CN115975632B - 一种蓝光发射的磁性-荧光锰纳米簇探针及其合成方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以卵清蛋白为制备模板的具有蓝色荧光发射能力的新型磁性‑荧光锰纳米簇OVA‑Mn NCs及其合成方法与应用，属于化学合成和生物分析检测技术领域。该磁性‑荧光锰纳米簇具有良好的水溶性和稳定性，在具有荧光发射能力的同时具有一定的顺磁性，在荧光传感、生物分析与生物成像等领域具有广阔的应用前景。该锰纳米簇通过简便的水热合成方法制备，合成步骤简单、反应时间短，制备原料廉价易得。基于转铁蛋白对该锰纳米簇荧光强度的特征性猝灭作用，可实现对转铁蛋白的高灵敏分析检测。
Description
技术领域
本发明属于化学合成和生物分析检测技术领域，涉及一种新型蓝光发射的磁性-荧光锰纳米簇探针的合成方法及其对转铁蛋白检测的应用。
背景技术
金属荧光纳米簇(Fluorescent metal naonoclusters，FMNCs)是由几个至数百个金属原子在有机物模板分子上堆积而成的小的发光团簇，区别于没有荧光发射能力的体相金属材料和粒径较大的金属团簇。金属荧光纳米簇的粒径尺寸通常为1-10nm，这一较小的尺寸使其金属原子中的连续能带被分解成离散的电子能级。金属荧光纳米簇可以与光子相互作用，并通过其离散态电子能级之间的电子跃迁实现光子的吸收和发射，进而获得类似于有机分子的独特光学性质。与有机荧光染料、半导体量子点、上转化荧光纳米粒子等传统的荧光标记物相比，金属荧光纳米簇具有更小的粒径尺寸、较大的发光强度、优异的光稳定性、良好的生物相容性和较低的生物与环境毒性等优点，在生命分析与环境分析等领域具有更大的发展潜力与应用空间。
然而，国内外应用较为成熟的金属荧光纳米簇探针仅有Au NCs、Ag NCs、Cu NCs、Pt NCs四种，且无一例外都仅具有荧光发射性能不具备磁性能等其他性能。由于贵金属原材料的使用，现有的金属荧光纳米簇探针不仅制备与使用成本较高，且无法实现磁分离富集检测与磁共振成像等更深层次的应用，大大限制了金属荧光纳米簇材料的功能和应用范围。金属荧光纳米簇探针种类较少且功能单一，是当前制约本领域发展的一大瓶颈问题。要突破上述瓶颈，拓展金属荧光纳米簇材料的种类与功能，就必须发展新型过渡金属荧光纳米簇。相较于金、银等贵金属元素，锰元素来源广泛、廉价易得，且具有顺磁性质，是发展多功能磁性-荧光金属纳米簇探针的理想选择。但是，在现有技术下荧光锰纳米簇尚无法被制得，这是因为锰属于氢前金属，由Mn2+到Mn0的标准电极电位为-1.18V，负于氢标准电极电位(0V)，在水溶液中的H+会优先于Mn2+被还原，导致由0价Mn原子堆积而成的锰纳米簇无法生成。
针对现有技术的不足，本发明提供了一种快速、高效、绿色、低成本的蓝光发射磁性-荧光锰纳米簇(Mn NCs)探针及其制备方法。本方法使用卵清蛋白(OVA)作为制备模板，以氯化锰无机盐作为锰源，在水溶液中以抗坏血酸(AA)为还原剂将+2价的锰离子还原为0价的锰原子，从而制成一种同时具备蓝色荧光发射性能和顺磁性能的锰纳米簇材料。本方法采用的制备模板卵清蛋白是一种是广泛存在于动物中的蛋白质，来源广泛价格低廉，其中富含的巯基基团可以结合多个锰原子，保证了所制得的锰纳米簇的荧光发射效率。本发明所制备的磁性-荧光锰纳米簇具有良好的水溶性和稳定性，其所发射的荧光可被转铁蛋白(TRF)所猝灭，据此将其发展为一种检测转铁蛋白的荧光探针开展生命分析领域的应用，具有明显的技术进步性和广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种水溶性的蓝光发射磁性-荧光锰纳米簇及其简便的水相合成方法，采用该法制备的锰纳米簇在具备优异的蓝色荧光发射能力的同时，亦具备优良的顺磁性质，在蛋白质等生物大分子检测方面具有很好的应用前景。
为实现上述目的，本发明公开了一种蓝光发射的磁性-荧光锰纳米簇探针OVA-MnNCs，其特征在于：
(1)该磁性-荧光锰纳米簇探针中锰元素的价态为0价，其平均粒径为1.8nm，其中制备模板卵清蛋白和锰原子的摩尔比为1∶14；
(2)该锰纳米簇探针具有蓝色荧光发射能力，其最大激发波长位于387nm，最大发射波长位于471nm；
(3)该锰纳米簇探针在具有荧光性质的同时具有明显的顺磁性质，其磁滞回线为一过原点的直线。
本发明进一步公开了所述蓝光发射磁性-荧光锰纳米簇探针OVA-Mn NCs的合成方法，按如下的步骤进行：
