CN107782704B - 基于近红外荧光探针铜纳米簇的叶酸检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开基于近红外荧光探针铜纳米簇的叶酸检测方法，通过绿色合成方法合成卵清蛋白包覆的近红外荧光铜纳米簇，铜纳米簇作为荧光探针，叶酸作为荧光猝灭剂，由于铜纳米簇与叶酸间的静态猝灭作用，叶酸呈线性猝灭荧光探针铜纳米簇荧光强度。本发明检测叶酸的线性范围为0.5‑200μM，检出限为0.2μM。使用的探针铜纳米簇具有无毒、价格低廉、性能稳定、生物相容性等优点，检测方法成本低廉、操作简单、灵敏度高，具有巨大的潜在应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物分析检测技术领域，涉及一种近红外荧光探针铜纳米簇的绿色合成方法对其及对生物小分子叶酸的检测应用。
背景技术
叶酸，作为维生素B族的一种，是生命体内重要的底物和辅酶。缺少叶酸会诱发贫血、白血球减少症、心智发展不足、精神病等等。然而，强化途径摄入过量的叶酸会引起维生素B-12缺乏，进而增加老年人患神经性疾病的概率。所以，发展专一性好，灵敏度高，操作简单的定量检测方法具有重要的意义。目前叶酸的定量检测方法主要有电化学法、高效液相色谱、流动注射化学发光法、分光光度计法和荧光方法。这些方法当中，以叶酸的电化学检测容易收到维生素C的干扰，这是因为维生素C的氧化还原点位与叶酸的比较相近，氧化的维生素C容易附着在电极上影响叶酸的测定。此外，在大多数视频当中维生素C的含量旺旺有远大于也算的含量，这更干扰对叶酸的检测。所以，开发更加简单、具有高选择性和灵敏度的叶酸探针十分重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供基于近红外荧光探针铜纳米簇的叶酸检测方法，水溶的、无毒性的、荧光寿命长的、易储存的、近红外的荧光铜纳米簇合成方法且在室温下利用荧光强度变化对溶液中糖蛋白的操作简单、反应快速、成本低廉、高灵敏度和高选择性的检测方法。
本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现：
基于近红外荧光探针铜纳米簇的叶酸检测方法，以磷酸缓冲水溶液(PBS)、铜纳米簇分散体系和待测样品组成叶酸检测体系，检测加入待测样品前后的荧光强度变化，对比标准曲线，得到待测样品中叶酸的含量，线性方程为F0/F＝1.0589+0.0098C，F0为不加入叶酸时的荧光强度检测值，F为加入叶酸后的荧光强度检测值，C为叶酸浓度。
上述检测方法中，检出限为0.20μM，检测范围为0.50-200μM。
上述检测方法中，磷酸缓冲水溶液(PBS)浓度为0.01mol/L，25℃，pH＝7.4。
上述检测方法中，磷酸缓冲水溶液3.1mL、铜纳米簇分散体系0.8mL和待测样品100μL组成叶酸检测体系4.0mL。
铜纳米簇分散体系，以卵清蛋白为保护剂，水合肼为还原剂的铜纳米簇，按照下述步骤进行制备
步骤1，称取60-160mg卵清蛋白溶解于装有3-8mL高纯水的烧杯中；
步骤2，向步骤1得到的溶液中加入0.02-0.18mL的0.1M氯化铜溶液，室温条件下搅拌8-12min；
步骤3，向步骤2得到的溶液中加入0.1-1.5mL水合肼水溶液，其中水合肼的质量百分数为80％后，向其中加入高纯水至8-20mL,并在室温条件下搅拌2-5h后，即得到铜纳米簇分散体系。
在制备后，使用截留分子量为6000-8000，直径为25mm透析袋对步骤3制得铜纳米簇进行纯化，每3-5h换一次高纯水，透析20-30h，待透析完成后将纯化的铜纳米簇在真空条件下30-40℃干燥后，得到在340nm光的激发下，发射在625nm近红外荧光探针铜纳米簇。
在步骤3中，水合肼的滴加速度为0.05-0.1mL/min，高纯水的加入速度为0.5-1mL/s。
纯化条件为每4h换一次高纯水，透析24h，待透析完成后将纯化的铜纳米簇在真空条件下35℃干燥。
制备的铜纳米簇粒径集中在1.8—2nm，铜纳米簇分布在卵清蛋白基体上，即铜离子与蛋白表面的氨基、羟基等功能基团进行配位，在水合肼作用下实现原位还原形成纳米铜簇。
在进行标准曲线的检测中，按照下述步骤进行：
