CN108535481A - 一种基于液晶的可视化检测肿瘤标志物的检测试剂盒 - Google Patents

一种基于液晶的可视化检测肿瘤标志物的检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测肿瘤标志物的检测试剂盒，属于分析检测领域。采用共价偶联了肿瘤标志物抗体的免疫磁球作为免疫反应的固相载体，利用免疫磁分离技术将目标肿瘤标志物进行分离和富集，再结合酶促金属化信号转换放大策略将标记酶的催化信号转换为液晶敏感膜表面沉积的金属纳米颗粒对液晶分子的扰乱，从而实现对目标肿瘤标志物的可视化检测。该方法将免疫磁分离技术与酶促金属化反应、液晶生物传感相结合，建立了基于免疫磁分离的液晶免疫分析方法，解决了液晶生物传感器应用于免疫分析时灵敏度不高、抗干扰能力不强的问题。该方法具有灵敏度高、操作简单、不需要复杂仪器、检测结果可视化等特点，可直接应用于复杂样品中肿瘤标志物的检测。

Description

一种基于液晶的可视化检测肿瘤标志物的检测试剂盒
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种基于液晶的可视化检测肿瘤标志物的检测试剂盒。
背景技术
液晶生物传感器是利用液晶分子作为信号转换元件而建立起来的一类分析检测方法。由于液晶分子的有序取向排列对基底膜表面的物理、化学性质非常敏感，因此通常可以利用生物分子在敏感膜表面的特异性识别作用所导致的敏感膜表面形貌、性质的改变来实现对目标生物分子的检测。但是复杂基质在敏感膜表面的非特异性吸附同样会影响液晶分子的有序排列，从而限制了其在实际复杂样品中的应用。另一方面，由于很多生物分子的尺寸不大，利用生物特异性识别作用(如抗原抗体反应)将其捕获到敏感膜表面所引起的液晶分子的扰乱作用比较有限，从而影响了方法的检测灵敏度。因此，如何提高液晶免疫传感器的检测灵敏度和抗干扰能力成为问题的关键。
发明内容
本发明提供一种基于液晶的可视化检测肿瘤标志物的检测试剂盒，该试剂盒能够简单、快速、高灵敏的可视化检测肿瘤标志物，是一种液晶免疫分析方法，以克服现有技术检测灵敏度不高、抗干扰能力不强等问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种肿瘤标志物检测试剂盒，包括：
(1)表面偶联了待检测肿瘤标志物抗体的免疫磁球；
(2)生物素化的待检测肿瘤标志物抗体；
(3)碱性磷酸酶标记的链霉亲和素；
(4)含有5mmol/L抗坏血酸-2磷酸酯的二乙醇胺-硝酸缓冲溶液；所述的二乙醇胺-硝酸缓冲溶液浓度为0.1～0.2mol/L，pH为9.8；
(5)0.5～1.0mol/L硝酸银水溶液；
(6)纳米金修饰的液晶敏感膜；
(7)5-CB液晶分子；
(8)DMOAP修饰的盖玻片。
本发明中所述的二乙醇胺-硝酸缓冲溶液浓度为0.1～0.2mol/L是以二乙醇胺为基准，即缓冲溶液中二乙醇胺的浓度为0.1～0.2mol/L。
进一步，优选的是，所述的待检测肿瘤标志物为癌胚抗原、甲胎蛋白或前列腺特异抗原，但不限于此，其他的肿瘤标志物或者病原体也可以采用该试剂盒进行检测。
进一步，优选的是，所述的免疫磁球的制备方法为：采用表面含有羧基功能基团的磁球，采用EDC/NHS将磁球表面的羧基活化，然后将待检测肿瘤标志物的抗体共价修饰到该磁球表面，然后用牛血清白蛋白进行封闭，得到免疫磁球。
进一步，优选的是，生物素化的待检测肿瘤标志物抗体的制备方法为：利用生物素化试剂sulfo-NHS-LC-biotin与待检测肿瘤标志物抗体表面的氨基进行反应，然后利用NAP-5脱盐柱进行纯化以除去多余的生物素化试剂，得到生物素化的待检测肿瘤标志物抗体。
