CN110133252A - 用于检测癌胚抗原的试剂盒和检测方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及电化学检测领域，公开了一种用于检测癌胚抗原的试剂盒和检测方法及其应用。本发明的试剂盒包括纳米金双功能探针和免疫磁珠；其中，所述纳米金双功能探针包括纳米金颗粒以及连接在该纳米金颗粒上的第二抗体和检测标记物；所述免疫磁珠包括磁珠和连接在该磁珠上的第一抗体；所述第一抗体和所述第二抗体各自独立地为抗癌胚抗原的抗体。本发明的试剂盒和检测方法具有灵敏度高、检测速度快、重复性好的优点。

Description

用于检测癌胚抗原的试剂盒和检测方法及其应用
技术领域
本发明涉及电化学检测领域，具体涉及一种用于检测癌胚抗原的试剂盒和检测方法及其应用。
背景技术
癌症是人类死亡的主要原因之一，临床早期诊断能有效降低患者的死亡率。肿瘤标志物指存在于肿瘤细胞本身中或由肿瘤细胞分泌的特定物质，它们可以反映肿瘤的存在和生长。癌胚抗原(CEA)是目前使用最广泛的肿瘤标志物之一，根据血清中CEA的含量可以用于癌症的临床研究和早期诊断，因此，CEA的灵敏检测已经引起了科学家的广泛关注。到目前为止，科研工作者开发了一系列分析技术用于CEA的高灵敏检测，如荧光分析法(FIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、电化学免疫分析、电流分析、毛细管电泳法和比色检测法以及其他免疫分析方法。
与其它免疫分析方法相比，电化学免疫分析方法具有操作简单、灵敏度高、成本低廉等独特的优点而受到人们的广泛关注。目前，电化学免疫传感器已经在细胞、蛋白、肿瘤标志物等的检测上得到了广泛的研究和应用。但是由于电化学信号极易受到电极活性的影响，而工作电极在复杂样品中很容易被毒化，因此电化学免疫传感器在实际复杂样品中的应用往往会受到限制。另外，当前的免疫分析方法难以满足CEA检测所需的高灵敏度和精度。发展适用于现场、简单且高灵敏的免疫分析方法成为科研工作者们努力的方向。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述问题，提供一种用于检测癌胚抗原的试剂盒和检测方法及其应用，该试剂盒和检测方法具有灵敏度高、检测速度快、重复性好的优点。
为了实现上述目的，本发明一方面提供一种用于检测癌胚抗原的试剂盒，该试剂盒包括纳米金双功能探针和免疫磁珠；其中，所述纳米金双功能探针包括纳米金颗粒以及连接在该纳米金颗粒上的第二抗体和检测标记物；所述免疫磁珠包括磁珠和连接在该磁珠上的第一抗体；所述第一抗体和所述第二抗体各自独立地为抗癌胚抗原的抗体。
优选地，所述第二抗体为生物素化的抗体，所述纳米金颗粒为生物素化的纳米金颗粒，所述第二抗体和所述纳米金颗粒通过链酶亲和素相互连接。
优选地，所述免疫磁珠通过EDC/NHS活化法将所述第一抗体与所述磁珠共价偶联而得。
优选地，所述纳米金颗粒的平均直径为8.4-13.5nm；所述磁珠的平均直径为300-500nm。
优选地，以纳米金颗粒计的所述纳米金双功能探针与以磁珠计的所述免疫磁珠的摩尔比为1：6-18。
优选地，所述纳米金颗粒与所述第二抗体的摩尔比为1：3-10。
优选地，所述磁珠与所述第一抗体的摩尔比为1：5-12。
优选地，所述检测标记物为辣根过氧化物酶。
更优选地，所述链酶亲和素与所述根过氧化物酶的摩尔比为1：2-5，优选为1：3-5。
本发明第二方面提供一种癌胚抗原的检测方法，该方法包括将纳米金双功能探针和免疫磁珠与待测样品接触，使得所述纳米金双功能探针、所述免疫磁珠与待测样品中的癌胚抗原反应得到免疫夹心复合物，并通过纳米金双功能探针上的检测标记物检测癌胚抗原；其中，所述纳米金双功能探针包括纳米金颗粒以及连接在该纳米金颗粒上的第二抗体和检测标记物；所述免疫磁珠包括磁珠和连接在该磁珠上的第一抗体；所述第一抗体和所述第二抗体各自独立地为抗癌胚抗原的抗体。
优选地，所述第二抗体为生物素化的抗体，所述纳米金颗粒为生物素化的纳米金颗粒，所述第二抗体和所述纳米金颗粒通过链酶亲和素相互连接。
优选地，所述免疫磁珠通过EDC/NHS活化法将所述第一抗体与所述磁珠共价偶联而得。
优选地，所述纳米金颗粒的平均直径为8.4-13.5nm；所述磁珠的平均直径为300-500nm。
优选地，以纳米金颗粒计的所述纳米金双功能探针与以磁珠计的所述免疫磁珠的摩尔比为1：6-18。
优选地，所述纳米金颗粒与所述第二抗体的摩尔比为1：3-10。
优选地，所述磁珠与所述第一抗体的摩尔比为1：5-12。
优选地，所述检测标记物为辣根过氧化物酶。
更优选地，所述链酶亲和素与所述根过氧化物酶的摩尔比为1：2-5，优选为1：3-5。
优选地，使用差分脉冲伏安扫描测定检测标记物的量，差分脉冲伏安扫描的起始电势为0.05-0.15V，优选为0.08-0.1V。
优选地，检测液中的底物H2O2的浓度为2-4mmol/L。
本发明第三方面提供上述本发明的试剂盒或者检测方法在检测癌胚抗原中的应用。