步骤1，配置0.01mol/L，25℃，pH＝7.4磷酸缓冲水溶液；
步骤2，配置一系列浓度叶酸溶液
40mmol·L-1叶酸溶液：称取0.0883g叶酸溶于高纯水中，定容5.0mL；以40mmol·L-1叶酸溶液稀释配制0.1mM、0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM、2.0mM、3.0mM、4.0mM、6.0mM、10.0mM、14.0mM、16.0mM、20.0mM、26.0mM、30.0mM、36mM、40.0mM的叶酸溶液，对应4.0mL检测体系叶酸浓度分别为0.5μM、1.0μM、2.0μM、3.0μM、4.0μM、5.0μM、10.0μM、15.0μM、20.0μM、30.0μM、50.0μM、70.0μM、80.0μM、100.0μM、130.0μM、150.0μM、180.0μM、200.0μM；
步骤3，移取0.01mol/L PBS溶液3.1mL，加入0.8mL铜纳米簇分散体系，再加入100μL叶酸溶液，使用荧光光度计检测叶酸检测体系中添加叶酸前后的荧光强度，根据荧光强度相对变化建立标准曲线。
与现有技术相比，本发明公开了一种用水合肼作还原剂的铜纳米簇制备方法，此制备方法制得的铜纳米簇具有良好水溶性好、无毒性、尺寸较小且均匀，在水溶液中且较为稳定。本发明所提供的制备方法制备的铜纳米簇制备具有良好的生物相容性，形成一种近红外荧光探针。本发明合成出的铜纳米簇可以发展成为一种指示生物体系生物小分子叶酸的近红外荧光探针。并将其应用于实际样品中，根据铜纳米簇的荧光强度检测出样品中的叶酸含量。
附图说明
图1是本发明制备的铜纳米簇的透射电子显微镜图(TEM)。
图2是本发明制备的铜纳米簇的紫外可见吸收光谱图(UV-Vis)。
图3是本发明制备的铜纳米簇的圆二色光谱图(CD)。
图4是本发明制备的铜纳米簇的荧光谱图。
图5是利用铜纳米簇检测叶酸的线性范围示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。本发明所述的高纯水购买于哇哈哈纯净水，所述的透析袋(截留分子量6000-8000，直径25mm)购买于北京普博生物科技有限公司，叶酸购买于北京索莱宝科技有限公司，卵清蛋白购买于天津市韵尼科技有限公司，水合肼购买于天津市光复精细化工研究所，其他无机试剂均购买于天津市科威有限公司。
实施例1铜纳米簇的合成及纯化
(1)称取100mg卵清蛋白溶解于装有5mL高纯水的烧杯中；
(2)向步骤(1)得到的溶液中加入0.02mL的0.1M氯化铜溶液，室温搅拌10min；
(3)向步骤(2)得到的溶液中慢慢注射0.1mL 80％水合肼(w/w)，快速补水至8mL,再在室温搅拌1h，待溶液呈现淡黄色，说明铜纳米簇的生成；
(4)纯化：用截留分子量6000-8000，直径25mm透析袋对制得铜纳米簇进行纯化，每4h换一次高纯水，透析24h，待透析完成后将纯化的铜纳米簇真空35℃干燥，得到在340nm光的激发下，发射在625nm近红外区域的荧光铜纳米簇。
实施例2铜纳米簇的合成及纯化
(1)称取100mg卵清蛋白溶解于装有5mL高纯水的烧杯中；
(2)向步骤(1)得到的溶液中加入0.10mL的0.1M氯化铜溶液，室温搅拌10min；
(3)向步骤(2)得到的溶液中慢慢注射0.5mL 80％水合肼(w/w)，快速补水至15mL,再在室温搅拌3h，待溶液呈现淡黄色，说明铜纳米簇的生成；
(4)纯化：用截留分子量6000-8000，直径25mm透析袋对制得铜纳米簇进行纯化，每4h换一次高纯水，透析24h，待透析完成后将纯化的铜纳米簇真空35℃干燥，得到在340nm光的激发下，发射在625nm近红外区域的荧光铜纳米簇。
实施例3铜纳米簇的合成及纯化
(1)称取100mg卵清蛋白溶解于装有5mL高纯水的烧杯中；
(2)向步骤(1)得到的溶液中加入0.18mL的0.1M氯化铜溶液，室温搅拌10min；
(3)向步骤(2)得到的溶液中慢慢注射1.0mL 80％水合肼(w/w)，快速补水至20mL,再在室温搅拌4h，待溶液呈现淡黄色，说明铜纳米簇的生成；
