CN113801650A - 一种巯基β-环糊精-金纳米簇及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种巯基β‑环糊精‑金纳米簇及其制备方法和应用。所述巯基β‑环糊精‑金纳米簇是由氯金酸或氯金酸盐和单(6‑巯基‑6‑去氧)β‑环糊精在水中，加入氢氧化钠，在加热条件下反应制得；所述巯基β‑环糊精‑金纳米簇的水溶液在自然光下呈黄色透明溶液，在365nm紫外光照射下发出绿色荧光。申请人在试验中发现，该巯基β‑环糊精‑金纳米簇与胆固醇接触作用后，可增强其荧光强度，因而可以用于人血清中胆固醇含量的检测，而且抗干扰能力强、灵敏度高，胆固醇浓度在10.0～100.0μmol/L时，胆固醇浓度与巯基β‑环糊精‑金纳米簇的荧光增强程度呈线性关系，检测限为5.77μmol/L(S/N＝3)。

Description

一种巯基β-环糊精-金纳米簇及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种巯基β-环糊精-金纳米簇及其制备方法和应用，属于生物 检测技术领域。

背景技术

胆固醇是人类的重要脂质，是细胞膜的主要成分，有助于保持膜渗透性 和流动性。在人体的正常浓度下，胆固醇在食物的消化中发挥着重要作用。 胆固醇在人体中扮演四个不同的重要角色，即在肠道中形成消化性胆汁酸， 产生维生素D，还有形成细胞膜和一些激素。人血清中胆固醇含量过高会在 血管通道中形成斑块，从而阻碍血液的循环和导致心血管疾病；而胆固醇含 量过低也会诱发癌症、老年痴呆以及脑出血等疾病。因此，胆固醇成为许多 疾病重要的生物标志物，胆固醇也是临床最普遍的检测项目之一。

测定总胆固醇的方法已经超过200种，可以分为四大类：化学试剂比色法、 酶分析法、荧光法、高效液相色谱法。目前，胆固醇的测定基本上都采用酶 法测定，利用酚-氨基安替比林-H₂O₂酶显色，测量反应液在500nm的吸光度， 从而定量测定胆固醇的量。但近年来荧光法在生物分析研究领域发挥着越来 越重要的作用。

直径在纳米级的纳米金粒子，其基本单元都是微小尺寸的粒子，故具有 很多宏观粒子所不具备的物理特性，如光学效应、小尺寸效应、表面效应、 宏观量子隧道效应、介电限域效应以及一些其他的特殊效应。这些效应使得 纳米金粒子广泛应用于材料、医学检验、临床医学、食品、化工、陶瓷、染 料等各领域。带有超分子结构的金纳米粒子(即通过大分子物质修饰的金纳米 粒子)兼具了金纳米粒子和大分子物质的特性。目前已有以β-环糊精(Beta cyclodextrin,β-CD)修饰的金纳米粒子应用于荧光法检测人血清胆固醇含量的相关报道，如：

公布号为CN 105417492A的发明专利，公开了一种β-环糊精-金纳米粒子 的制备方法以及胆固醇的检测方法，其中β-环糊精-金纳米粒子的制备方法为： 在缓冲溶液的存在下，将水、金源溶液和β-环糊精溶液进行接触反应制得β- 环糊精-金纳米粒子(粒径为17～22nm)；其中，金源溶液选自三水合氯金酸溶 液、氯金酸盐溶液、四硝酸基合金酸溶液和四硝酸基合金盐溶液中的一种或 多种。在检测胆固醇时，需要罗丹明B溶液的参与才能够实现对胆固醇的定量 检测。

公布号为CN 104198740A的发明专利，公开了一种对葡萄糖和胆固醇同 步检测的纳米生物传感器，该生物传感器的构建是将环糊精修饰的纳米金先 与罗丹明6G共孵育后除去多余产物先构成检测胆固醇的传感器，再和已标记 碳量子点的伴刀豆蛋白Con通过自组装的简单过程来实现，其中环糊精修饰的 纳米金通过氯金酸盐与巯基-β-环糊精混合溶液在激烈磁性搅拌中加入氢氧化 钠一步法合成。该发明涉及的碳量子点、罗丹明6G染料的荧光激发和发射性 质不同，检测所使用的荧光发射波形不发生重叠互相干扰，从而借助荧光分 析手段以实现双重物质的定量检测。