通过上述技术方案，本发明采用偶联了CEA抗体的磁珠作为免疫反应的固相载体，利用HRP和抗体标记的纳米金双功能探针作为信号标记，建立了一种基于免疫磁分离与纳米金双功能探针多重放大的CEA电化学免疫传感器。该方法利用抗原抗体免疫反应在免疫磁珠表面形成磁性免疫夹心复合物，利用磁性玻碳电极将磁性免疫夹心复合物捕获到工作电极表面而获得电化学信号，从而实现对肿瘤标志物的快速高灵敏检测。该方法结合了免疫磁珠的分离富集能力以及纳米金的多标记放大性能以及酶的催化放大性能，能够实现对检测信号的多重放大，同时还可以避免复杂样品对电极的毒化，适用于复杂样品中CEA的快速高灵敏检测。
本发明的试剂盒和方法不仅具有电化学分析高灵敏度的优点，而且以磁珠作为免疫反应的固相载体，可以将免疫反应和电化学检测相分离，有效降低复杂样品对工作电极的毒化，同时还可以缩短免疫反应时间，增加检测的灵敏度。
附图说明
图1表示本发明的纳米金双功能探针的制备过程的示意图。
图2表示本发明的检测方法的示意图。图2中的A为离心管中的免疫反应策略；图2中的B为磁性玻璃碳电极上的电化学检测。
图3中的A表示GSH-AuNPs(a)和纳米金双功能探针(b)的UV-vis吸收光谱；图3中的B表示GSH-AuNPs(a)和纳米金双功能探针(b)的TEM图像。
图4表示在存在(a)和不存在(b)CEA时获得的电化学信号。
图5表示本发明的免疫复合物包被的磁珠(A)和对照组中磁珠(B)的TEM图像。
图6表示SA与SA-HRP的反应比对检测信号的影响。
图7表示电化学检测的初始电位(A)和检测液的pH(B)对背景信号的影响。
图8表示H2O2浓度(A)、HQ浓度(B)和检测液的pH(C)对DPV信号的影响。
图9中的A表示使用免疫磁性分离和基于双功能AuNPs探针的多扩增策略进行CEA检测的典型的DPV信号。CEA的浓度分别为(a)0、(b)0.0002、(c)0.002、(d)0.02、(e)0.1、(f)0.2、(g)0.5、(h)5ng/mL。图9中的B表示还原电流响应与CEA浓度的关系，其中的插图表示其对应的线性关系。
图10表示通过使用多巴胺、IgG、HSA和GOD作为阴性样品时本发明的方法的特异性图。
图11表示在CEA的存在(白色直方图)和不存在(黑色直方图)下使用不同的信号放大策略获得的电化学信号。
图12中的A表示DPV在添加(a)和冲洗(b)磁性免疫夹心复合物过程中发出可逆切换信号；图12中的B表示在单个电极上进行CEA检测的可逆信号转导四次。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明一方面提供一种用于检测癌胚抗原的试剂盒，该试剂盒包括纳米金双功能探针和免疫磁珠；
其中，所述纳米金双功能探针包括纳米金颗粒以及连接在该纳米金颗粒上的第二抗体和检测标记物；
所述免疫磁珠包括磁珠和连接在该磁珠上的第一抗体；
所述第一抗体和所述第二抗体各自独立地为抗癌胚抗原的抗体。
在本发明中，采用免疫磁球作为免疫反应的固相载体，利用纳米金双功能探针作为信号标记，利用抗原抗体免疫反应在免疫磁珠表面形成磁性免疫夹心复合物，磁性玻碳电极将磁性免疫夹心复合物捕获到工作电极表面，最后利用磁性免疫夹心复合物表面的检测标记物实现对肿瘤标志物的快速高灵敏检测。该方法利用磁球作为免疫反应的固相载体，可以增加抗体的固载量、缩短反应时间、避免复杂样品对工作电极的污染，进而建立适用于复杂样品的电化学免疫分析方法。该策略结合了免疫磁珠分离富集能力、纳米金的多标记放大性能以及酶的催化放大性能，能够实现对检测信号的多重放大，建立适用于复杂样品的快速高灵敏检测方法。
在本发明中，所述第一抗体和第二抗体均为抗癌胚抗原的抗体，用于特异性识别待检测的癌胚抗原(CEA)。上述抗体可以来自兔、小鼠、大鼠等，例如可以为小鼠抗人癌胚抗原抗体、兔抗人癌胚抗原抗体。所述抗体可以通过商购获得，例如可以购自购自郑州博赛生物技术股份有限公司，并且可以根据需要进行生物素化处理等。
在本发明中，所述纳米金双功能探针和所述免疫磁珠均能够特异性识别待检测的癌胚抗原，从而形成夹心复合物，所述免疫磁珠用于富集样品便于检测，所述纳米金双功能探针用于利用其上的检测标记物进行检测。
在本发明的纳米金双功能探针中，优选地，所述纳米金颗粒的平均直径可以为8.4-13.5nm，更优选为10-12nm。另外，所述纳米金颗粒优选为以谷胱甘肽为配体的纳米金颗粒，并可以采用任意的方法进行制备，例如可以在氯金酸中加入谷胱甘肽，并调节pH至2.5-3.0，分离沉淀得到Au(Ⅰ)-GSH纳米颗粒，再将该沉淀用碱溶剂，调节pH至5.3-5.7左右，加入还原型辅酶Ⅱ和谷胱甘肽还原酶进行反应，得到酒红色溶液即可。
在本发明的纳米金双功能探针中，优选地，所述第二抗体为生物素化的抗体，所述纳米金颗粒为生物素化的纳米金颗粒，所述第二抗体和所述纳米金颗粒通过链酶亲和素相互连接。
作为制备上述生物素化的抗体和/或生物素化的纳米金颗粒的方法，例如可以使用商购的任意生物素化试剂进行，例如可以使用sulfo-NHS-LC-biotin，具体可以将抗体或纳米金颗粒与生物素化试剂在缓冲液中在振荡条件下恒温反应，然后通过超滤或者柱层析的方法分离除去未反应的生物素化试剂。
为了达到更好的检测效果，优选地，所述纳米金颗粒与所述第二抗体的摩尔比为1：3-10，更优选为1：5-8。
在本发明的纳米金双功能探针中，所述检测标记物可以为荧光和/或化学发光的标记物，其中，优选为所述检测标记物为辣根过氧化物酶。另外，优选使用链酶亲和素标记的辣根过氧化物酶(SA-HRP)，并通过链酶亲和素与纳米金颗粒连接。另外，优选地，所述链酶亲和素与所述根过氧化物酶的摩尔比为1：2-5，优选为1：3-5。