进一步，优选的是，纳米金修饰的液晶敏感膜的制备方法为：首先采用谷胱甘肽作为配体，氯金酸作为金前体，硼氢化钠作为还原剂制备谷胱甘肽为配体的纳米金；之后利用硅烷化试剂DMOAP和APS对玻片进行硅烷化，使其表面带上能诱导液晶分子有序排列的长链烷烃以及能用于共价偶联的氨基，然后采用戊二醛作为偶联试剂将以谷胱甘肽为配体的纳米金共价偶联到玻片表面，得到纳米金修饰的液晶敏感膜。
进一步，优选的是，DMOAP修饰的盖玻片，其特征在于其制备方法为：采用含有体积分数为0.5％的N，N-二甲基-N-十八烷基-3-氨丙基三甲氧基甲硅烷水溶液对玻片进行硅烷化处理，反应完以后洗净烘干，得到DMOAP修饰的盖玻片。
进一步，优选的是，所述的磁球表面带有-COOH，直径为500nm。
采用上述试剂盒对肿瘤标志物进行检测的方法，包括如下步骤：
1)利用表面修饰了待检测肿瘤标志物抗体的免疫磁球对待检测样品中目标肿瘤标志物进行捕获，并采用免疫磁分离技术进行纯化，以除去待检测样品中的复杂基质；
2)将生物素化的目标肿瘤标志物抗体与上述磁球-肿瘤标志物复合物进行反应，然后再与碱性磷酸酶标记的链霉亲和素孵育，得到磁性免疫夹心复合物；
3)将含有5mmol/L抗坏血酸2-磷酸酯的二乙醇胺-硝酸缓冲溶液(0.1～0.2mol/L，pH 9.8)加入到磁性免疫夹心复合物中孵育一定时间，在磁力架上吸附磁球，取出上清液并加入是上清液体积1％的浓度为0.5～1.0mol/L的硝酸银水溶液，混匀后迅速滴加到纳米金修饰的液晶敏感膜表面，反应结束后将液晶敏感膜洗净吹干，滴加5-CB液晶分子并与DMOAP修饰的盖玻片组装成液晶池，利用偏光显微镜在正交偏光模式下进行观察、拍照，利用成像图片上光斑的数量、亮度及颜色来对目标肿瘤标志物进行可视化检测。
本发明中所述的磁球是表面具有一定的功能基团、能够与抗体等蛋白质进行偶联的磁性微球，例如表面带有-COOH、NH2、环氧基或醛基的磁性微球，在本发明实施例中，所采用的磁性微球表面带有-COOH，直径为500nm。
上述肿瘤标志物为与肿瘤相关的一些蛋白质，包括但不限于，例如癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、组织特异性抗原(PSA)等等。
基于上述方法，本发明还进一步提供了检测CEA的方法，该方法采用商品化表面带羧基的磁球，利用EDC/NHS活化法将CEA抗体共价偶联到磁球表面得到免疫磁球用于CEA的分离和富集，并利用生物素化的CEA抗体以及碱性磷酸酶标记的链酶亲和素(SA-ALP)作为信号标记，最后通过碱性磷酸酶催化其底物L-抗坏血酸2-磷酸酯(AA-2P)水解产生强还原性的抗坏血酸将Ag+还原成Ag0并沉积到纳米金修饰的液晶敏感膜表面，所产生的银纳米粒子会扰乱5-CB液晶分子在液晶敏感膜表面的有序排列而产生双折射现象以及光的干涉，最终利用偏光显微镜所得到的光学图像上的光斑数量、亮度及颜色来实现对目标CEA的高灵敏可视化检测。具体包括如下步骤：
(1)免疫磁球的制备：利用EDC/NHS活化法将CEA捕获抗体共价偶联到表面带羧基的磁性微球表面，并用牛血清白蛋白对免疫磁球进行封闭；
(2)生物素化CEA抗体的制备：利用生物素化试剂sulfo-NHS-LC-biotin与CEA抗体表面的氨基进行反应，然后利用NAP-5脱盐柱进行纯化，以除去多余的生物素化试剂，得到生物素化的CEA抗体；
(3)纳米金修饰的液晶敏感膜的制备：首先采用谷胱甘肽作为配体，氯金酸作为金前体，硼氢化钠作为还原剂制备谷胱甘肽为配体的纳米金；之后利用硅烷化试剂DMOAP和APS对玻片进行硅烷化，使其表面带上能诱导液晶分子有序排列的长链烷烃以及能用于共价偶联的氨基，然后采用戊二醛作为偶联试剂将以谷胱甘肽为配体的纳米金共价偶联到玻片表面，得到纳米金修饰的液晶敏感膜；
