CN108760696A - 一种基于磷光铜纳米簇检测胰蛋白酶及其抑制剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种磷光铜纳米簇检测胰蛋白酶及其抑制剂的方法，属于纳米生物传感技术领域。室温下，在DMF和去离子水的混合溶剂中加入谷胱甘肽(GSH)、硫酸铜(CuSO4)制备具有磷光特性的铜纳米簇(Cu NCs)。细胞色素C(Cyt c)通过静电作用会使得Cu NCs的荧光强度降低。在制备的Cu NCs中加入Cyt c孵育的胰蛋白酶。Cyt c会被胰蛋白酶水解，胰蛋白酶的存在有效的抑制Cyt c对Cu NCs的淬灭作用。因此，通过荧光强度变化来实现对胰蛋白酶的定量检测。此磷光铜纳米簇探针具有合成简单，反应快，且对胰蛋白酶的检测具高灵敏度、很好的化学稳定性以及生物兼容性的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于磷光铜纳米簇检测胰蛋白酶及其抑制剂的方法，属于生物传感技术领域。
背景技术
胰蛋白酶(trypsin)是一种从胰脏提取的丝氨酸蛋白水解酶。胰蛋白酶在生物体内含量变化直接反应了胰脏功能的运作和病例变化，是脊椎生物体内一种十分重要的蛋白酶。因此，发展简单、快速、精准的胰蛋白酶活性检测，对于疾病诊断和治疗具有重要意义。目前，有多种方法用于检测胰蛋白酶例如：酶联免疫吸附法、凝胶电泳法、质谱分析法、比色法以及荧光分析法。以上检测方法普遍存在检测限低，价格昂贵，操作复杂等不足。因此，基于酶蛋白相应底物的荧光分析法响应快速，操作方法简单，受到了广泛的关注和重视。细胞色素C是一种被广泛认知的血红素电子传输蛋白，在线粒体呼吸链中扮演者重要的角色。细胞色素C可以被胰蛋白酶消化水解成血红素肽碎片，是胰蛋白酶的自然底物。因此，常用于胰蛋白酶的荧光检测。
金属纳米团簇由数个以至数十个金属原子组成，尺寸接近电子费米波长，是一种新型的荧光纳米材料。由于金属纳米团簇超小的尺寸，使其具有出色的尺寸效应，优秀的光物理特性和催化效果。从生物探针到催化剂，LED到光电池，金属团簇在多个领域有着广泛的研究和应用。其中金属铜纳米簇具有更高的反应活性；与分子蛋白及酶更高的关联性。越来越多的应用于生物荧光检测领域。
综上所述，结合金属铜纳米簇稳定的荧光特性和生物关联性，通过铜纳米簇与细胞色素C具有相互作用，使用细胞色素C作为反应底物，实现一种绿色快速的荧光分析胰蛋白酶及其抑制剂的方法具有重大的意义。
发明内容
本发明解决的技术问题是：提出一种绿色无污染的，灵敏快速的，使用具有磷光特性的聚集态磷光铜纳米簇与细胞色素C定量检测胰蛋白酶以及其抑制剂的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提出的技术方案是：一种磷光铜纳米簇检测胰蛋白酶的方法，其特征在于:包括如下步骤：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，取谷胱甘肽溶液加至混合溶液，再加入硫酸铜溶液，振荡形成铜纳米簇。配置细胞色素C于离心管中，取不同浓度胰蛋白酶加入细胞色素C放入振荡箱孵化。取孵化后细胞色素C加入铜纳米簇，充分振荡，室温放置。不同浓度胰蛋白酶水解后的细胞色素C降低铜纳米簇荧光强度不同，以此定量检测胰蛋白酶。
具体为：包括如下步骤：取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。再加入硫酸铜溶液(500μM)，振荡形成铜纳米簇。配置细胞色素C于1mL离心管中，取不同浓度胰蛋白酶加入细胞色素C总体积为500μL，混合溶液中胰蛋白酶浓度为0-1mg/mL，细胞色素C浓度为0-3mg/mL，放入振荡箱37℃孵化0.5-2小时。取孵化后细胞色素C 20μL加入铜纳米簇，充分振荡，室温放置0.5-2小时。不同浓度胰蛋白酶水解后的细胞色素C降低铜纳米簇荧光荧光强度不同，以此定量检测胰蛋白酶。
为了解决上述技术问题，本发明提出的另一技术方案是：一种磷光铜纳米簇检测胰蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于:包括如下步骤：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，取谷胱甘肽溶液加至混合溶液，再加入硫酸铜溶液，振荡形成铜纳米簇。配置细胞色素C于离心管中，取胰蛋白酶与不同浓度胰蛋白酶抑制剂加入细胞色素C，放入振荡箱孵化。取孵化后细胞色素C加入铜纳米簇，充分振荡，室温放置。胰蛋白酶受到不同浓度抑制剂的抑制作用，导致水解后的细胞色素C降低铜纳米簇荧光强度的不同，以此检测胰蛋白酶抑制剂能力。