在本发明的免疫磁珠中，优选地，所述磁珠的平均直径为300-500nm，更优选为350-450nm。另外，所述磁珠优选通过EDC/NHS活化法将所述第一抗体与所述磁珠共价偶联而得，具体地，可以将微球与第一抗体在含有EDC和NHS的缓冲液中反应，然后除去未反应的第一抗体即可，所述磁珠例如为羧基功能化的超顺磁性磁珠。
为了达到更好的检测效果，优选地，所述磁珠与所述第一抗体的摩尔比为1：5-12，更优选为1：6-9。
为了达到更好的检测效果，优选地，以纳米金颗粒计的所述纳米金双功能探针与以磁珠计的所述免疫磁珠的摩尔比为1：6-18，更优选为1：7-12。
本发明第二方面提供一种癌胚抗原的检测方法，该方法包括将纳米金双功能探针和免疫磁珠与待测样品接触，使得所述纳米金双功能探针、所述免疫磁珠与待测样品中的癌胚抗原反应得到免疫夹心复合物，并通过纳米金双功能探针上的检测标记物检测癌胚抗原；其中，所述纳米金双功能探针包括纳米金颗粒以及连接在该纳米金颗粒上的第二抗体和检测标记物；所述免疫磁珠包括磁珠和连接在该磁珠上的第一抗体；所述第一抗体和所述第二抗体各自独立地为抗癌胚抗原的抗体。
在本发明的检测方法中，所述纳米金双功能探针与所述免疫磁珠可以使用上述本发明的用于检测癌胚抗原的试剂盒中的所述纳米金双功能探针与所述免疫磁珠，具体不再赘述。
作为本发明的检测方法，具体地，优选先将免疫磁珠与待测样品接触，利用免疫磁珠上的第一抗体与待测样品中的CEA结合，得到免疫磁珠-CEA复合物，并利用磁场除去反应体系中游离的CEA及其它复杂基质；然后将上述免疫磁珠-CEA复合物与纳米金双功能探针接触，利用纳米金双功能探针上的第二抗体与免疫磁珠-CEA复合物结合，得到免疫夹心复合物(即免疫磁珠-CEA-纳米金双功能探针复合物)，并利用磁场除去反应体系中未反应的纳米金双功能探针及其它杂质；最后利用检测标记物检测免疫夹心复合物，从而确定CEA的浓度。
具体地，上述接触过程优选在缓冲溶液(例如0.1mol/L、pH 7.2的PBS缓冲液)中进行，优选在37℃条件下振荡孵育10-60min，转速例如可以为100-200转/分钟。上述利用磁场去除杂质的过程可以利用磁力架吸附磁珠，并洗涤2次以上。
上述检测免疫夹心复合物的方法，可以根据具体使用的检测标记物确定，例如检测标记物选用辣根过氧化物酶时，具体地，可以将上述免疫夹心复合物捕获到乙二胺修饰的磁性玻碳电极表面，插入检测液(含有对苯二酚和H2O2)中，采用Ag/AgCl作为参比电极，铂丝电极作为对电极，进行差分脉冲伏安(DPV)扫描，利用所检测到的电化学信号对CEA进行定量检测。
在本发明的检测方法中，检测信号受到检测液中底物H2O2、电子媒介体HQ(对苯二酚)以及检测液pH的影响。作为上述检测液，例如H2O2的浓度可以为0.1-10mmol/L，优选为0.5-4mmol/L，更优选为2-4mmol/L；对苯二酚的浓度可以为0.1-10mmol/L，优选为0.5-4mmol/L，更优选为2-4mmol/L；另外，pH值可以为6-8，优选为6.5-7.5，更优选为6.9-7.1。通过使用上述浓度的检测液，可以提高检测灵敏度、提高信噪比。
在本发明的检测方法中，优选使用差分脉冲伏安扫描测定检测标记物的量，为了增加检测灵敏度、提高信噪比，需要降低背景信号、提高检测信号，优选地，差分脉冲伏安扫描的起始电势为0.05-0.15V，优选为0.08-0.1V。也就是说，差分脉冲伏安扫描优选在0.10V～-0.15V的电势范围内进行。
作为本发明可以检测的样品，包括但不限于血清、脑脊液、乳汁、胃液、胸腹水以及尿液、粪便等多种体液和排泄物。上述样品，可以来自于人，也可以来自于非人动物。
本发明第三方面提供了上述本发明的试剂盒或者检测方法在检测癌胚抗原中的应用。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例和对比例中使用的试剂和仪器如下。
试剂：羧基功能化的超顺磁性磁球(30mg/mL，300nm)购自法国Ademtech公司。N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亚胺盐酸盐(N-[3-dimethylamino-propyl]-N-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC)、还原型谷胱甘肽(GSH)、高氯酸四丁基铵(Tetrabutylammonium perchlorate，TBAP)均购自美国Sigma-Aldrich公司。生物素化试剂sulfo-NHS-LC-biotin购自美国Thermo公司。链酶亲和素标记的辣根过氧化物酶(HRP-SA)、链酶亲和素(Streptavidin，SA)购自美国Vector公司。癌胚抗原(CEA)以及癌胚抗原抗体(Ab1和Ab2)均购自郑州博赛生物技术股份有限公司。叠氮化钠(NaN3)购自天津大茂试剂有限公司。超滤管(MWCO＝30kD)购自Millipore公司。免疫球蛋白(IgG)、脱脂奶粉购自武汉博士德生物工程有限公司。脱盐柱NAP-5购自GE Healthcare公司。氯金酸(HAuCl4·4H2O)、磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)、乙醇、葡萄糖氧化酶(GOD)、牛血清白蛋白(BSA)、多巴胺(DA)、30％双氧水(H2O2)、对苯二酚(hydroquinone，HQ)、吐温20等试剂均为分析纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司。实验用水均采用电阻率为18.2MΩ·cm的超纯水。磁性玻碳电极购自天津高仕睿联光电科技有限公司。