上述两个申请中均采用了β-环糊精修饰的纳米金粒子，且在荧光法检测 胆固醇的含量时均需要罗丹明染料的参与，对胆固醇的测定原理相同，均是 先将罗丹明6G结合在环糊精空腔中，罗丹明6G的荧光被抑制，处于猝灭状态。 当加入胆固醇时，由于环糊精修饰的纳米金与胆固醇的结合作用比环糊精-罗 丹明的结合作用强，使罗丹明被从环糊精的空腔中置换出来，罗丹明的荧光 得以恢复。也就是说，两个申请中的β-环糊精修饰的纳米金粒子本身不具有 荧光性质，检测时的荧光是被释放出来的罗丹明染料发出的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种在紫外光下本身具有荧光性质，且 在与胆固醇作用后还能进一步增强其本身荧光强度的巯基β-环糊精-金纳米 簇及其制备方法和应用。

本发明所述的巯基β-环糊精-金纳米簇(在本申请中也简称为CD-AuNCs 或金纳米簇)，它是由氯金酸或氯金酸盐和单(6-巯基-6-去氧)β-环糊精 (SH-β-CD)在水中，加入氢氧化钠，在加热条件下反应制得；该巯基β-环糊精 -金纳米簇的水溶液在自然光下呈黄色透明溶液，在365nm紫外光照射下发出 绿色荧光。

对本发明所述巯基β-环糊精-金纳米簇的形貌进行了表征(采用透射电 镜)，发现该巯基β-环糊精-金纳米簇为圆球形颗粒，其粒径＜5nm，呈分散的 状态。进一步≤4nm，通常为2.8±1.1nm，呈分散的状态。

本发明所述巯基β-环糊精-金纳米簇的制备方法，包括以下步骤：将氯金 酸或氯金酸盐以及单(6-巯基-6-去氧)β-环糊精溶于水中，加入氢氧化钠使体 系的pH＝7.4～8.0，升温至80～90℃反应，得到巯基β-环糊精-金纳米簇的水溶 液(在本申请中也简称为CD-AuNCs溶液)。

上述制备方法中，所述的氯金酸为四氯金酸三水合物，所述的氯金酸盐 可以是选自氯金酸钠、氯金酸钾、四硝酸基合金钾和四硝酸基合金钠中的一 种或两种以上的组合。

上述制备方法中，可以将氯金酸或氯金酸盐与单(6-巯基-6-去氧)β-环糊 精分别用水溶解后再混合在一起，氢氧化钠通常以水溶液的形式加入。所述 氯金酸或氯金酸盐与单(6-巯基-6-去氧)β-环糊精的摩尔比优选为1：8～11，更 优选为1：8～9，最优选为1：8。

上述制备方法中，为了使获得的巯基β-环糊精-金纳米簇具有更高的荧光 强度，优选反应是在85～90℃条件下进行，最优选是在90℃条件下进行。对 于反应的时间，优选≥2h。申请人的试验结果表明，在一定时间范围内，所 得环糊精-金纳米簇随着反应时间的增加而增强。当反应的时间为4h时，所 得环糊精-金纳米簇的荧光强度达到最大，因此，本申请中优选反应时间为4h。

进一步的，本发明所述巯基β-环糊精-金纳米簇的制备方法还包括对得到 的巯基β-环糊精-金纳米簇的水溶液进行纯化的步骤，具体是将巯基β-环糊精 -金纳米簇的水溶液进行透析，然后将透析液冷冻干燥，得到巯基β-环糊精- 金纳米簇。在进行透析时，优选选用截留分子量为35kDa的透析袋进行透析。