(4)DMOAP修饰的盖玻片的制备：采用含有体积分数为0.5％的DMOAP水溶液对玻片进行硅烷化处理，反应完以后洗净烘干，得到DMOAP修饰的盖玻片。
(5)免疫反应：将上述修饰了CEA抗体的磁球作为免疫反应的固相载体加入到含有CEA的样品溶液中，37℃恒温反应35分钟，在磁力架上除去待测样品中的复杂基质，得到免疫磁球-CEA复合物；然后将生物素化的CEA抗体加入到含有免疫磁球-CEA复合物的磷酸缓冲溶液(0.1mol/L，pH 7.2)中，37℃恒温反应30分钟，用磁力架吸附磁球，除去溶液中游离的生物素化的CEA抗体，再加入SA-ALP，37℃恒温反应30分钟，用磁力架吸附磁球并洗涤，除去多余的SA-ALP，得到磁性免疫夹心复合物；
(6)酶促金属化反应及检测：将含有5mmol/L L-抗坏血酸-2磷酸酯的二乙醇胺-硝酸缓冲溶液(0.1～0.2mol/L，pH 9.8)加入到上述磁性免疫假夹心复合物中，37℃恒温反应30分钟，利用磁力架吸附磁球，在上清液中加入是上清液体积1％的浓度为0.5～1.0mol/L的硝酸银水溶液，混匀后迅速滴加到在纳米金修饰的液晶敏感膜表面，37℃恒温避光反应15分钟，将液晶敏感膜洗净吹干，滴加5-CB液晶分子，盖上DMOAP修饰的盖玻片组装成液晶池，放置在偏光显微镜的恒温加热台上，在25℃～27℃温度下采用正交偏光模式进行观察、拍照，利用成像图片上光斑的亮度、数量及颜色来实现对CEA的可视化检测。
本发明建立了一种可视化检测肿瘤标志物的检测试剂盒。使用该试剂盒将免疫磁分离技术、酶促金属化反应以及液晶生物传感相结合，建立了基于免疫磁分离的液晶免疫分析方法，解决了液晶生物传感器用于免疫分析时检测灵敏度不高和抗干扰能力不强等问题。该方法具有灵敏度高、操作简单、不需要复杂仪器、检测结果可视化等特点，可直接应用于复杂样品中肿瘤标志物的检测。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
1、首次构建了一种基于免疫磁分离的液晶免疫传感器，利用磁球作为免疫反应的固相载体，可以将免疫反应和液晶可视化检测分离，有效避免复杂样品在液晶敏感膜表面的非特异性吸附，解决了液晶生物传感器抗干扰能力不强而无法用于复杂样品免疫分析的问题。
2、结合酶促金属化反应、纳米金诱导银沉积反应，将标记酶的催化产物以金属沉积的方式全部富集到纳米金修饰的液晶敏感膜表面，极大地放大了检测信号，解决了液晶免疫传感器灵敏度不高的问题。本发明对CEA的检测限低至1pg/mL，远远低于其他肿瘤标志物可视化分析方法的检测限，而且还可以进一步通过减少底物体积、延长酶催化反应时间而提高检测灵敏度。
3、首次实现了多色液晶免疫传感，相比于其它可视化免疫分析方法，该方法成像图片更加鲜艳，颜色更加丰富，不同浓度的目标物所对应的颜色变化非常明显，使检测结果更加可视化。
4、本发明对肿瘤标志物的可检测范围很宽，可实现1pg/mL～1μg/mL 6个数量级范围内CEA的可视化检测。
5、本发明方法抗干扰能力强、灵敏度高、不需要复杂仪器、检测结果可视化，可直接应用于复杂样品中肿瘤标志物的免疫分析，无需样品前处理过程，为肿瘤标志物的床旁诊断提供了一种新的方法。
附图说明
图1为基于免疫磁分离的液晶免疫传感器的检测原理示意图。(A)在离心管中进行免疫反应；(B)利用酶促金属化反应对基于液晶的可视化检测信号进行放大。
图2为利用基于免疫磁分离的液晶免疫传感器检测不同浓度CEA所得到的偏光显微镜成像图片，其中CEA的浓度分别为：(A)0；(B)1×10-3；(C)1×10-2；(D)1×10-1；(E)1；(F)10；(G)100；(H)1000ng/mL。A-D白色亮点逐渐增多，图E整个视野变亮并开始出现少量橙色干涉色，图F为亮橙色，图G为紫红色，图H为蓝绿色。