主要仪器：Eppendorf FA-45型离心机，GL-20G高速冷冻离心机(上海安亭仪器厂)，UV-2550紫外可见分光光度计(Shimadzu，日本岛津)，透射电镜(TEM，Hitachi H-7000FA)，动态光散射粒径仪(英国马尔文仪器有限公司)，CHI760电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)，磁力架(深圳华茵康仪器有限公司)，集热式磁力搅拌器(巩义市仪器有限公司)，SHZ-82恒温振荡器(常州国华电器有限公司)。
制备例1纳米金双功能探针的制备
如图1所示，纳米金双功能探针的制备过程如下：
(1)以谷胱甘肽为配体的纳米金(GSH-AuNPs)的制备
实验中所用的纳米金利用准生物合成的方法制备得到，该纳米金以谷胱甘肽为配体，具有非常好的胶体稳定性，而且其表面具有丰富的羧基和氨基，可以直接用于修饰和偶联。其具体操作步骤如下：
向1mL 1％的氯金酸中加入0.10mL谷胱甘肽(GSH，0.24mol/L)，室温下搅拌2分钟，然后向该溶液中缓慢滴加1mol/L NaOH至溶液的pH介于2.5-3.0，溶液中出现大量的浅黄色沉淀。然后利用离心机采用8000转/分钟的转速离心1分钟，弃去上清液得到Au(Ⅰ)-GSH沉淀。然后将该沉淀用5mmol/L氢氧化钠溶解，加入9mL超纯水，然后调节溶液pH值至5.5左右。然后向反应体系中加入2mg还原型辅酶Ⅱ(NADPH)和2个单位的谷胱甘肽还原酶(GR)，室温下搅拌反应一定的时间，直至溶液变成酒红色。采用超滤管(MWCO＝30kD)纯化，最后将得到的溶液分散在4mL超纯水中，4℃保存备用。
(2)生物素化CEA抗体(Biotinylated-Ab2)的制备
采用生物素化试剂sulfo-NHS-LC-biotin与CEA检测抗体(即第二抗体，也简称为Ab2)表面的氨基进行反应，从而将生物素连接到该抗体上。其具体操作如下：
取11μL CEA捕获抗体Ab2(约65g)用0.1mol/L pH 7.2的PBS稀释到100μL，然后加入6μL 1mg/mL的新配生物素化试剂sulfo-NHS-LC-biotin，在37℃转速为160转/分钟的恒温摇床上反应3h。游离的sulfo-NHS-LC-biotin利用NAP-5脱盐柱除去，利用抗体280nm处的吸光度对生物素化的抗体进行定量，加入含有1％BSA和0.05％叠氮化钠的PBS缓冲液(0.1mol/L，pH 7.2)，4℃储存备用。
(3)利用生物素化试剂sulfo-NHS-LC-biotin与GSH-AuNPs表面的氨基进行反应，将生物素偶联到纳米金表面。
取200mL纳米金加入400mL含有1mg/mL sulfo-NHS-LC-biotin的PBS缓冲液(0.1mol/L，pH 7.2)，在37℃转速为160转/分钟的恒温摇床上反应3.5h，然后采用超滤管(MWCO＝30kD)进行，以除去溶液中未反应的sulfo-NHS-LC-biotin。
(4)向上述生物素化的纳米金溶液中加入1.00mg/mL的链酶亲和素标记的辣根过氧化物酶(SA-HRP)和0.15mg/mL链霉亲和素(SA)，在37℃转速为160转/分钟的恒温摇床上反应40min，利用生物素与链酶亲和素之间的特异性相互作用使SA-HRP和SA连接到纳米金表面。然后在离心机上采用13500转/分钟的转速离心10min，除去上清液，利用0.1mol/LPBS(pH7.2)重悬后重复上述操作，以除去游离的SA-HRP和SA。
(5)向上述纳米金中加入0.01mg/mL、10mL的生物素化CEA抗体，在37℃转速为160转/分钟的恒温摇床上孵育40min，然后在离心机上以13500转/分钟的转速离心5min，除去上清并用PBS(0.1mol/L，pH 7.2)重悬，重复上述操作以除去游离的Biotinylated-Ab2，得到纳米金双功能探针。利用纳米金的SPR吸收峰对纳米金双功能探针进行定量，加入1％的BSA4℃保存备用。
制备例2免疫磁珠的制备
采用EDC/NHS活化法将CEA捕获抗体(即第一抗体，也简称为Ab1)共价偶联到羧基功能化磁珠表面得到免疫磁珠。其具体操作过程如下：
取10μL羧基功能化的超顺磁性微球(30mg/mL，300nm)，用0.1mol/LpH6.0的PBS洗两次。随后将其分散到1mL含有0.1mol/LEDC和0.1mol/LNHS的PBS(0.1mol/LpH6.0)溶液中，在37℃转速为160转/分钟的恒温摇床上活化60min。采用0.1mol/L pH为7.2的PBS洗涤四次后采用400μL的PBS缓冲液(0.1mol/L，pH7.2)重悬，加入10μL 0.55mg/mL的CEA捕获抗体(Ab1)，摇床上孵育反应10h。然后用0.1mol/L pH为7.2的PBS洗涤四次，除去游离的Ab1，分散到200μL含有1％BSA的PBS中封闭1h。最后将免疫磁珠分散到200μL含1％BSA和0.05％叠氮化钠的PBS(0.1mol/L，pH7.2)中，4℃保存备用。