申请人在试验中发现，本发明所述巯基β-环糊精-金纳米簇在与胆固醇溶 液接触反应后，巯基β-环糊精-金纳米簇的荧光增强，基于该荧光增强作用， 可建立起胆固醇的测量方法。因此，本发明还包括上述巯基β-环糊精-金纳米 簇在检测胆固醇含量中的应用。具体在检测胆固醇时，以pH＝6.4的PBS缓 冲液为分散剂。在检测时的体系中，巯基β-环糊精-金纳米簇在体系中的浓度 优选为1.9×10^-5～5.8×10^-5mol·L^-1(以Au计算)。

与现有技术相比，本发明提供了一种在紫外光下本身就具有荧光性质的 巯基β-环糊精-金纳米簇及其制备方法，而且在将该巯基β-环糊精-金纳米簇 与胆固醇接触作用后，还能进一步增强环巯基β-环糊精-金纳米簇的荧光强 度，可以用于人血清中胆固醇含量的检测，而且抗干扰能力强、灵敏度高， 胆固醇浓度在10.0～100.0μmol·L^-1时，胆固醇浓度与巯基β-环糊精-金纳米簇 的荧光增强程度呈线性关系，检测限为5.77μmol·L^-1(S/N＝3)。

附图说明

图1为本发明制备CD-AuNCs溶液的实验原理图。

图2为本发明制备的CD-AuNCs溶液在自然光与365nm紫外光下的性状 和CD-AuNCs的HRTEM图；其中，(a)为自然光下的CD-AuNCs溶液；(b) 为365nm紫外光下的CD-AuNCs溶液；(c)为CD-AuNCs的HRTEM图。

图3为本发明制备的CD-AuNCs溶液的紫外吸收光谱和荧光光谱、 SH-β-CD和CD-AuNCs的红外光谱图；其中(a)为CD-AuNCs溶液的紫外吸收 光谱；(b)为CD-AuNCs溶液的荧光光谱；(c)为SH-β-CD和CD-AuNCs固体 的红外吸收光谱图；(d)为CD-AuNCs固体的XPS图；(e)为CD-AuNCs中Au 元素的分峰拟合图。

图4为加入胆固醇前、后CD-AuNCs溶液的荧光光谱。

图5为反应时间对CD-AuNCs溶液合成的影响关系图；其中，(a)为反应 时间对CD-AuNCs溶液合成影响的荧光光谱图；(b)为反应时间对CD-AuNCs 溶液合成影响的折线图。

图6为反应温度对CD-AuNCs溶液合成的影响关系图；其中，(a)为反应 温度对CD-AuNCs溶液合成影响的荧光光谱图；(b)为反应温度对CD-AuNCs 溶液合成影响的柱状图。

图7为SH-β-CD用量对CD-AuNCs溶液合成的影响关系图；其中，(a) 为SH-β-CD用量对CD-AuNCs溶液合成影响的荧光光谱图；(b)为SH-β-CD 用量对CD-AuNCs溶液合成影响的折线图。

图8为不同稀释倍数CD-AuNCs溶液与胆固醇荧光响应关系图。

图9为pH对CD-AuNCs溶液与胆固醇荧光响应的影响关系图(C_胆固醇＝1.0 mg·mL^-1)。

图10为温度对CD-AuNCs溶液与胆固醇荧光响应的影响关系图(C_胆固醇 ＝1.0mg·mL^-1)。

图11为CD-AuNCs溶液与胆固醇反应平衡时间的荧光响应图(C_胆固醇＝1.0 mg·mL^-1)。

图12为CD-AuNCs溶液对不同浓度胆固醇的响应图。

图13为胆固醇测定的标准曲线。

图14为CD-AuNCs溶液以及CD-AuNCs溶液与胆固醇包合物的时间分 辨荧光寿命图；其中(a)为CD-AuNCs溶液的时间分辨荧光寿命图；(b)为 CD-AuNCs溶液与胆固醇包合物的时间分辨荧光寿命图。

图15为干扰物对CD-AuNCs溶液与胆固醇荧光响应的影响柱状图。

具体实施方式

为了更好的解释本发明的技术方案，下面结合实施例及附图对本发明作 进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例 中所用的技术特征可以替换为具有在不背离发明构思前提下等同或相似功能 或效果的其他本领域已知的技术特征。

