA浓度(0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100μmol/L)的增加，GSH-AuNCs的荧光强度逐渐降低。在尿酸氧化酶存在下，不同浓度的UA与GSH-AuNCs反应的相对强度(F0-F)/F0，如图2所示，其中F0和F分别是不存在UA和存在UA的荧光强度，结果发现，在20～90μmol/L范围内，猝灭程度呈线性关系，表示为(F0-F)/F0＝0.01890cUA-0.33166，线性相关系数为0.9903，检出限为2.39μmol/L，插图显示在365nm紫外灯下的照片。
临床血液样本的分析
由于该方法具有的高灵敏度、高度选择性和高特异性，因此将本方法应用于实际临床血样中UA的测定，结果如表2，采用标准加样回收的方法检测血样中的UA，加标回收率为99.7％～103.5％，相对标准偏差RSD为0.3％～2.8％，表明此方法可以应用于临床血液样本中UA的灵敏检测。
表2血液样本UA回收率结果
以CEW为模板合成AuNCs
UA标准曲线
随UA浓度(0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100μmol/L)的增加，CEW-AuNCs的荧光强度持续降低。结果显示，不同浓度的UA在尿酸氧化酶的存在下与BSA-AuNCs反应的相对强度(F0-F)/F0，如图3(B)所示，其中F0和F分别是不存在UA和存在UA的荧光强度，结果发现，在20～100μmol/L范围内，猝灭程度呈线性关系，表示为(F0-F)/F0＝0.00652cUA+0.17129，线性相关系数为0.9920，检出限为1.20μmol/L。远低于人体正常尿酸含量的最低值(90μmol/L)，插图显示在365nm紫外灯下的照片。
临床血液样本的分析
由于该方法具有的高灵敏度、高度选择性和高特异性，因此将本方法应用于实际临床血样中UA的测定，结果如表3，采用标准加样回收的方法检测血样中的UA，加标回收率为97.2％～102.5％，相对标准偏差RSD为1.6％～2.7％，表明此方法可以应用于临床血液样本中UA的灵敏检测。
表3血液样本UA回收率结果
本方法以BSA、GSH、CEW模板分子，以简单、绿色的方法合成了BSA-AuNCs、GSH-AuNCs、CEW-AuNCs荧光探针，基于超灵敏的FRET多功能生物传感系统检测UA，BSA-AuNCs在这里显示出特征性的过氧化物酶活性，在检测中催化H2O2氧化TMB，从而生成ox-TMB。强荧光的AuNCs和ox-TMB之间有效的FRET使得对UA的检测限极低，BSA-AuNCs为0.26μmol/L，在2.0～100μmol/L范围内，猝灭程度呈线性关系。
方程为(F0-F)/F0＝0.00585cUA+0.10364。基于GSH-AuNCs的FRET方法检测UA在20～90μmol/L范围内，猝灭程度呈线性关系，表示为(F0-F)/F0＝0.01890cUA-0.33166，线性相关系数为0.9903，检出限为2.39μmol/L。基于CEW-AuNCs的FRET方法检测UA在20～100μmol/L范围内，猝灭程度呈线性关系，表示为(F0-F)/F0＝0.00652cUA+0.17129，线性相关系数为0.9920，检出限为1.20μmol/L。均远低于人体正常尿酸含量的最低值(90μmol/L)。说明这三种方法在检测UA中灵敏可靠，为其进一步应用于临床血样的检测提供了基础。
Claims (5)
1.一种纳米金团簇制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)纳米金团簇制备；
将10-200mg模板加入到1-10mL超纯水中，于25-40℃水浴中搅拌至溶解获取模板溶液；在搅拌下向模板溶液中加入HAuCl4水溶液(1-100mmol/L，1-10mL)混匀后，加入NaOH溶液(0.5-2mol/L，0.1-0.5mL)，在37℃下搅拌获得AuNCs溶液；
(2)金纳米团簇分离纯化；
将获得的AuNCs溶液在黑暗中静置，之后倒入透析袋中透析，除去未反应的小分子HAuCl4和NaOH；将透析后的混合溶液用注射器经过微孔滤膜除去多余杂质获取溶液。
2.根据权利要求1所述的一种纳米金团簇制备方法，其特征在于，在37℃下搅拌10-40h所得AuNCs溶液，AuNCs溶液颜色开始为浅黄色，随后变为浅棕色，最后变为深棕色。
3.根据权利要求1所述的一种纳米金团簇制备方法，其特征在于，将除去多余杂质获取溶液在黑暗中于0-4℃下保存。
4.根据权利要求1所述的一种纳米金团簇制备方法，其特征在于，所述的金纳米团簇分离纯化中，透析12-48小时中每4-8小时更换一次水。
5.利用权利要求1-4任一所述纳米金团簇在生物小分子增敏检测方法，其特征在于：所述AuNCs溶液中的金纳米团簇作为尿酸传感器；利用尿酸在尿酸氧化酶催化下产生过氧化氢，利用合成的金纳米团簇的过氧化物酶活性，催化产物H2O2将底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺氧化成ox-TMB。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
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|---|---|---|---|---|
| CN116272705A (zh) * | 2023-02-07 | 2023-06-23 | 广东工业大学 | 一种核壳化纳米团簇水凝胶微球的制备方法与应用 |
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