CN110000395A - 一步法合成荧光金属锰纳米簇的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了“一步法”以变性牛血清蛋白为保护剂所合成的具有荧光发射的新型金属纳米簇—dBSA‑MnNCs,经过本方法合成的荧光锰纳米簇具有良好的水溶性,稳定性,荧光响应性并且合成过程简单易行,所以可在生物体系检测和临床应用等方面开辟新的研究领域,并有良好的应用和发展前景。该荧光探针能够实现高特异性、高灵敏检测细胞色素C。细胞色素C是生命体中一种重要的水溶性氧化还原血红蛋白,还可以促进电极物质与具有高催化和传感性的生物大分子结合,这对于了解生命体内的物质代谢和能量转换,所以检测细胞色素C具有一定的实际意义的。
Description
本专利得到国家自然科学基金面上项目(21375095)、天津市自然科学基金青年项目(No.17JCQNJC05800),天津师范大学博士基金项目(No.52XB1510),天津师范大学“无机-有机杂化功能材料化学教育部重点实验室”、“天津市功能分子结构与性能重点实验室”开放基金项目和天津师范大学“未来千人计划”项目(WLQR201814)的支持。
技术领域
本发明属于生物分析检测技术领域,涉及一种新型荧光探针锰纳米簇的“绿色”合成方法及其对细胞色素C检测的应用。
背景技术
金属纳米簇(metal naonoclusters,MNCs)是由几个到数百个金属原子堆积而成的小团簇,其尺寸大约为1-2 nm或者更小,导致其能带结构变得不连续而被分立成不同的能级。正是由于这种离散的能级结构,使得金属纳米簇拥有金属纳米颗粒明显不同的电学、光学和化学性质,其自身性质更多地呈现出与半导体纳米材料类似的诸多特征。例如金属纳米簇在一定波长的激发光的激发下能够发射荧光,而金属纳米颗粒则不可以。这是因为金属纳米簇的光学和电学性能在很大程度上依赖于其尺寸大小,尤其是在纳米范围内。当这些金属纳米团簇尺寸减小到与费米波长相当时,其能够在孤立的金属原子和等离子体金属纳米颗粒之间建立“missing link”这一重要作用,使得金属纳米簇摆脱了纳米晶的等离子体特性,从而展现出某些类似分子的性质。与传统半导体量子点相比,其具有尺寸更小、斯托克斯位移更大、毒性低、荧光量子产率高、生物相容性好、化学稳定性和光稳定性高等优异性质,从而引起国内外科研人员的广泛关注。金属纳米簇的应用也很是广泛,在检测核酸、蛋白质、生物小分子,免疫测定,细胞成像等方面都有涉及。例如Willner等人证明,通过不同尺寸发光的Ag NCs基于荧光共振能量转移对基因进行多重分析的传感平台还可以用于电催化和检测microRNA。Dickson和Tzeng还通过定制的寡核苷酸支架合成了细胞培养的Ag NCs,其可以用作固定和活细胞成像的有效探针。其中金、铂、银等贵金属纳米簇和铜纳米簇研究广泛。例如Zhang等人利用以卵清蛋白为保护剂合成的铜纳米簇检测L-赖氨酸,Yuan等人利用功能化的银纳米簇检测Al3+,Zhang等人利用β-乳球蛋白为保护剂合成的金纳米簇检测Hg2+等。
经过调查,在关于金属纳米簇材料中,利用变性牛血清蛋白(dBSA)和MnCl2溶液为原料合成锰簇却是空白,之前无人报道。通过之前合成金属纳米簇的经验,成功利用“一步法”并以变性牛血清蛋白为保护剂合成出可发射荧光的新型金属纳米簇—dBSA-Mn NCs,合成方法简单易行并且合成的锰簇有不亚于研究广泛的金、铂、银等贵金属纳米簇和铜纳米簇的性质,具有良好的水溶性,稳定性,荧光响应性。所以可在生物体系检测和临床应用等方面可以开辟另一新的检测手段,具有一定的现实意义。
目前检测细胞色素C的方法主要有高效液相色谱法,电化学分析法等。这些方法存在检测时间长、检测过程复杂、仪器昂贵等不足,本发明利用具有独特的光学性质的锰纳米簇,检测体系中的细胞色素C,可通过反应体系荧光光谱变化实现对糖蛋白的快速灵敏检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水溶的、无毒性的、荧光响应好的纳米簇dBSA-Mn NCs的合成方法。
为实现上述目的,本发明公开了一种荧光金属纳米簇dBSA-MnNCs的制备方法,其特征在于按如下的步骤进行:
(1)将0.12g BSA(牛血清蛋白)和0.004g NaBH4溶于30 mL高纯水中,搅拌40min,直至不放出H2为止;
(2)放入烘箱于60℃下加热30 min使蛋白质变性;