(1)称取0.1g卵清蛋白溶于9mL高纯水中，逐滴加入1mL浓度为0.1M的MnCl2溶液，将该反应混合溶液在70℃水浴中加热搅拌20min；
(2)称取0.1AA溶于4.5mL高纯水中制得AA溶液，并将该AA溶液逐滴加入至上述反应混合溶液中，充分搅拌；
(3)随即向上述反应混合液中逐滴加入0.5mL浓度为1M的NaOH溶液，在70℃的水浴中将上述反应混合液搅拌加热2.5h，至溶液由淡黄色变为黄色，即可得到OVA-Mn NCs。
本发明更进一步公开了所述方法制备的OVA-Mn NCs探针在用于对溶液中转铁蛋白进行检测方面的应用。具体为取一定体积的OVA-Mn NCs探针溶液、转铁蛋白标准溶液和高纯水制成检测体系，采用含有不同浓度转铁蛋白标准溶液的检测体系测定目标物转铁蛋白对OVA-Mn NCs探针荧光信号的猝灭量(ΔF)，并以此为纵坐标，转铁蛋白标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线，依该标准曲线测定样品中转铁蛋白的浓度。
上述检测方法中，得到线性方程为ΔF＝3.06389x-2.81408，ΔF＝F0-F，F0为不加入转铁蛋白时空白探针溶液的荧光强度，F为加入转铁蛋白后探针试液的荧光强度，x为转铁蛋白的浓度，线性相关系数R2＝0.99954。
上述检测方法中，OVA-Mn NCs探针对转铁蛋白的检测的线性范围为2.5-50μM，检出限为9.85nM。
上述检测方法中，检测试液含稀释100倍后的OVA-Mn NCs探针溶液3.8mL和转铁蛋白标准溶液0.20mL；空白溶液中以等体积高纯水代替转铁蛋白标准溶液。
上述检测方法中，在向OVA-Mn NCs探针溶液中加入转铁蛋白标准溶液并充分反应7min后检测其试液的荧光强度。
本发明公开的蓝光发射的磁性-荧光OVA-Mn NCs探针及其合成方法与现有技术相比，所具有的有益效果在于：
(1)本发明合成的锰纳米簇具有稳定的光学性质，合成材料粒径小，荧光性能好，具有顺磁性，合成方法简单、快速，合成过程中不需要功能化等复杂的过程。
(2)本发明可在室温下对溶液中的转铁蛋白简单、快速、经济、灵敏和高选择性的检测方法，用于检测转铁蛋白的线性范围为2.5-50μM，检出限为9.85nM。
附图说明
图1为OVA-Mn NCs的透射电镜(TEM)图，说明了所合成的OVA-Mn NCs粒径尺寸均一、粒径较小；
图2为OVA-Mn NCs的粒径分布情况图，表明其平均粒径为1.8nm；
图3为OVA-Mn NCs的X射线光电子能谱(XPS)宽谱图，说明其主要元素组成，并根据各元素峰强度计算所含元素比例；
图4为OVA-Mn NCs的磁滞回线图，证明其为顺磁性物质；
图5为OVA-Mn NCs的荧光激发光谱和发射光谱图，表明其最大激发波长为387nm，最大发射波长为471nm，可在紫外光激发下其发射蓝色荧光；
图6为OVA-Mn NCs检测转铁蛋白(TRF)的标准曲线图，表明该OVA-Mn NCs探针可成功应用于对目标物转铁蛋白的高灵敏荧光检测，其在生物分析方面具有良好的应用前景。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
所用试剂均为分析纯，所用试剂及生产厂家如下：高纯水，杭州娃哈哈集团有限公司；卵清蛋白，生物工程上海股份有限公司；氯化锰(99％)，北京百灵威科技有限公司；抗坏血酸，天津科密欧试剂有限公司；氢氧化钠，天津福晨化学试剂有限公司；转铁蛋白，上海源叶生物科技有限公司。
实施例1
以卵清蛋白(OVA)为制备模板的磁性-荧光锰纳米簇(OVA-Mn NCs)的制备，按照如下步骤进行：
(1)称取0.1g OVA溶于9mL高纯水中，滴加1mL浓度为0.1M的MnCl2溶液，将该反应混合溶液在70℃水浴中加热搅拌20min；
(2)称取0.1g AA溶于4.5mL高纯水中制得AA溶液，并将该AA溶液逐滴加入至上述反应混合溶液中，充分搅拌；
(3)随即向上述反应混合液中逐滴加入0.5mL浓度为1M的NaOH溶液，在70℃的水浴中将上述反应混合液搅拌加热2.5h，至溶液由淡黄色变为黄色，即可得到OVA-Mn NCs。
实施例2
(1)OVA-Mn NCs的制备方法参照实施例1；
(2)OVA-Mn NCs的透射电子显微镜(TEM)表征：
将制备好的OVA-Mn NCs分散到高纯水中，均匀滴涂于专用铜网上，晾干，制得观测样品，利用场发射透射电子显微镜观测OVA-Mn NCs的形貌。如图1所示，该OVA-Mn NCs形貌近似球形且分散均匀；将该TEM图像中的OVA-Mn NCs粒径进行统计，图2显示其粒径较为均匀，该OVA-Mn NCs的平均粒径为1.8nm。