图3为采用血清中可能存在的干扰物质作为阴性对照所得到的CEA特异性检测图像：(A)50ng/mL葡萄糖氧化酶；(B)50ng/mL免疫球蛋白G；(C)50ng/mL人血清白蛋白；(D)0.1ng/mL CEA。
图4为人血清样品中CEA的检测结果：(A)稀释2000倍和(B)稀释1000倍的人血清样品以及(C)稀释1000倍的人血清样品利用120℃高温处理30分钟；往稀释了(D)2000倍及(E)1000倍的人血清样品中加入5ng/mL的CEA的检测结果。(其中图E呈现黄色干涉色)
图5为以谷胱甘肽为配体的纳米金的透射电镜图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
超顺磁性磁球(02150)购自法国Ademtech公司；
癌胚抗原(CEA)以及CEA抗体(1#Ab和2#Ab)购自南京三辰生物技术有限公司；
L-抗坏血酸-2-磷酸酯(AA-2P)、碱性磷酸酶(ALP)、EDC、NHS、谷胱甘肽(GSH)购于美国Sigma-Aldrich公司；
生物素化试剂sulfo-NHS-LC-biotin购自美国Thermo公司；
链酶亲和素-碱性磷酸酶(SA-ALP)购于美国Vector公司；
4-氰基-4'-戊基联苯(5-CB)购于Adamas试剂有限公司；
二乙醇胺(DEA)、硼氢化钠(NaHB4)购自上海阿拉丁试剂有限公司；
超滤管(MWCO＝30kD)购自millipore公司；
NAP-5脱盐柱购自GE Healthcare；
其它试剂都为分析纯，购自上海国药试剂有限公司。
XPN-2033型偏振光显微镜、KEL-XMT-3100温度程序控制仪购自上海长方光学仪器有限公司；5X-Optical zoom型数码摄像机购自日本Canon公司。
本领域技术人员应当知晓，本发明中的洗涤的目的是为了除去未反应的物质。
本发明除非另有说明，否则百分号为质量百分数。
实施例1肿瘤标志物-CEA的检测
下面以CEA为例，对本发明方法进行详细的说明。
一、方法
1、免疫磁球的制备
取5μL含有羧基官能团的超顺磁性微球(50mg/mL，直径为500nm)，用PBS(0.1mol/L，pH 6.0)洗涤三次，然后分散到含有0.1mol/L NHS和0.1mol/L EDC的PBS缓冲(pH 6.0，0.1mol/L)溶液中，在转速为130转/分钟37℃的恒温摇床上活化40分钟。用PBS缓冲溶液(pH7.2，0.1mol/L)洗涤三次，然后将其分散到600μL PBS缓冲(0.1mol/L，pH 7.2)溶液中，加入20μL 0.64mg/mL的CEA捕获抗体(1#Ab)，置于37℃恒温摇床上反应12h，再用pH 7.20.1mol/L PBS缓冲溶液洗涤三次，除去多余的抗体，分散到600μL含有1％BSA的PBS缓冲(pH7.2，0.1mol/L)溶液中封闭30min，然后将其分散到600μL含10mg/mL BSA和0.5mg/mL叠氮化钠的PBS缓冲(pH 7.2 0.1mol/L)溶液中，得到免疫磁球，在4℃的条件下保存，备用。
2、生物素化CEA抗体的制备
利用生物素化试剂sulfo-NHS-LC-biotin与CEA检测抗体(2#Ab)表面的氨基进行反应，从而将生物素偶联到CEA抗体上。
其操作过程如下：取20μL浓度为12.88mg/mL的2#Ab用pH 7.2 0.1mol/L的PBS溶液稀释到200μL，然后加入10μL新配制的含有1mg/mL sulfo-NHS-LC-biotin的PBS缓冲(pH7.2，0.1mol/L)溶液中，在转速为130转/分钟37℃的恒温摇床上孵育3小时，采用NAP-5脱盐柱除去多余的sulfo-NHS-LC-biotin，得到生物素化的CEA抗体。采用紫外可见分光光度计利用抗体在280nm处的吸光度对生物素化的CEA抗体进行定量，然后加入含有叠氮化钠和BSA的PBS缓冲(pH 7.2，0.1mol/L)溶液(叠氮化钠和BSA在生物素化CEA抗体溶液中的含量分别为0.5mg/mL和10mg/mL)并置于4℃冰箱中进行保存。