具体为：取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1，将20μL谷胱甘肽0.2M加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀，取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。配置细胞色素C于1mL离心管中，取胰蛋白酶与不同浓度胰蛋白酶抑制剂加入细胞色素C，总体积为500μL，混合溶液中胰蛋白酶浓度为0-1mg/mL，胰蛋白酶抑制剂浓度0-2μg/mL，细胞色素C浓度为0-3mg/mL，放入振荡箱37℃孵化0.5-2小时，取孵化后细胞色素C 20μL加入铜纳米簇，充分振荡，室温放置0.5-2小时。胰蛋白酶受到不同浓度抑制剂的抑制作用，水解后的细胞色素C降低铜纳米簇荧光荧光强度不同，以此检测胰蛋白酶抑制剂能力。
本发明的有益效果：
本发明为一种基于磷光铜纳米簇检测胰蛋白酶及其抑制剂的方法，室温下，通过铜纳米簇与细胞色素C具有相互作用，使用细胞色素C作为反应底物，实现绿色快速的定量检测胰蛋白酶及其抑制剂。
室温下，在DMF和去离子水的混合溶剂中加入谷胱甘肽(GSH)、硫酸铜(CuSO4)制备具有磷光特性的铜纳米簇(Cu NCs)。细胞色素C(Cyt c)通过静电作用会使得Cu NCs的荧光强度降低。在制备的Cu NCs中加入Cyt c孵育的胰蛋白酶。Cyt c会被胰蛋白酶水解，胰蛋白酶的存在有效的抑制Cyt c对Cu NCs的淬灭作用。本发明通过荧光强度变化来实现对胰蛋白酶的定量检测。此外，该纳米探针还能够在尿液中实现对胰蛋白酶的检测，且成功应用于胰蛋白酶抑制剂筛选。此磷光铜纳米簇探针具有合成简单，反应快，且对胰蛋白酶的检测具高灵敏度、很好的化学稳定性以及生物兼容性的特点。
附图说明
下面结合附图对本发明的实施例作进一步说明。
图1为实施例1中制得的铜纳米簇的紫外可见吸收光谱图；
图2为实施例1中制得的铜纳米簇的荧光发射光谱图；
图3为实施例1中制得的铜纳米簇的荧光寿命图；
图4为实施例2中制得的铜纳米簇的TEM表征图；
图5为实施例2中制得的铜纳米簇的XPS表征图；
图6为实施例2中制得的铜纳米簇的XPS表征图；
图7为实施例3中制得的细胞色素c的紫外可见吸收光谱图；
图8为实施例4中制得的细胞色素c的紫外可见吸收光谱图；
图9为实施例5中制得的铜纳米簇的荧光发射光谱图；
图10为实施例6中制得的铜纳米簇的荧光发射光谱图；
图11为实施例7中制得的铜纳米簇的荧光发射光谱图；
图12为实施例8中制得的铜纳米簇中的荧光相对强度折线图；
图13为实施例9中制得的铜纳米簇的荧光发射光谱图；
图14为实施例10中制得的铜纳米簇的荧光发射光谱图；
图15为实施例11中制得的铜纳米簇的荧光发射光谱图；
图16为实施例12中制得的铜纳米簇的荧光相对强度折线图；
图17为实施例12中制得的铜纳米簇的荧光强度线性关系图；
图18为实施例13中制得的铜纳米簇的荧光相对强度柱状图；
图19为实施例14中制得的铜纳米簇的荧光抑制效率图；
图20为实施例15中制得的铜纳米簇的荧光发射光谱图；
图21为实施例16中制得的铜纳米簇的荧光发射光谱图；
图22为实施例17中制得的铜纳米簇的荧光发射光谱图；
图23为实施例18中制得的铜纳米簇的荧光相对强度折线图；
图24为实施例18中制得的铜纳米簇的荧光强度线性关系图；
图25为铜纳米簇检测胰蛋白酶及其抑制剂的示意图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述实施例。
实施例1：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。制备的磷光铜纳米簇通过紫外可见分光光度计和荧光分光光度计测量绘制吸收光谱曲线和荧光光谱曲线，并通过寿命检测绘出铜纳米簇的磷光寿命和拟合曲线。如图1，图2和图3。
实施例2：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。取一定量的铜纳米簇冷冻干燥，，使用透射电镜(TEM)，X射线光电能谱仪(XPS)表征。如图4，图5和图6。
实施例3：用配置的Tris-HCl(50mM，pH 8.9)缓冲液配置细胞色素C溶液(2mg/mL)。通过紫外可见分光光度计测量绘制吸收光谱曲线，如图7。