(3)依次加入250 μL 0.1 MMnCl2溶液和700 μL N2H4·H2O搅拌6h,当溶液由淡黄色变为透明,说明dBSA-MnNCs已经成功合成。其中金属纳米簇dBSA-Mn NCs在波长为290 nm的激发光的激发下所发射的荧光发射波长为340 nm。
本发明进一步公开了所述方法制备的荧光金属纳米簇dBSA-MnNCs在用于对溶液中细胞色素C进行检测方面的应用,其检测方法如下:
(1)一系列浓度细胞色素C溶液配置:
3200 μmol·L-1细胞色素C溶液:称取0.2832 g细胞色素C溶于高纯水中,定容10.0mL;
以3200 μmol·L-1细胞色素C溶液稀释配制0.08nM、0.2nM、0.4nM、2 nM、4nM、6 nM、8nM、10 nM、20 nM、40 nM、200 nM、400nM、600nM、800nM、1000nM、2500nM的细胞色素C溶液;
(2) 将制备好的锰纳米簇稀释1000倍,并利用荧光分光光度计测定此时的荧光强度,在激发波长290nm的激发下,该荧光探针在344 nm处表现出较强发射;
(3)测试稀释好的锰纳米簇体系的荧光强度,此时的荧光强度作为初始荧光强度;
(4) 向离心管中加入3900 μL稀释后的锰纳米簇溶液,再加入100 μL细胞色素C溶液,细胞色素C与锰纳米簇充分作用,使得荧光发生猝灭并检测其荧光发射光谱,通过与初始荧光强度对比,荧光发射光谱强度的变化值证明该锰纳米簇作为荧光探针检测细胞色素C的可行性;
(5) 检测溶液中细胞色素C含量线性的测定
向离心管中分别加入3900μL稀释后的锰纳米簇溶液,再分别加入100 μL不同浓度的细胞色素C溶液,充分反应20 min后用荧光分光光度计检测体系的荧光强度。实验结果表明,在细胞色素C浓度在0.002~15nM范围内,锰纳米簇的荧光强度猝灭值与细胞色素C的浓度呈现线性关系,线性方程为线性相关系数为0.993,检出限为0.11nM。其特征显示:
(1)本发明所提供的检测方法有较宽的检测范围和较低的检出限。
(2)本发明利用锰纳米簇检测细胞色素C过程简单,易于操作。
(3)本发明采用荧光检测,非常直观,非常方便,有利于今后的推广。
本发明公开的荧光金属纳米簇dBSA-MnNCs的制备方法与现有技术相比所具有的积极效果在于:
(1)本发明合成的锰纳米簇具有稳定的光学性质,合成材料粒径小,荧光性能好,合成方法简单、快速,合成过程中不需要加热、调节pH、功能化等复杂的过程。
(2)本发明可在室温下对溶液中的细胞色素C简单、快速、经济、灵敏和高选择性的检测方法。用于检测细胞色素C的线性范围为0.002-15nM,检出限为0.11 nM。
附图说明
图1 为以变性牛血清蛋白为保护剂的锰纳米簇的透射电镜图(TEM),说明了合成的锰纳米簇粒径尺寸均一、粒径较小、且分布均匀;
图2为以变性牛血清蛋白为保护剂的锰纳米簇的荧光激发光谱和发射光谱图,表明其最大激发波长为290nm,最大发射波长为344nm。
图3为锰纳米簇紫外吸收图,说明锰纳米簇已经成功合成;
图4为锰纳米簇检测细胞色素C的可行性的分析;其中a:锰纳米簇的荧光强度 b:加入细胞色素C之后的锰纳米簇的荧光强度;
图5为锰纳米簇检测细胞色素C的线性范围图,说明了细胞色素C浓度为0.002-15nM范围内,反应体系中细胞色素C的浓度与荧光光谱强度呈线性关系。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明,本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外,实施方案应理解为说明性的,而非限制本发明的范围,本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言,在不背离本发明实质和范围的前提下,对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
所用试剂均为分析纯,所用试剂及生产厂家如下:高纯水,杭州娃哈哈集团有限公司;牛血清蛋白,北京鼎国昌盛生物技术有限公司;水合肼,天津光复精细化工有限公司;氯化锰(99%),天津博迪化工股份有限公司;硼氢化钠,广东翁江化学试剂有限公司;细胞色素C,上海源叶生物科技有限公司。
锰纳米簇的制备方法可见实施例1。
实施例1
以变性牛血清蛋白为保护剂的锰纳米簇的制备室温条件下按照如下步骤进行:
(1)将0.12 g BSA(牛血清蛋白)和0.004 g NaBH4溶于30 mL高纯水中,搅拌40 min,直至不放出H2。
(2)放入烘箱于60 ℃下加热30 min使蛋白质变性。
(3)依次加入250 μL 0.1 MMnCl2溶液和700 μL N2H4·H2O搅拌6h。当溶液由淡黄色变为透明,说明dBSA-Mn NCs已经成功合成。通过透射电镜图(TEM)(图1)可以看出锰纳米簇分散均匀,粒径较小。其中金属纳米簇dBSA-Mn NCs在波长为290 nm的激发光的激发下所发射的荧光发射波长为340 nm。水溶性好,有较强的稳定性,荧光响应性较好。
实施例2
利用金属锰纳米簇进行细胞色素C浓度的检测
(1)一系列浓度细胞色素C溶液配置:
3200 μmol·L-1细胞色素C溶液:称取0.2832 g细胞色素C溶于高纯水中,定容10.0mL;
以3200 μmol·L-1细胞色素C溶液稀释配制0.08nM、0.2nM、0.4nM、2 nM、4nM、6 nM、8nM、10 nM、20 nM、40 nM、200nM、400nM、600nM、800nM、1000nM、2500nM的细胞色素C溶液;
(2) 将制备好的锰纳米簇稀释1000倍,并利用荧光分光光度计测定此时的荧光强度,在激发波长290nm的激发下,该荧光探针在344 nm处表现出较强发射;
(3)测试稀释好的锰纳米簇体系的荧光强度,此时的荧光强度作为初始荧光强度;
(4) 向离心管中加入3900 μL稀释后的锰纳米簇溶液,向混合溶液中加入100 μL细胞色素C溶液,细胞色素C与锰纳米簇充分作用,使得荧光发生猝灭并检测其荧光发射光谱,通过与初始荧光强度对比,荧光发射光谱强度的变化值证明该锰纳米簇作为荧光探针检测细胞色素C的可行性;
(5) 检测溶液中细胞色素C含量线性的测定
向离心管中分别加入3900 μL锰纳米簇溶液,向混合溶液中分别加入100 μL不同浓度的细胞色素C溶液,充分反应20 min后用荧光分光光度计检测体系的荧光强度。实验结果表明,在细胞色素C浓度在0.002~15nM范围内,锰纳米簇的荧光强度猝灭值与细胞色素C的浓度呈现线性关系,线性方程为线性相关系数为0.993,检出限为0.11nM。
Claims (3)
1.一种荧光金属纳米簇dBSA-MnNCs的制备方法,其特征在于按如下的步骤进行:
(1)将0.12g BSA(牛血清蛋白)和0.004g NaBH4溶于30 mL高纯水中,搅拌40min,直至不放出H2为止;
(2)放入烘箱于60℃下加热30 min使蛋白质变性;
(3)依次加入250 μL 0.1 MMnCl2溶液和700 μL N2H4·H2O搅拌6h,当溶液由淡黄色变为透明,说明dBSA-MnNCs已经成功合成。
2.权利要求1所述的制备方法,其中金属纳米簇dBSA-Mn NCs在波长为290 nm的激发光的激发下所发射的荧光发射波长为340 nm。
3.采用权利要求1所述的方法制备的荧光金属纳米簇dBSA-MnNCs在用于对溶液中细胞色素C进行检测方面的应用,其检测方法如下:
(1)一系列浓度细胞色素C溶液配置:
3200 μmol·L-1细胞色素C溶液:称取0.2832 g细胞色素C溶于高纯水中,定容10.0mL;
以3200 μmol·L-1细胞色素C溶液稀释配制0.08nM、0.2nM、0.4nM、2 nM、4nM、6 nM、8nM、10 nM、20 nM、40 nM、200 nM、400nM、600nM、800nM、1000nM、2500nM的细胞色素C溶液;
(2) 将制备好的锰纳米簇稀释1000倍,并利用荧光分光光度计测定此时的荧光强度,在激发波长290nm的激发下,该荧光探针在344 nm处表现出较强发射;
(3)测试稀释好的锰纳米簇体系的荧光强度,此时的荧光强度作为初始荧光强度;
(4) 向离心管中加入3900 μL稀释后的锰纳米簇溶液,再加入100 μL细胞色素C溶液,细胞色素C与锰纳米簇充分作用,使得荧光发生猝灭并检测其荧光发射光谱,通过与初始荧光强度对比,荧光发射光谱强度的变化值证明该锰纳米簇作为荧光探针检测细胞色素C的可行性;
(5) 检测溶液中细胞色素C含量线性的测定
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PB01 | Publication | ||
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