3、纳米金修饰的液晶敏感膜的制备
首先采用谷胱甘肽作为配体，氯金酸作为金前体，硼氢化钠作为还原剂制备以谷胱甘肽为配体的纳米金，该纳米金胶体稳定性好，表面具有丰富的氨基和羧基，有利于进一步修饰。
纳米金的具体制备步骤为：向1mL 1％的氯金酸水溶液中加入100μL 0.24mol/L谷胱甘肽(GSH)水溶液，室温下搅拌2分钟后缓慢滴加1mol/L NaOH溶液直至溶液中出现大量浅黄色沉淀(此时溶液pH介于2.5～3.0)。然后利用离心机离心，弃去上清液后将所得到的浅黄色沉淀用5mmol/L氢氧化钠溶液溶解，加入11mL超纯水，然后用1mol/L NaOH溶液调节pH值至7.0。向上述溶液中缓慢滴加100μL 0.1mg/mL新配的硼氢化钠溶液，直至反应液变成棕黄色，在600转/分钟磁力搅拌器上室温下反应4h，采用截留分子量为30kD的超滤管纯化，超滤管截留部分为纳米金，将其分散在4mL超纯水中，4℃保存备用，得到以谷胱甘肽为配体的纳米金，其透射电镜图如图5所示。
利用硅烷化试剂DMOAP和APS对玻片进行硅烷化，使其表面带上能诱导液晶分子有序排列的长链烷烃以及能用于共价偶联的氨基功能团，然后采用戊二醛作为偶联试剂将以谷胱甘肽为配体的纳米金共价偶联到玻片表面，得到纳米金修饰的液晶敏感膜。具体操作步骤为：将处理干净的18mm×18mm的玻片浸入含有体积百分浓度为1％DMOAP和体积百分浓度为5％APS的10mmol/L pH 5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液中在80℃恒温水浴锅中水浴加热反应1.5h，利用大量乙醇和超纯水冲洗玻片，然后采用N2吹干，放置在110℃烘箱中干燥1h，然后将其浸入体积百分浓度为1％的戊二醛水溶液中，室温反应1h，超纯水冲洗，N2吹干，得到醛基功能化的玻片基底；然后在玻片表面滴加200μL1.41×10-8mol/L谷胱甘肽为配体的纳米金，室温反应1h，用超纯水洗去未反应的纳米金后，采用0.1M甘氨酸室温封闭1h，采用超纯水冲洗三遍，N2吹干，得到纳米金修饰液晶敏感膜。
4、DMOAP修饰的盖玻片的制备
采用含有体积分数为0.5％的DMOAP水溶液对干净的玻片在室温下进行硅烷化，反应20min后用无水乙醇和超纯水分别冲洗三遍，以除去未反应的DMOAP，N2吹干，放置于110℃烘箱中干燥1h，得到DMOAP修饰的盖玻片。
5、CEA的可视化检测
(1)取20μL表面修饰有CEA抗体的免疫磁球加入到含有不同浓度CEA的样品中，在130转/分钟37℃的恒温摇床上反应35分钟，采用磁力架分离，再用洗脱液(含有0.5mg/mL吐温和4mg/mL脱脂奶粉的0.1mol/L pH 7.2PBS)洗涤2次，除去未反应的CEA和其他杂质，再用PBS(0.1mol/L，pH 7.2)洗涤一次，除去吸附的洗脱液，得到磁球-CEA复合物；
(2)将得到的磁球-CEA复合物分散到含有0.5μg/mL生物素化CEA抗体的PBS缓冲(pH 7.2 0.1mol/L)溶液中，在130转/分钟37℃的摇床上孵育30分钟，采用磁力架分离磁球，先用含有0.5mg/mL吐温和4mg/mL脱脂奶粉的0.1mol/L pH 7.2PBS洗脱液洗涤2次，再用pH 7.2 0.1mol/L的PBS洗涤一次，除去溶液中未反应的生物素化CEA抗体；