(4)纯化：用截留分子量6000-8000，直径25mm透析袋对制得铜纳米簇进行纯化，每4h换一次高纯水，透析24h，待透析完成后将纯化的铜纳米簇真空35℃干燥，得到在340nm光的激发下，发射在625nm近红外区域的荧光铜纳米簇。
实施例4铜纳米簇的合成及纯化
(1)称取100mg卵清蛋白溶解于装有5mL高纯水的烧杯中；
(2)向步骤(1)得到的溶液中加入0.10mL的0.1M氯化铜溶液，室温搅拌10min；
(3)向步骤(2)得到的溶液中慢慢注射1.3mL 80％水合肼(w/w)，快速补水至20mL,再在室温搅拌4h，待溶液呈现淡黄色，说明铜纳米簇的生成；
(4)纯化：用截留分子量6000-8000，直径25mm透析袋对制得铜纳米簇进行纯化，每4h换一次高纯水，透析24h，待透析完成后将纯化的铜纳米簇真空35℃干燥，得到在340nm光的激发下，发射在625nm近红外区域的荧光铜纳米簇。
实施例5铜纳米簇的合成及纯化
(1)称取100mg卵清蛋白溶解于装有5mL高纯水的烧杯中；
(2)向步骤(1)得到的溶液中加入0.10mL的0.1M氯化铜溶液，室温搅拌10min；
(3)向步骤(2)得到的溶液中慢慢注射1.0mL 80％水合肼(w/w)，快速补水至15mL,再在室温搅拌3h，待溶液呈现淡黄色，说明铜纳米簇的生成；
(4)纯化：用截留分子量6000-8000，直径25mm透析袋对制得铜纳米簇进行纯化，每4h换一次高纯水，透析24h，待透析完成后将纯化的铜纳米簇真空35℃干燥，得到在340nm光的激发下，发射在625nm近红外区域的荧光铜纳米簇。
利用透射电镜对制备的铜纳米簇进行表征(几组实施例表现出基本一致的性质)，如附图1所示，粒径集中在1.8—2nm。使用圆二色光谱(Jasco J-715spectropolarimeter，Jasco,Japan)和日本岛津公司紫外分光光度计UV-2600进行测试，如附图2和3所示，卵清蛋白和铜纳米簇的紫外吸收峰分别为273nm和279nm，结合透射电镜形貌可知在卵清蛋白基体上成功合成铜纳米簇，即铜纳米簇分布在卵清蛋白基体上(即铜离子与蛋白表面的氨基、羟基等功能基团进行配位，在水合肼作用下实现原位还原形成纳米铜簇)。使用美国安捷伦荧光光度计进行荧光测试，如附图4所示，铜纳米簇的激发波长为340nm，发射波长为625nm；在发射谱图中450nm得到卵清蛋白基体的发射信号。
实施例6近红外荧光探针铜纳米簇对溶液中叶酸进行检测
(1)溶液的配置
①0.01mol/L，25℃，pH＝7.4磷酸缓冲溶液(PBS)的配置：
取一片PBS片溶解于装有20mL高纯水的烧杯中，待溶解后用玻璃棒将PBS溶液转移到容量瓶中，高纯水洗涤烧杯三次，定容容量瓶体积为100mL。
②一系列浓度叶酸溶液配置：
40mmol·L-1叶酸溶液：称取0.0883g叶酸溶于高纯水中，定容5.0mL；以40mmol·L-1叶酸溶液稀释配制0.1mM、0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM、2.0mM、3.0mM、4.0mM、6.0mM、10.0mM、14.0mM、16.0mM、20.0mM、26.0mM、30.0mM、36mM、40.0mM的叶酸溶液，对应4.0mL检测体系叶酸浓度分别为0.5μM、1.0μM、2.0μM、3.0μM、4.0μM、5.0μM、10.0μM、15.0μM、20.0μM、30.0μM、50.0μM、70.0μM、80.0μM、100.0μM、130.0μM、150.0μM、180.0μM、200.0μM。
(2)检测方法：移取0.01mol/L PBS溶液3.1mL，加入0.8mL铜纳米簇，再加入100μL叶酸溶液，组成4.0mL叶酸检测体系，使用荧光光度计检测叶酸加入前后的荧光强度变化，根据其荧光强度的变化检测叶酸的量；在实施例制备的铜纳米簇分散体系中，分布在卵清蛋白上的铜纳米簇表现出荧光特性，但当加入叶酸后，叶酸作为淬灭剂使荧光强度下降，此时加入叶酸的多少直接影响荧光强度下降程度。