制备例3磁性玻碳电极的处理和修饰
将直径为3mm的磁性玻碳电极(M-GCE)利用0.3μm和0.05μm的三氧化二铝粉末在麂皮上抛光至镜面，依次用无水乙醇、超纯水超声清洗半分钟，用大量超纯水冲洗干净后置于含有1mM铁氰化钾和1mM亚铁氰化钾的磷酸缓冲溶液(0.1M，pH7.0)中，在-0.2-0.6V的电势范围内进行循环伏安扫描，当铁氰化钾的氧化还原峰的电势差在80mV以下时表明电极表面状态良好。然后将处理干净的磁性玻碳电极浸入含有0.1mol/L乙二胺和0.1mol/L四丁基高氯酸铵(TBAP)的乙腈溶液中，以铂丝作为对电极和参比电极，在1.3V下恒电位氧化240s得到乙二胺修饰的磁性玻碳电极，4℃保存备用。
实施例1
该实施例用于说明本发明的试剂盒和检测方法，使用制备例1的纳米金双功能探针、制备例2的免疫磁珠和制备例3的磁性玻碳电极，采用如图2所示的方法进行CEA浓度的检测，具体如下。
(1)取20μL免疫磁珠加入到1mL待测样品(用PBS(0.1mol/L，pH 7.2)稀释100倍的待测人血清)中，在37℃转速为160转/分钟的恒温摇床上孵育反应30min，将离心管置于磁力架上，用洗涤液(含有0.4质量％脱脂奶粉和0.05质量％吐温的PBS缓冲液，0.1mol/L、pH7.2)洗涤3次，除去溶液中游离的CEA及其它复杂基质，得到免疫磁珠-CEA复合物。
(2)将上述免疫磁珠-CEA复合物分散到100μL含有纳米金双功能探针的PBS缓冲液(0.1mol/L，pH7.2)中，在37℃转速为160转/分钟的恒温摇床上孵育40min，然后用磁力架吸附磁珠，洗涤液洗涤3次，除去未反应的纳米金双功能探针，得到免疫夹心复合物。
(3)电化学检测。免疫反应结束后，将上述免疫夹心复合物捕获到乙二胺修饰的磁性玻碳电极表面，插入含有2mmol/L对苯二酚和3mmol/LH2O2的检测液(pH7.0)中，采用Ag/AgCl作为参比电极，铂丝电极作为对电极，在0.10-0.15V的电势范围内进行差分脉冲伏安(DPV)扫描，利用所检测到的电化学信号对CEA进行定量检测。
对比例1
本对比例用于说明以玻碳电极作为免疫反应的固相载体对CEA进行检测。
采用玻碳电极作为免疫反应的固相载体，首先利用与制备例3中相同的方法，通过自由基反应将乙二胺共价修饰到玻碳电极表面，然后利用戊二醛将Ab1(同制备例1)共价修饰到玻碳电极表面，采用制备例1的纳米金双功能探针作为信号标记对CEA进行检测，具体实验步骤如下：
(1)Ab1修饰玻碳电极的制备。将处理好的玻碳电极置于含有0.1mol/L乙二胺和0.1mol/L TBAP的乙腈溶液中，以铂丝作为对电极和参比电极，在1.3V下恒电位氧化240s得到乙二胺修饰的玻碳电极。依次采用无水乙醇和超纯水洗涤，氮气吹干，然后在电极表面滴加5μL 2％戊二醛，常温避光反应1h，用超纯水洗涤氮气吹干后，向电极表面滴加5μL 2ng/mL的Ab1，室温下放置2h后4℃放置过夜，然后用1％BSA封闭1.5h，得到CEA抗体共价修饰的玻碳电极。
(2)在玻碳电极上进行免疫反应。采用实施例1的免疫反应方法，不同之处仅在于，加长每步反应时间，与癌胚抗原孵育时间1h，用洗涤液洗净后再与纳米金双功能探针反应1h，以保证免疫反应达到平衡。
(3)电化学检测。将免疫反应后的玻碳电极插入含有对苯二酚和H2O2的检测液中，采用Ag/AgCl作为参比电极，铂丝电极作为对电极，在0.10～-0.15V的电势范围内进行差分脉冲伏安扫描，利用所检测到的电化学信号对CEA进行定量检测。
对比例2
该对比例用于说明以生物素化的CEA抗体及SA-HRP作为信号标记对CEA进行检测的方法。
采用生物素化的CEA抗体以及SA-HRP作为信号探针，免疫磁珠作为免疫反应的固相载体对CEA进行检测，具体实验步骤如下：
(1)免疫磁珠捕获CEA，其操作过程与实施例1中的步骤(1)相同。
(2)将磁珠-CEA复合物分散到100μL含有Biotinylated-Ab2的PBS缓冲液(0.1mol/L，pH7.2)中，在37℃转速为160转/分钟的恒温摇床上反应30min，用洗涤液洗去游离的Biotinylated-Ab2。
(3)将上述夹心复合物分散到100μL含有2.5μg/mL SA-HRP的PBS缓冲液(0.1mol/L，pH 7.2)中，在37℃转速为160转/分钟的恒温摇床上孵育40min，用磁力架吸附洗涤液洗涤，除去溶液中游离的SA-HRP，得到磁性免疫夹心复合物。
(4)采用实施例1中步骤(3)的方法将上述磁性免疫夹心复合物捕获到乙二胺修饰的磁性玻碳电极表面进行检测，利用所检测到的电化学信号对CEA进行定量检测。
测试例1
利用紫外可见分光光度计和透射电镜对纳米金以及纳米金双功能探针进行表征。图3中的A表示GSH-AuNPs(a)和纳米金双功能探针(b)的UV-vis吸收光谱；图3中的B表示GSH-AuNPs(a)和纳米金双功能探针(b)的TEM图像。