(3)将步骤(2)中得到的产物分散到含有5μg/mL碱性磷酸酶标记的链霉亲和素(SA-ALP)的PBS缓冲(0.1mol/L，pH 7.2)溶液中，混合均匀后置于130转/分钟37℃的恒温摇床上孵育30分钟，采用磁力架吸附磁球，并用0.5mg/mL吐温和4mg/mL脱脂奶粉)的0.1mol/LpH 7.2PBS洗脱液洗涤2次，再用pH 7.2 0.1mol/L的PBS洗涤1次，除去多余的SA-ALP，形成磁性免疫夹心复合物；
(4)向步骤(3)中得到的磁性免疫夹心复合物中加入200μL pH 9.8含有5mmol/LL-抗坏血酸-2-磷酸酯(AA-2P)的二乙醇胺-硝酸缓冲溶液(0.1mol/L，pH 9.8)，置于130转/分钟37℃恒温摇床中反应30分钟，采用磁力架分离，取上清液并加入2μL 0.5mol/L硝酸银水溶液(使其终浓度为5mmol/L)，混匀后全部滴加到纳米金修饰的液晶敏感膜表面，37℃恒温避光反应15分钟，反应结束后将玻片用超纯水洗涤干净，N2吹干。
(5)将上述玻片作为基底，滴加4-氰基-4'-戊基联苯(5-CB)液晶分子，盖上DMOAP修饰的盖玻片组装成液晶池，放置在偏光显微镜的恒温加热台上，在25℃～27℃温度下采用正交偏光模式进行观察、拍照，利用成像图片上光斑的亮度、数量及颜色来实现对CEA的可视化检测。
4、特异性实验
采用浓度比CEA高500倍的葡萄糖氧化酶(GOD)、人血清蛋白(HSA)和免疫球蛋白G(lgG)作为阴性对照，采用上述方法进行检测，所得到的检测结果与0.1ng/mLCEA的检测结果进行比较。
5、人血清样品中CEA的检测
将该方法应用于人血清中CEA的检测。具体操作如下：取新鲜人血清分别稀释1000倍和2000倍，加入5mM钒酸钠，然后利用上述方法进行测定，同时将人血清利用120℃灭活后作为对照，比较其检测结果。另外采用一定量的CEA对稀释的人血清样品进行加标回收测定。
二、结果
1、CEA的检测原理
采用基于免疫磁分离的液晶免疫传感器检测CEA的原理如图1所示，采用共价偶联了CEA抗体的免疫磁球作为免疫反应的固相载体，首先捕获样品中的目标CEA，再分别与生物素化的CEA抗体及碱性磷酸酶标记的链霉亲和素(SA-ALP)进行反应，得到免疫磁球-CEA-碱性磷酸酶磁性免疫夹心复合物，最后利用磁性免疫夹心复合物表面的碱性磷酸酶催化其底物L-抗坏血酸2-磷酸酯水解产生抗坏血酸，而强还原性的抗坏血酸能够在修饰了纳米金的敏感膜表面快速将Ag+还原成Ag0并沉积到敏感膜表面，所形成的金属纳米颗粒会扰乱5CB液晶分子在液晶敏感膜表面的有序排列，从而产生双折射现象以及光的干涉，最终可以利用偏光显微镜所得到的光学图像上光斑的数量、亮度及颜色来实现对目标CEA的高灵敏可视化检测。
由于液晶分子的有序排列对基底膜表面的物理、化学性质非常敏感，而复杂基质在敏感膜表面的非特异性吸附可能会影响液晶分子的有序排列，从而限制了液晶传感器在实际复杂样品中的应用。另一方面很多生物分子的尺寸不大，利用生物特异性识别作用(如抗原抗体反应)将其捕获到敏感膜表面所引起的液晶分子的扰乱作用比较有限，从而影响了方法的检测灵敏度。首先，而本发明所建立的基于免疫磁分离的液晶免疫传感器利用磁球作为免疫反应的固相载体，将免疫反应和液晶可视化检测分离，避免复杂样品对液晶双折射信号的干扰，因此可以实现复杂样品的可视化液晶免疫分析。其次，本发明结合酶促金属化信号放大策略和纳米金诱导银沉积反应，可以很好地将酶催化产物全部富集到液晶敏感膜表面，实现了对检测信号的放大。另外，该方法还具有一定的普适性，将捕获抗体和标记抗体换成其他物质的抗体，如：病毒、细菌、蛋白等的抗体以后，有望实现其它物质(如病毒、细菌、蛋白)的高灵敏可视化液晶免疫分析。
2、CEA的检测