实施例1

1.实验部分

1.1主要仪器和试剂

实验所用试剂均为分析纯试剂，SH-β-CD购自山东滨州智源生物科技有 限公司，胆固醇购自上海麦克林公司，四氯金酸三水合物购自上海思域化工 科技有限公司，其余试剂购自阿拉丁试剂公司，实验用水为超纯水。

荧光测定在F-4600(日立高新技术公司)荧光分光光度计上进行。 CD-AuNCs的形貌在JEOL 2100高分辨透射电镜上测定(HRTEM)，超薄碳膜 铜网，加速电压为200kV。CD-AuNCs的荧光寿命在FLS1000稳态瞬态荧光 光谱仪上测定。

胆固醇溶液(2.58×10^-4M)的配制：称取10.0mg胆固醇固体，用少量的曲 拉通溶解，再加入无水乙醇定容到10.0mL。

1.2CD-AuNCs的制备及纯化

CD-AuNCs的制备：采用还原法合成，具体合成步骤如下：所有玻璃器 皿用新鲜配制的王水浸泡洗涤干净，将水浴温度调至90℃，取5.0mL的 HAuCl₄·3H₂O水溶液(1.0mM，90℃)剧烈搅拌10min，加入2.0mL单(6-巯基 -6-去氧)倍他环糊精溶液(20.0mM，90℃)。搅拌5min后，加入1.5ml氢氧化 钠水溶液(1.0mol·L^-1)，随后用铝膜封住瓶口，反应4h，溶液为黄色澄清液体， 在紫外灯下(365nm)可观察到很强的绿色荧光，表明得到了绿光的CD-AuNCs 溶液。溶液中CD-AuNCs的浓度为5.8×10^-4mol·L^-1。

CD-AuNCs的纯化：将CD-AuNCs溶液放入截留分子量为35KDa的透 析袋在蒸馏水中进行透析2天，4小时换一次蒸馏水。透析后的溶液冷冻干 燥，4℃保存。

1.3胆固醇的测定

取50.0μL一定浓度的胆固醇溶液加入CD-AuNCs溶液中，使之反应 8min，在370nm的激发光下，通过测量加入胆固醇前、后CD-AuNCs的荧光 强度(458nm)来实现胆固醇的测定。

2.实验结果与讨论

2.1实验原理

CD-AuNCs采用一锅法合成。以SH-β-CD为氯金酸的还原剂，在90℃ 水浴4h可以得到CD-AuNCs。金簇通过金硫键被巯基化合物所保护，这样的 结构可以使金簇结构更稳定。胆固醇测定采用的是荧光法，金簇外面包裹着 的环糊精基团作为胆固醇的识别单元。环糊精是中空锥形内疏水外亲水的结 构，对胆固醇有良好的包合作用，可以将胆固醇包合在其空腔中，使 CD-AuNCs的荧光增强(如图1)。利用这个原理，以CD-AuNCs作为荧光探针， 构建胆固醇的荧光测量方法。

2.2CD-AuNCs的制备与表征

CD-AuNCs溶液在自然光与365nm紫外光下的性状如图2所示。 CD-AuNCs溶液在自然光下为黄色透明的溶液(图2a)，在365nm紫外光照射 下呈绿色荧光(图2b)；制备得到的CD-AuNCs具有良好的荧光性能。采用 HRTEM对CD-AuNCs的形貌进行了表征，结果显示CD-AuNCs为圆球形颗 粒，其粒径约为2.8±1.1nm，呈分散的状态(图2c)。

CD-AuNCs和SH-β-CD的紫外吸收光谱及荧光光谱如图3a和3b所示。 CD-AuNCs的紫外吸收峰在200～300nm且是单峰，并且在300～500nm没有 紫外吸收峰，说明合成的是金纳米簇而不是大颗粒的金纳米粒子。CD-AuNCs 的紫外吸收峰比SH-β-CD的紫外吸收峰要高，峰的位置大致相同，说明巯基 环糊精已结合到金原子上。CD-AuNCs的最大激发和发射波长分别位于370 nm和458nm。由CD-AuNCs的紫外吸收峰、激发峰、发射峰的位置情况可 以判断成功合成了CD-AuNCs。