实施例4：用配置的Tris-HCl(50mM，pH 8.9)缓冲液配置细胞色素C溶液(2mg/mL)，在混合溶液中加入胰蛋白酶(10μg/mL)，置于37℃水浴反应1小时。通过紫外可见分光光度计测量绘制吸收光谱曲线，如图8。
实施例5：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。在上述铜纳米簇中加入细胞色素C(2μg/mL)振荡反应。通过荧光分光光度计测量绘制荧光强度图，如图9。
实施例6：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。在上述铜纳米簇中加入细胞色素C(15μg/mL)，振荡反应。通过荧光分光光度计测量绘制荧光强度图，如图10。
实施例7：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。在上述铜纳米簇中加入细胞色素C(60μg/mL)，振荡反应。通过荧光分光光度计测量绘制荧光强度图，如图11。
实施例8：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。在上述铜纳米簇中加入不同浓度的细胞色素C(0-100μg/mL)，振荡反应。通过荧光分光光度计测量绘制荧光相对强度折线图，如图12。
实施例9：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。在上述铜纳米簇中加入10μL用胰蛋白酶(0.005μg/mL)孵育的细胞色素C(2mg/mL)的混合溶液，反应2小时。通过荧光分光光度计测量绘制荧光强度图，如图13。
实施例10：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。在上述铜纳米簇中加入10μL用胰蛋白酶(1.5μg/mL)孵育的细胞色素C(2mg/mL)的混合溶液，反应2小时。通过荧光分光光度计测量绘制荧光强度图，如图14。
实施例11：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。在上述铜纳米簇中加入10μL用胰蛋白酶(20μg/mL)孵育的细胞色素C(2mg/mL)的混合溶液，反应2小时。通过荧光分光光度计测量绘制荧光强度图，如图15。
实施例12：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。在上述铜纳米簇中加入10μL用胰蛋白酶(0-20μg/mL)孵育的细胞色素C(2mg/mL)的混合溶液，反应2小时。通过荧光分光光度计测量绘制荧光相对强度折线图和荧光相对强度线性关系图，如图16和图17。
实施例13：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。在上述铜纳米簇中加入10μL分别用胰蛋白酶，牛血清白蛋白，单胺氧化酶A，单胺氧化酶B，磷酸水解酶，溶菌酶，谷胱甘肽(2μg/mL)孵育的细胞色素C(2mg/mL)的混合溶液，反应2小时。通过荧光分光光度计测量绘制荧光相对强度柱状图，如图18。
实施例14：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。在上述铜纳米簇中加入10μL用胰蛋白酶抑制剂(0-1μg/mL)，胰蛋白酶(10μg/mL)和细胞色素C(2mg/mL)孵育的混合溶液，反应2小时。通过荧光分光光度计测量计算绘抑制效率图，如图19。
实施例15：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。在上述铜纳米簇中加入10μL在5％的尿液环境下用胰蛋白酶(0.005μg/mL)孵育的细胞色素C(2mg/mL)的混合溶液，反应2小时。通过荧光分光光度计测量绘制荧光强度图，如图20。
实施例16：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。在上述铜纳米簇中加入10μL在5％的尿液环境下用胰蛋白酶(0.5μg/mL)孵育的细胞色素C(2mg/mL)的混合溶液，反应2小时。通过荧光分光光度计测量绘制荧光强度图，如图21。