如图3中的A所示，GSH-AuNPs在522nm处出具有良好的SPR吸收峰，纳米金双功能探针的SPR吸收峰红移至550nm处。其主要原因一方面是由于蛋白质的修饰；另一方面由于链酶亲和素具有四个生物素结合位点，将其与生物素化的纳米金进行结合时有可能通过一个链酶亲和素将两个纳米金连接到一起，从而引起SPR吸收峰的红移。如图3中的B所示，本发明中的纳米金具有良好的分散性，其平均粒径约为12.5nm，制备成纳米金双功能探针后其平均尺寸没有发生明显变化，部分纳米金探针由两颗或者多颗纳米金结合到一起构成，这样能够增加单个探针上修饰的HRP信号分子以及捕获抗体的个数，从而放大检测信号。从放大图中可以清晰看出，与a图中的纳米金相比，b图中的纳米金双功能探针周围有一圈阴影，可能是由于对纳米金进行修饰时所引入的长链烷烃和蛋白质造成的。
另外，还通过动态光散射对修饰前后纳米金的Zeta电位进行表征，纳米金的Zeta电位为-20.2±0.3mV，而纳米金双功能探针的Zeta电位为-30.0±1.7mV。
上述这些结果都可以证明纳米金双功能探针被成功制备。
测试例2
采用实施例1的方法将纳米金双功能探针应用于肿瘤标志物CEA的检测，检测结果如图4所示，表示其中(a)表示存在CEA时获得的电化学信号，(b)表示不存在CEA时获得的电化学信号。由图4可知，当检测液中存在CEA时，在磁性玻碳电极上能获得比较大的DPV信号，而当采用空白试剂时，只能得到比较小的电子媒介体HQ本身的背景信号。
上述结果证明利用基于磁珠的电化学免疫分析方法结合纳米金双功能探针能够成功应用于CEA的检测。
测试例3
利用透射电镜对实验组和对照组的免疫磁珠进行表征，所得到的结果如图5所示，实验组由于检测液中含有目标CEA，能够与纳米金双功能探针在免疫磁珠表面形成免疫夹心复合物，因此从电镜图上可以看到免疫磁珠周围连接了大量纳米金(图5中的A)。而对照组由于不含目标CEA，因此纳米金双功能探针不能结合到免疫磁珠上(图5中的B)。该实验结果也能证明本发明制备的纳米金双功能探针能够应用于CEA的检测。
另外，还利用动态光散射对磁珠免疫反应前后的Zeta电位的变化进行表征，磁珠本身的Zeta电位为-42.5±0.5mV，而进行免疫反应以后其Zeta电位变为-30.6±0.3mV。该结果也从侧面证明了磁珠表面发生了免疫反应。
测试例4
利用实施例1的方法，不同的是，采用图6中的纳米金双功能探针上SA与SA-HRP的比例进行测定(即制备例1中步骤(4)采用SA与SA-HRP的用量如下表1)，结果如图6所示。
表1
由图6可知，随着加入的SA与SA-HRP比例的逐渐增加，0.5ng/mL CEA的检测信号逐渐增大，当SA与SA-HRP的比例达到1：4时，检测信号达到最大，进一步增大其比例时，检测信号又逐渐变小。虽然每个SA有四个生物素结合位点，但是SA-HRP通过生物素-链酶亲和素之间的特异性相互作用结合到纳米金表面以后，再与生物素化CEA抗体结合的空间位阻会比较大，因此投入一定量的SA有利于生物素化的CEA抗体固定到纳米金双功能探针表面。另一方面，HRP作为信号酶，当增加固定到纳米金双功能探针表面SA-HRP的量时能使电化学信号增大，但是SA-HRP投入量太多又会影响固定到纳米金双功能探针表面CEA抗体的量，同样不利于CEA的检测。
测试例5
利用实施例1的方法，不同的是，改变对差分脉冲伏安扫描的起始电势、检测液的pH以及检测液中底物H2O2和电子媒介体HQ的浓度等因素，研究其对于检测信号的影响。
图7表示电化学检测的初始电位(A)和检测液的pH(B)对背景信号的影响。如图7中的A所示，背景信号随着扫描起始电势的增加而增大。当起始电势低于0.10V时，背景信号较小，因此优选选择0.10V作为差分脉冲伏安扫描的起始电势。如图7中的B所示，当检测液的pH大于7.0以后，背景信号迅速增大，这是由于在偏碱性条件下HQ容易被检测液中的H2O2氧化而产生比较大的背景信号。
图8表示H2O2浓度(A)、HQ浓度(B)和检测液的pH(C)对DPV信号的影响。如图8中的A所示，检测信号随H2O2浓度的增加而增大，当H2O2的浓度增大到2mmol/L以后，检测信号趋于稳定。如图8中的B所示，检测信号随HQ浓度的增加而增大，当HQ的浓度达到2mmol/L以后，检测信号增加的速度变缓。如图8中的C所示，检测信号随检测液pH先增大后减小，当检测液pH为7.0时信号达到最大。
因此，优选使用pH7.0含有2mmol/L H2O2和2mmol/L HQ的PBS(0.1mol/L)作为检测液。
测试例6
采用实施例1的方法对CEA进行检测，不同的是，在如上述确定的最佳实验条件进行，结果如图9所示。
由图9可知，随着CEA浓度的增加得到的电化学信号逐渐增大，该方法的线性范围为0.2pg/mL～0.5ng/mL(R2＝0.994)，检出限(S/N＝3)为0.11pg/mL。表2示出了不同检测方法测定CEA的结果的简要概述。
表2
在表2中，前4种测试方法的结果来源分别如下：
*1：He,X.；Yuan,R.,Chai,Y.et al.A sensitive amperometric immunosensorfor carcinoembryonic antigen detection with porous nanogold film and nano-Au/chitosan composite as immobilization matrix[J].Journal of Biochemical andBiophysical Methods,2008,70,823-82.