CD-AuNCs和SH-β-CD的傅里叶红外光谱如图3c所示，可看出SH-β-CD 和CD-AuNCs的红外光谱波形相似，这表明在合成CD-AuNCs的过程中保留 了巯基环糊精大部分的特征基团。SH-β-CD环振动的吸收特征峰分别在 946.84、707.07、579.56cm^-1处，O-H的伸缩振动在3385.26cm^-1，-CH₂伸缩 振动为2928.39cm^-1。CD-AuNCs在1601.20cm^-1出现了一个新的吸收峰，对 应SH-β-CD还原Au形成的Au-COO^-峰，-OH的特征峰位置从3385.26cm^-1到3442.42cm^-1并且峰变得比原来宽，说明环糊精的羟基可以作为还原基团将 Au³⁺离子还原为金属Au⁰。

CD-AuNCs的XPS图谱在532.19eV、285.02eV出现两个强的吸收峰，分 别是O1s、C1s的特征峰，如图3d所示。结合能在88.9eV处的拟合峰为 Au(Ⅲ)4f_5/2，结合能在85.2eV处的拟合峰为Au(Ⅲ)4f_7/2；结合能在88.0eV处 的拟合峰为Au(0)4f_5/2，结合能在84.4eV处的拟合峰为Au(0)4f_7/2，具体如图 3e所示，因此我们推测金的价态是Au(0)、Au(Ⅲ)。CD-AuNCs中各元素的质 量百分数分别是O1s为39.47％、C1s为59.29％、S2p为1.18％、Au4f为0.07％。

2.3胆固醇对CD-AuNCs的荧光增强作用

为了考查CD-AuNCs与胆固醇之间是否存在相互作用，取1.0mL CD-AuNCs稀释液，向其中加入50.0μL浓度为1.0mg·mL^-1的胆固醇溶液并充 分反应，图4为胆固醇加入前、后金纳米簇的荧光光谱。很显然，与胆固醇 作用后，金纳米簇探针的荧光增强，基于该荧光增强作用，可建立起胆固醇 的测量方法，实现了荧光探针的设计目的。

2.4CD-AuNCs制备条件的优化

2.4.1反应时间对CD-AuNCs合成的影响

反应时间不同，CD-AuNCs的生成数量及聚集程度也会不同，从而影响 CD-AuNCs的荧光性能。实验研究了从1h到7h的合成时间对CD-AuNCs 荧光性能的影响，结果如图5所示。反应时间小于4h时，随反应时间的增加， 荧光强度增加，在2～3小时之间荧光基本不变，随后在4h达到最大值。说明 反应时间较短时，反应还未完成，CD-AuNCs的浓度较低，荧光较弱。反应 时间增加，生成的CD-AuNCs的浓度增加，荧光强度会随着反应时间的增加 而增强。当反应时间为4h时反应已经完成，荧光强度达到最大。当反应时 间继续增加时，CD-AuNCs的荧光强度反而降低，有可能是少部分金纳米簇 聚集导致荧光强度下降。CD-AuNCs制备的最佳反应时间为4h。

2.4.2反应温度对CD-AuNCs合成的影响

高温是合成CD-AuNCs的必要条件。反应温度主要影响环糊精与氯金酸 之间氧化还原的速度和晶粒的聚集。当反应温度分别80℃、90℃、100℃ 时，得到的CD-AuNCs溶液的荧光光谱与强度结果如图6所示。随着温度的 升高CD-AuNCs的荧光强度先增强后减弱。温度升高，CD-AuNCs生成数量 增加导致荧光增强，而温度过高有可能会导致金纳米粒子聚集使荧光减弱。 CD-AuNCs合成的最佳温度是90℃。