实施例3
(1)OVA-Mn NCs的制备方法参照实施例1；
(2)OVA-Mn NCs的元素组成表征：
将制备好的OVA-Mn NCs纯化干燥后进行X射线光电子能谱(XPS)表征，得到其XPS宽谱如图3所示。实验结果表明，该OVA-Mn NCs由S、C、N、O、Mn等元素构成，其中O、N、S元素来自于模板OVA。已知OVA中S元素来自于-SH且一个OVA分子中含有4个-SH，故依据XPS实验数据所提供的Mn与S的元素含量比即可计算出该OVA-Mn NCs中Mn∶OVA＝14∶1，该结果表明一个OVA模板分子上堆积了14个Mn原子，该OVA-Mn NCs在结构上符合金属荧光纳米簇的结构组成。
实施例4
(1)OVA-Mn NCs的制备方法参照实施例1；
(2)OVA-Mn NCs的饱和磁强度曲线测定：
将制备好的OVA-Mn NCs干燥、称量，测定其饱和磁强度并绘制相关曲线，如图4所示，该OVA-Mn NCs的磁强度曲线是一条通过坐标原点的直线，表明该OVA-Mn NCs具有非常典型的顺磁性质，说明该OVA-Mn NCs已被成功合成且具有良好的顺磁性质。
实施例5
(1)OVA-Mn NCs的制备方法参照实施例1；
(2)OVA-Mn NCs的荧光激发光谱和发射光谱的测定：
将制备好的OVA-Mn NCs分散到高纯水中，利用荧光分光光度计对该OVA-Mn NCs样品的荧光激发光谱和发射光谱进行测定，如图5所示，该OVA-Mn NCs的最大激发波长为387nm，在此最大激发波长的激发下，其荧光发射波长为471nm，位于蓝光区，说明该OVA-MnNCs具有良好的蓝色荧光发射能力。
实施例6
OVA-Mn NCs探针在转铁蛋白(TRF)检测方面的应用，按如下步骤进行：
(1)OVA-Mn NCs的制备方法参照实施例1；
(2)将制备好的OVA-Mn NCs探针原液稀释100倍；
(3)分别配制浓度为50μM、100μM、200μM、300μM、500μM、600μM、800μM、1000μM的转铁蛋白标准溶液；
(4)向5mL离心管中加入3800μL稀释后的OVA-Mn NCs探针溶液和200μL高纯水，摇匀后制得空白检测试液；
(5)另取8个5mL离心管，分别向其中加入200μL步骤(1)中配制好的转铁蛋白标准溶液和3800μL步骤(2)中稀释后的OVA-Mn NCs探针溶液，摇匀并充分反应7min后，制得样品检测试液；
(6)用荧光分光光度计分别检测上述空白检测溶液的荧光强度F0和样品检测溶液的荧光强度F，以二者的差值即转铁蛋白对OVA-Mn NCs探针荧光信号的猝灭量(ΔF＝F0-F)为纵坐标，以转铁蛋白标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线，依该标准曲线测定样品中转铁蛋白的浓度。
图6所示的实验结果表明，在转铁蛋白浓度在2.5-50μM范围内，OVA-Mn NCs探针的荧光强度猝灭值与转铁蛋白的浓度呈现线性关系，线性方程为线性相关系数为0.99954，检出限为9.85nM。
Claims (2)
1.一种蓝光发射的磁性-荧光锰纳米簇探针OVA-Mn NCs，其特征在于：
(1)按如下方法合成：
①称取0.1g卵清蛋白溶于9mL高纯水中，逐滴加入1mL浓度为0.1M的MnCl2溶液，将该反应混合溶液在70℃水浴中加热搅拌20min；
②称取0.1g抗坏血酸溶于4.5mL高纯水中制成溶液，并将该抗坏血酸溶液逐滴加入至上述反应混合溶液中，充分搅拌；
③随即向上述反应混合液中逐滴加入0.5mL浓度为1M的NaOH溶液，在70℃的水浴中将上述反应混合液搅拌加热2.5h，至溶液由淡黄色变为黄色，即可得到OVA-Mn NCs；
(2)该锰纳米簇探针中锰元素的价态为0价，其平均粒径为1.8nm，其中制备模板卵清蛋白和锰原子的摩尔比为1∶14；
(3)该锰纳米簇探针具有蓝色荧光发射能力，其最大激发波长位于387nm，最大发射波长位于471nm；
(4)该锰纳米簇探针在具有荧光性质的同时具有明显的顺磁性质，其磁滞回线为一过原点的直线；
(5)该锰纳米簇探针的荧光能够被转铁蛋白所猝灭。
2.权利要求1所述的磁性-荧光锰纳米簇探针OVA-MnNCs在用于高灵敏检测转铁蛋白方面的应用。
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