*2：Li,H.；Shi,L.；Sun,D.-e.；Li,P.；Liu,Z.:Fluorescence resonance energytransfer biosensor between upconverting nanoparticles and palladiumnanoparticles for ultrasensitive CEA detection.Biosens.Bioelectron.2016,86,791-798.
*3：Wang,H.；Wang,Y.；Zhang,Y.；Wang,Q.；Ren,X.；Wu,D.；Wei,Q.:Photoelectrochemical Immunosensor for Detection of Carcinoembryonic AntigenBased on 2D TiO2 Nanosheets and Carboxylated Graphitic CarbonNitride.Sci.Rep.2016,6,27385.
*4：Wu,D.；Ma,H.；Zhang,Y.；Jia,H.；Yan,T.；Wei,Q.:Corallite-like MagneticFe3O4@MnO2@Pt Nanocomposites as Multiple Signal Amplifiers for the Detectionof Carcinoembryonic Antigen.ACS Appl.Mater.Interfaces 2015,7,18786-18793.
测试例7
本测试例用于测试方法的特异性。
为了考察本发明的方法对CEA检测的特异性，采用血清中可能会存在的一些物质，如50ng/mL多巴胺(dopamine，DA)、10ng/mL免疫球蛋白G(IgG)、50ng/mL人血清白蛋白(HSA)和20ng/mL葡萄糖氧化酶(GOD)作为阴性对照采用基于免疫磁分离和纳米金双功能探针多重放大的肿瘤标志物电化学免疫传感器进行检测，检测结果如图10所示。
由图10可知，使用的干扰物质的所检测到电化学信号都很弱，只有含有目标CEA的样品才可以检测到比较强的电化学信号，因此该方法具有比较好的特异性。
测试例8
本测试例用于测试方法的放大性能。
将本发明的方法(图11中的c)与直接利用玻碳电极作为免疫反应的固相载体进行检测(图11中的a)以及将纳米金双功能探针改成生物素标记的抗体以及SA-HRP作为信号标记物(图11中的b)进行比较。由图11可知，本发明的基于免疫磁分离和纳米金双功能探针多重放大的肿瘤标志物电化学免疫传感器可以对检测信号进行放大。
首先，该策略以纳米级的磁珠作为免疫反应的固相载体，其表面积远远大于普通电极(30μg磁珠的表面积约为3.0cm2，而直径为3mm玻碳电极的表面积约为0.14cm2)，而均匀分散在检测液中的免疫磁球可以实现对目标物的有效分离和富集，因此可以对检测信号进行放大(如图11中的a和c所示，以磁球作为免疫反应的固相载体所得到的电化学信号是以电极为反应载体的4倍)。另外采用纳米金双功能探针作为信号标记物同样可以对检测信号进行放大，如图11中的b和c所示，由于纳米金双功能探针可以实现多标记，与采用生物素标记的抗体和SA-HRP作为信号标记相比，其电化学信号被放大近两倍。此外采用纳米金双功能探针作为信号标记还可以减少反应步骤，从而减少免疫反应时间，实现快速检测。
测试例9
本测试例用于测试电极的再生性和方法的重现性。
由于对苯二酚在电极表面氧化还原的过程中容易在电极表面聚合，从而使工作电极毒化，因此采用恒电位氧化法，利用乙二胺的自由基反应将其修饰到磁性玻碳电极表面，所形成的乙二胺修饰层可以对磁性玻碳电极进行保护，同时也可以使电极通过简单的冲洗而得到再生。
为了研究乙二胺修饰的磁性玻碳电极的再生性，用同一支修饰电极对相同浓度的CEA平行检测4次，每次测定完后将电极表面的磁性免疫夹心复合物冲洗干净，然后用于下一个样品的检测，所得到的检测结果如图12所示。
由图12中的A可知，首先将磁性免疫夹心复合物捕获到乙二胺修饰的磁性玻碳电极表面，可以得到非常大的HRP的电化学信号(曲线a)，而当将磁性免疫夹心复合物从电极表面洗去以后，电化学信号消失(曲线b)，证明通过简单的冲洗可以将电极表面的磁球洗去。然后将该电极于下个样品的检测，又可以得到非常大的溶出伏安信号(图12中的B)。利用同一个电极对5ng/mL CEA连续测定四次所得到的DPV信号的相对标准偏差为3.3％，证明可以通过简单的冲洗实现在同一个电极上对多个样品的检测。
另外图12中的B中利用4支不同的乙二胺修饰的磁性玻碳电极对相同浓度的CEA进行检测。其相对标准偏差为3.7％，证明该方法具有比较好的重现性。
测试例10
本测试例用于测试复杂样品中CEA的检测。
为了考察该方法的抗干扰能力，对人血清中的CEA进行检测。具体地，将新鲜人血清样品用PBS(0.1mol/L，pH 7.2)稀释100倍，采用测试例6中所述的方法测定其中CEA的含量。然后向其中加入0.5ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL的CEA，测定其加标回收率。检测结果如表3所示。