2.4.3SH-β-CD用量对CD-AuNCs合成的影响

SH-β-CD在CD-AuNCs的合成中起还原剂和稳定剂的作用，因此 SH-β-CD的用量在合成CD-AuNCs过程中起着重要作用。本实验研究了 HAuCl₄：SH-β-CD摩尔比从1：5到1：11时不同SH-β-CD用量对CD-AuNCs 合成的影响。从图7可知，随着HAuCl₄与SH-β-CD的摩尔比增加，CD-AuNCs 的荧光强度先升高后降低。SH-β-CD的量较少时，没有足够的还原剂，生成CD-AuNCs较少，荧光强度也较弱。随着SH-β-CD的量增加后，更多的氯金 酸被还原，纳米簇的生成量增大，荧光增强。当SH-β-CD的量继续增加，CD-AuNCs的荧光强度下降，有可能是大颗粒的金纳米粒子聚集导致荧光强 度下降。HAuCl₄与SH-β-CD的摩尔比为1：8时，CD-AuNCs的荧光强度达 到最大，即CD-AuNCs合成的HAuCl₄与SH-β-CD的最佳摩尔比为1：8。

2.5CD-AuNCs与胆固醇荧光响应条件优化

2.5.1CD-AuNCs浓度对胆固醇荧光响应的影响

为了探究CD-AuNCs浓度对胆固醇荧光响应的影响，将CD-AuNCs溶液 用pH＝6.4的PBS分别稀释到不同的倍数，取1.0mLCD-AuNCs溶液加入 50.0μL 1.0mg·mL^-1的胆固醇溶液，分别测定反应前、后的荧光强度F0和F1， 结果如图8所示。随着稀释倍数的增加，F0及F1的值均下降，稀释30倍以 后荧光值基本不变。胆固醇所引起的荧光增强值ΔF＝F1-F0则先增强后降低。 稀释倍数较小时，CD-AuNCs存在内滤效应，导致CD-AuNCs与胆固醇的荧 光强度比较低。稀释倍数增大后，内滤效应的影响较小，CD-AuNCs能包合 的胆固醇的数量增多，荧光强度增加。稀释倍数20倍的CD-AuNCs与胆固 醇的荧光强度达到最大，所以CD-AuNCs最佳稀释倍数是20倍。之后 CD-AuNCs的稀释倍数再增大，CD-AuNCs与胆固醇的荧光强度下降，是因 为CD-AuNCs的浓度下降，包合的胆固醇的数量减少，导致荧光强度减弱。

2.5.2pH对CD-AuNCs与胆固醇荧光响应的影响

pH可能会对CD-AuNCs与胆固醇的荧光响应产生影响，合适的pH有利 于提高检测的灵敏度。为了探究pH对CD-AuNCs与胆固醇荧光响应的影响， 用不同pH值的PBS分别稀释CD-AuNCs到最佳稀释倍数，测量CD-AuNCs 与胆固醇作用前后的荧光强度记F0、F1，结果如图9所示。在pH＝6.4条件 下CD-AuNCs与胆固醇的荧光增强作用最明显，说明pH＝6.4是CD-AuNCs 与胆固醇响应的最佳pH。CD-AuNCs与胆固醇在酸性条件下比碱性条件下要 灵敏，有可能是酸性条件更有利于环糊精包合胆固醇。

2.5.3温度对CD-AuNCs与胆固醇荧光响应的影响

为了探究温度对CD-AuNCs与胆固醇荧光响应的影响，根据以上得到的 CD-AuNCs与胆固醇响应的最佳条件，来进行温度影响的探究。利用高精度 超级恒温水浴锅来控制测量温度，等待温度到达设定值，测量CD-AuNCs与 胆固醇作用前后的荧光强度记F0、F1，结果如图10所示。当温度位于20-25℃ 之间时，CD-AuNCs体系的荧光值F0基本不变，而CD-AuNCs-胆固醇体系 的荧光强度F1略有增大。随着温度的升高(>25℃)，两个体系的荧光值均 呈现线性下降趋势。胆固醇对CD-AuNCs荧光增强最佳温度为25℃。温度 升高，阻碍了CD-AuNCs包合胆固醇，不利于包合物的生成，导致CD-AuNCs 与胆固醇的荧光强度下降。