实施例17：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。在上述铜纳米簇中加入10μL在5％的尿液环境下用胰蛋白酶(5μg/mL)孵育的细胞色素C(2mg/mL)的混合溶液，反应2小时。通过荧光分光光度计测量绘制荧光强度图，如图22。
实施例18：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。在上述铜纳米簇中加入10μL在5％的尿液环境下用胰蛋白酶(0-10μg/mL)孵育的细胞色素C(2mg/mL)的混合溶液，反应2小时。通过荧光分光光度计测量绘制荧光强度折线图和荧光强度相关线性图，如图23和图24。
通过以上实施例和实验数据，可以得出：合成磷光铜纳米簇具有稳定的荧光特性和生物关联性，并通过铜纳米簇与细胞色素C具有相互作用，实现一种绿色快速的荧光分析胰蛋白酶及其抑制剂的方法。该纳米探针还能够在尿液中实现对胰蛋白酶的检测，且成功应用于胰蛋白酶抑制剂筛选。
本发明的不局限于上述实施例所述的具体技术方案，凡采用等同替换形成的技术方案均为本发明要求的保护范围。
Claims (4)
1.一种磷光铜纳米簇检测胰蛋白酶的方法，其特征在于:包括如下步骤：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，取谷胱甘肽溶液加至混合溶液，再加入硫酸铜溶液，振荡形成铜纳米簇，配置细胞色素C于离心管中，取不同浓度胰蛋白酶加入细胞色素C放入振荡箱孵化，取孵化后细胞色素C加入铜纳米簇，充分振荡，室温放置，不同浓度胰蛋白酶水解后的细胞色素C降低铜纳米簇荧光强度不同，以此定量检测胰蛋白酶。
2.一种磷光铜纳米簇检测胰蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于：包括如下步骤：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，取谷胱甘肽溶液加至混合溶液，再加入硫酸铜溶液，振荡形成铜纳米簇，配置细胞色素C于离心管中，取胰蛋白酶与不同浓度胰蛋白酶抑制剂加入细胞色素C，放入振荡箱孵化，取孵化后细胞色素C加入铜纳米簇，充分振荡，室温放置，胰蛋白酶受到不同浓度抑制剂的抑制作用，导致水解后的细胞色素C降低铜纳米簇荧光强度的不同，以此检测胰蛋白酶抑制剂能力；
所述胰蛋白酶抑制剂为：来自大豆中的胰蛋白酶抑制剂。
3.根据权利要求1所述的基于磷光铜纳米簇检测胰蛋白酶的方法，其特征在于：包括如下步骤：取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1，将20μL谷胱甘肽0.2M加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀，取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇，配置细胞色素C于1mL离心管中，取不同浓度胰蛋白酶加入细胞色素C总体积为500μL，混合溶液中胰蛋白酶浓度为0-1mg/mL，细胞色素C浓度为0-3mg/mL，放入振荡箱37℃孵化0.5-2小时，取孵化后细胞色素C 20μL加入铜纳米簇，充分振荡，室温放置0.5-2小时，不同浓度胰蛋白酶水解后的细胞色素C降低铜纳米簇荧光荧光强度不同，以此定量检测胰蛋白酶。
4.根据权利要求2所述的基于磷光铜纳米簇检测胰蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于：取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1，将20μL谷胱甘肽0.2M加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀，取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇，配置细胞色素C于1mL离心管中，取胰蛋白酶与不同浓度胰蛋白酶抑制剂加入细胞色素C，总体积为500μL，混合溶液中胰蛋白酶浓度为0-1mg/mL，胰蛋白酶抑制剂浓度0-2μg/mL，细胞色素C浓度为0-3mg/mL，放入振荡箱37℃孵化0.5-2小时，取孵化后细胞色素C 20μL加入铜纳米簇，充分振荡，室温放置0.5-2小时，胰蛋白酶受到不同浓度抑制剂的抑制作用，水解后的细胞色素C降低铜纳米簇荧光荧光强度不同，以此检测胰蛋白酶抑制剂能力。
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