表3
由表3可知，即使将人血清样品稀释100倍，仍然能检测出血清样品中CEA的含量，并且向稀释的人血清样品中分别加入0.5-5.0ng/mL CEA，其加标回收率在98％至104％之间，证明本发明的方法可以应用于复杂样品中CEA的检测。
从上述测试结果可以看出，通过将免疫磁分离、纳米金多标记以及酶催化放大相结合，构建了一种基于免疫磁分离和纳米金双功能探针多重放大的肿瘤标志物电化学免疫传感器。本发明的方法以磁球作为免疫反应的固相载体，以纳米金双功能探针作为信号标记，在免疫磁球表面进行免疫反应形成磁性免疫夹心复合物，然后利用磁性玻碳电极进行电化学检测，因此不仅可以避免复杂样品对工作电极的毒化，而且还可以通过磁富集、纳米金多标记以及酶催化反应实现对检测信号的多重放大。
在最佳实验条件下，该方法对CEA的线性范围为0.2pg/mL～0.5ng/mL，检出限为0.11pg/mL，该方法还具有好的特异性和强的抗干扰能力，可以实现对人血清样品中CEA的快速高灵敏检测。本发明建立了一种适用于现场的简单、快速、高灵敏的电化学免疫分析方法，在疾病的现场检测中具有广阔的应用前景。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于检测癌胚抗原的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括纳米金双功能探针和免疫磁珠；
其中，所述纳米金双功能探针包括纳米金颗粒以及连接在该纳米金颗粒上的第二抗体和检测标记物；
所述免疫磁珠包括磁珠和连接在该磁珠上的第一抗体；
所述第一抗体和所述第二抗体各自独立地为抗癌胚抗原的抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述第二抗体为生物素化的抗体，所述纳米金颗粒为生物素化的纳米金颗粒，所述第二抗体和所述纳米金颗粒通过链酶亲和素相互连接；
优选地，所述免疫磁珠通过EDC/NHS活化法将所述第一抗体与所述磁珠共价偶联而得；
优选地，所述纳米金颗粒的平均直径为8.4-13.5nm；所述磁珠的平均直径为300-500nm。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，以纳米金颗粒计的所述纳米金双功能探针与以磁珠计的所述免疫磁珠的摩尔比为1：6-18；
优选地，所述纳米金颗粒与所述第二抗体的摩尔比为1：3-10；
优选地，所述磁珠与所述第一抗体的摩尔比为1：5-12。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述检测标记物为辣根过氧化物酶；
优选地，所述链酶亲和素与所述根过氧化物酶的摩尔比为1：2-5，优选为1：3-5。
5.一种癌胚抗原的检测方法，其特征在于，该方法包括将纳米金双功能探针和免疫磁珠与待测样品接触，使得所述纳米金双功能探针、所述免疫磁珠与待测样品中的癌胚抗原反应得到免疫夹心复合物，并通过纳米金双功能探针上的检测标记物检测癌胚抗原；
其中，所述纳米金双功能探针包括纳米金颗粒以及连接在该纳米金颗粒上的第二抗体和检测标记物；
所述免疫磁珠包括磁珠和连接在该磁珠上的第一抗体；
所述第一抗体和所述第二抗体各自独立地为抗癌胚抗原的抗体。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其中，所述第二抗体为生物素化的抗体，所述纳米金颗粒为生物素化的纳米金颗粒，所述第二抗体和所述纳米金颗粒通过链酶亲和素相互连接；
优选地，所述免疫磁珠通过EDC/NHS活化法将所述第一抗体与所述磁珠共价偶联而得；
优选地，所述纳米金颗粒的平均直径为8.4-13.5nm；所述磁珠的平均直径为300-500nm。
7.根据权利要求5或6所述的检测方法，其中，以纳米金颗粒计的所述纳米金双功能探针与以磁珠计的所述免疫磁珠的摩尔比为1：6-18；
优选地，所述纳米金颗粒与所述第二抗体的摩尔比为1：3-10；
优选地，所述磁珠与所述第一抗体的摩尔比为1：5-12。
8.根据权利要求5-7中任意一项所述的检测方法，其中，所述检测标记物为辣根过氧化物酶；
优选地，所述链酶亲和素与所述根过氧化物酶的摩尔比为1：2-5，优选为1：3-5。
9.根据权利要求5-7中任意一项所述的检测方法，其中，使用差分脉冲伏安扫描测定检测标记物的量，差分脉冲伏安扫描的起始电势为0.05-0.15V，优选为0.08-0.1V；
优选地，检测液中的底物H2O2的浓度为2-4mmol/L。
10.权利要求1-4中任意一项所述的试剂盒或者权利要求5-9中任意一项所述的检测方法在检测癌胚抗原中的应用。
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