2.5.4CD-AuNCs与胆固醇的荧光响应平衡时间

为了获得稳定的荧光信号，研究了CD-AuNCs与胆固醇之间的包合反应 时间对荧光响应的影响，结果如图11所示。平衡时间为了探究CD-AuNCs 与胆固醇反应平衡时间对荧光响应的影响，根据以上得到的CD-AuNCs与胆 固醇响应的最佳条件，来进行平衡时间影响的探究。用最佳pH＝6.4的PBS 稀释CD-AuNCs，设定温度为25℃，测定不同反应时间，体系的荧光强度F， 结果如图11所示。随着反应时间延长，CD-AuNCs-胆固醇溶液体系的荧光强 度不断增强，到4min后达到最大值，4min后溶液的荧光强度略有降低，到 8min后荧光强度保持基本不变。因此CD-AuNCs与胆固醇的最佳响应平衡 时间为8min。刚开始随着时间增加，CD-AuNCs能结合的胆固醇增加，荧光 强度增强。但当CD-AuNCs已经结合足够多的胆固醇达到饱和，反应时间再 增加CD-AuNCs与胆固醇的荧光强度不再变化。

2.6CD-AuNCs对胆固醇的荧光响应性能

2.6.1标准曲线

为了建立CD-AuNCs的增强与胆固醇浓度之间的定量关系，在 10.0～130.0μmol·L^-1浓度范围内分别配制了13个不同浓度的胆固醇溶液。取 50.0μL上述浓度的胆固醇滴加在1.0mL的pH＝6.4CD-AuNCs溶液中，反应 温度25℃，反应时间8min，然后测量其荧光发射光谱(图12)。得到了 CD-AuNCs的荧光增强F1/F0(F1、F0分别为胆固醇加入前后体系的荧光强度) 与胆固醇浓度之间的线性关系(图13)。

不同浓度的胆固醇对CD-AuNCs的荧光响应程度是不同的。随着胆固醇 浓度的升高，CD-AuNCs的荧光强度不断增强后达到稳定。胆固醇浓度在 10.0～100.0μmol/L时，胆固醇浓度与CD-AuNCs荧光强度呈线性关系，胆固 醇浓度再继续增大，荧光增强已达饱和，不呈线性关系。CD-AuNCs荧光增 强F1/F0与胆固醇浓度的标准曲线拟合方程为y＝0.0055x+0.9837，相关系数 R²＝0.98。根据标准曲线来计算检测限，得到检测限为5.77μmol·L^-1(S/N＝3)。 2.6.2CD-AuNCs与胆固醇荧光响应的机理讨论

本文的实验结果表明胆固醇可以使CD-AuNCs的荧光增强，荧光增强的 机理可归结为胆固醇-环糊精包合物的形成。环糊精内疏外亲水的空腔结构对 固醇类物质有很好的包合作用。金纳米簇所结合的β-环糊精作为胆固醇的识 别单元，通过主客体识别作用包合胆固醇，CD-AuNCs通过胆固醇分子连结 起来，导致CD-AuNCs的平面刚性结构增强，从而使CD-AuNCs的荧光增强。

CD-AuNCs和CD-AuNCs与胆固醇包合物的荧光寿命如图14a和14b 所示。在370nm的激发波长下，458nm发射波长，测得CD-AuNCs的平 均荧光寿命为4.02±0.05ns，量子产率为0.36％；CD-AuNCs与胆固醇包 合物的平均荧光寿命为3.97±0.09ns。CD-AuNCs和CD-AuNCs与胆固醇 包合物的平均荧光寿命基本相同，证明CD-AuNCs与胆固醇结合使 CD-AuNCs荧光增强的过程是一个静态的过程。