因此，以不同浓度的叶酸溶液分别与0.01mol/L PBS溶液3.1mL、0.8mL铜纳米簇分散体系形成4.0mL叶酸检测体系，测定叶酸溶液加入前后的荧光强度变化，根据荧光强度相对变化建立标准曲线；在实际检测中，将待测样品、0.01mol/L PBS溶液3.1mL、0.8mL铜纳米簇分散体系形成4.0mL叶酸检测体系，检测加入待测样品前后的荧光强度变化，对比标准曲线，得到待测样品中叶酸的含量。本方法的分析特征量如下表所示，说明了本方法有较宽的检测范围和较低的检出限：
其中F0为不加入叶酸时的荧光强度检测值，F为加入叶酸后的荧光强度检测值，如附图5所示，在叶酸浓度为10-170nM范围内，随着叶酸浓度的递增使得铜纳米簇的荧光强度呈线性递减。
(3)选用人体尿液样品进行检测
本实验所用的人体尿液样品均由身体健康的志愿者提供，所用的样品离心后稀释100倍后备用，没有经过其他的方法进行处理，分别在两组样品中添加配置的叶酸溶液，以使检测体系中叶酸浓度为20μM。
移取0.01mol/L PBS溶液3.1mL，加入0.8mL铜纳米簇分散体系，再加入100μL添加叶酸的人体尿液样品，用荧光光度计检测荧光强度，根据其荧光强度的变化检测实际样品中叶酸的量，如下表所示，说明了本方法可以用于实际样品中叶酸的高灵敏度检测。
本专利受到国家自然科学基金面上项目21375095、全国优秀博士学位论文作者专项资助资金FANEDD-201023、天津市应用基础研究计划重点项目12JCZDJC21700、天津市“131”创新型人才培养工程第一层次项目ZX110185的资助和天津师范大学博士基金(编号：52XB1510)。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
Claims (2)
1.基于近红外荧光探针铜纳米簇的叶酸检测方法，其特征在于，以磷酸缓冲水溶液(PBS)、铜纳米簇分散体系和待测样品组成叶酸检测体系，检测加入待测样品前后的荧光强度变化，对比标准曲线，得到待测样品中叶酸的含量，线性方程为F0/F＝1.0589+0.0098C，F0为不加入叶酸时的荧光强度检测值，F为加入叶酸后的荧光强度检测值，C为叶酸浓度，检出限为0.20μM，检测范围为0.50-200μM，磷酸缓冲水溶液3.1mL、铜纳米簇分散体系0.8mL和待测样品100μL组成叶酸检测体系4.0mL，磷酸缓冲水溶液浓度为0.01mol/L，25℃，pH＝7.4，铜纳米簇分散体系，以卵清蛋白为保护剂，水合肼为还原剂的铜纳米簇，按照下述步骤进行制备：
步骤1，称取60-160mg卵清蛋白溶解于装有3-8mL高纯水的烧杯中；
步骤2，向步骤1得到的溶液中加入0.02-0.18mL的0.1M氯化铜溶液，室温条件下搅拌8-12min；
步骤3，向步骤2得到的溶液中加入0.1-1.5mL水合肼水溶液，其中水合肼的质量百分数为80％后，向其中加入高纯水至8-20mL,并在室温条件下搅拌2-5h后，即得到铜纳米簇分散体系。
2.根据权利要求1所述的基于近红外荧光探针铜纳米簇的叶酸检测方法，其特征在于，在进行标准曲线的检测中，按照下述步骤进行：
步骤1，配置0.01mol/L，25℃，pH＝7.4磷酸缓冲水溶液；
步骤2，配置一系列浓度叶酸溶液
40mmol·L-1叶酸溶液：称取0.0883g叶酸溶于高纯水中，定容5.0mL；以40mmol·L-1叶酸溶液稀释配制0.1mM、0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM、2.0mM、3.0mM、4.0mM、6.0mM、10.0mM、14.0mM、16.0mM、20.0mM、26.0mM、30.0mM、36mM、40.0mM的叶酸溶液，对应4.0mL检测体系叶酸浓度分别为0.5μM、1.0μM、2.0μM、3.0μM、4.0μM、5.0μM、10.0μM、15.0μM、20.0μM、30.0μM、50.0μM、70.0μM、80.0μM、100.0μM、130.0μM、150.0μM、180.0μM、200.0μM；
步骤3，移取0.01mol/L PBS溶液3.1mL，加入0.8mL铜纳米簇分散体系，再加入100μL叶酸溶液，使用荧光光度计检测叶酸检测体系中添加叶酸前后的荧光强度，根据荧光强度相对变化建立标准曲线。
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