2.6.3不同干扰物对CD-AuNCs与胆固醇荧光响应的影响

人血清中不只含有胆固醇还含有其他物质，为了检测出血清中胆固醇的 含量，需要做选择性实验。本次实验检测了11种物质对CD-AuNCs与胆固醇 荧光响应的影响。配制100.0mg·mL^-1葡萄糖、谷胱甘肽、果糖、半乳糖、多 巴胺、组氨酸、尿素、半胱氨酸、抗坏血酸、尿酸、苯丙氨酸，反应温度为 25℃，用pH＝6.4的PBS来稀释CD-AuNCs，取1mL稀释后的CD-AuNCs 测量其荧光强度记为F0，加入50.0μL 1mg·mL^-1的胆固醇溶液和等体积的干 扰物，测量其荧光强度记为F1。以F1/F0为纵坐标，以不同干扰物为横坐标， 建立不同干扰物对CD-AuNCs与胆固醇荧光响应影响的柱状图，结果如图15 所示。这11种干扰物基本不影响CD-AuNCs与胆固醇的荧光响应。CD-AuNCs 探针对胆固醇响应的高选择性主要源于环糊精空腔对客体分子的形状、大小 和极性等所具有的选择性。

2.7血清样品中胆固醇的测定

为了检验本方法的适用性，对人血清样本中的胆固醇浓度进行了测定。 血清样品由桂林市当地医院提供，血清总胆固醇的含量由医院采用酶法测定。 取10.0μL血清加入到1.0mL pH＝6.4稀释20倍的CD-AuNCs溶液(以前述1.2 中制备的CD-AuNCs溶液为基础稀释20倍)中，测量其荧光强度，再加入已 知浓度的胆固醇标准溶液，测量其荧光强度，分别计算浓度及回收率，结果 如表1所示。对于3个样品，加标回收率位于102.4％～104.6％之间，结果良 好，表明该方法具有较好的适用性。

表1血清样品中胆固醇的测定(n＝3)

*酶法获得结果.

3.结论

以HAuCl₄为前驱体，SH-β-CD为保护剂和还原剂合成了具有绿色荧光 的CD-AuNCs。并优化了CD-AuNCs的合成时间、合成温度、SH-β-CD用量， 以得到荧光性能最优的CD-AuNCs。以CD-AuNCs作为荧光探针，环糊精空 腔作为胆固醇的选择性识别单元，由于环糊精-胆固醇包合物的形成，增强了 金纳米簇平面结构的刚性，使其荧光增强。根据荧光增强效应，实现了对胆 固醇的荧光测定。该探针制备简单、响应迅速、灵敏度高、线性范围宽，适 于测定低浓度胆固醇的测定,人血清中的常见共存组分不干扰胆固醇的测定。 将该方法应用于实际血清中胆固醇的测定，结果良好。

Claims (9)

1.一种巯基β-环糊精-金纳米簇，其特征是，该巯基β-环糊精-金纳米簇是由氯金酸或氯金酸盐和单(6-巯基-6-去氧)β-环糊精在水中，加入氢氧化钠，在加热条件下反应制得；所述巯基β-环糊精-金纳米簇的水溶液在自然光下呈黄色透明溶液，在365nm紫外光照射下发出绿色荧光。

2.根据权利要求1所述的巯基β-环糊精-金纳米簇，其特征是，该巯基β-环糊精-金纳米簇为圆球形颗粒，其粒径＜5nm。

3.权利要求1所述巯基β-环糊精-金纳米簇的制备方法，其特征是，包括以下步骤：将氯金酸或氯金酸盐以及单(6-巯基-6-去氧)β-环糊精溶于水中，加入氢氧化钠使体系的pH＝7.4～8.0，升温至80～90℃反应，得到巯基β-环糊精-金纳米簇的水溶液。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是，还包括纯化步骤，具体是将巯基β-环糊精-金纳米簇的水溶液进行透析，然后将透析液冷冻干燥，得到巯基β-环糊精-金纳米簇。

5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征是，反应在85～90℃条件下进行。

6.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征是，反应在90℃条件下进行。

7.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征是，反应的时间≥2h。

8.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征是，反应的时间为4h。

9.权利要求1所述的巯基β-环糊精-金纳米簇在检测胆固醇含量中的应用。

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