该方法对CEA的检测结果如图2所示，随着CEA浓度的增大，出现在偏光显微镜灰黑色背景上的白色亮点逐渐增多，光斑逐渐变大，当CEA的浓度大于1ng/mL(图2E)以后，光斑开始连成片并逐渐呈现出色彩丰富的织构图像，其颜色逐渐由白色变成橙色(图2F)、紫红色(图2G)最后变成蓝绿色(图2H)，其主要原因是由于免疫夹心复合物表的碱性磷酸酶通过酶促金属化反应使银离子还原成银单质沉积在纳米金修饰的液晶敏感膜表面，从而扰乱液晶分子的有序排列而产生双折射现象，随着CEA浓度的增加，沉积到玻片液晶敏感膜表面的银纳米颗粒逐渐增多、尺寸逐渐变大，从而扰乱更多5CB液晶分子的有序排列。因此随着CEA浓度的增加，通过偏光显微镜检偏镜的光线逐渐增多，成像图片上的光斑数量及亮度逐渐增大。当扰乱的液晶分子增加到一定程度以后，出射光会表现出明显的光的干涉现象，而呈现出不同的颜色。因此可以通过偏光显微光学图像上光斑的亮度、数量以及颜色的变化来实现对CEA的高灵敏可视化检测，采用该方法可以在1pg/mL～1μg/mL浓度范围内实现对CEA的定性及半定量检测，检测限低至1pg/mL，而且还可以进一步通过减少底物体积、延长酶催化反应时间来提高检测灵敏度。
3、特异性
本发明同时选择血液中可能会存在的一些干扰物质如：葡萄糖氧化酶、免疫球蛋白G、人血清白蛋白作为阴性对照采用基于免疫磁分离的液晶免疫传感器进行检测，检测结果如图3所示，即使这些干扰物质的浓度比CEA的浓度高出500倍，仍然只能得到含有少量白色亮点的背景信号，而0.1ng/mLCEA样品可以得到非常大的光学信号(图3D)。因此我们所建立的液晶免疫传感器具有良好的特异性。
4、人血清中CEA的检测
为了证明该方法可以用于实际复杂样品中CEA的检测，我们将新鲜人血清样品稀释不同的倍数后采用该方法进行检测，检测结果如图4(A,B)所示，由于人血清中都含有一定量的CEA，因此我们对稀释的人血清样品直接进行检测就能得到检测信号。随着稀释倍数的减少偏光显微镜检测到的光学信号逐渐增大，即使我们将血清样品稀释2000倍，仍然能检测到明显的光学信号(图4A)。为了证明该信号并不是来自于人血清样品中复杂成分在液晶敏感膜表面的非特异性吸附所产生的假阳性检测结果，我们对稀释1000倍的人血清样品利用120℃高温处理30分钟后再利用该方法进行检测，由于高温处理可以使血清样品中CEA的蛋白质结构发生变化，因此不再能与免疫磁球上的捕获抗体进行特异性反应，因此高温处理以后的人血清样品只能得到非常弱的背景信号(图4C)，证明人血清样品中的复杂成分不会对基于免疫磁分离的液晶免疫分析产生干扰。该策略通过结合免疫磁分离技术，样品中的复杂物质能够被全部除去，不会对液晶可视化检测产生干扰。
同时本发明还对稀释的血清样品进行加标实验，我们分别向稀释不同倍数的血清样品中加入5ng/mL的CEA，检测结果如图4所示，加标后的血清样品(图4D和E)与加标前的样品(图4A和B)相比其检测信号明显变大，检测结果呈现出大片的光斑并出现明显的干涉色。将这些检测结果与CEA的标准检测结果(图2)进行比对即可进行半定量分析，其检测结果与加标量能很好吻合，证明该方法能够用于人血清中CEA的检测。
通过以上各项检测，证明本发明方法可以应用于CEA的可视化检测，该方法具有灵敏度高、选择性好、抗干扰能力强、检测结果可视化，而且不需要复杂的仪器等特点。本发明方法还可以推广到其他的肿瘤标志物或者病原体的检测。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (7)

1.一种肿瘤标志物检测试剂盒，其特征在于，包括：
（1）表面偶联了待检测肿瘤标志物抗体的免疫磁球；
（2）生物素化的待检测肿瘤标志物抗体；
（3）碱性磷酸酶标记的链霉亲和素；
（4）含有5 mmol/L抗坏血酸-2磷酸酯的二乙醇胺-硝酸缓冲溶液；所述的二乙醇胺-硝酸缓冲溶液浓度为0.1~0.2 mol/L，pH为9.8；
（5）0.5~1.0 mol/L硝酸银水溶液；
（6）纳米金修饰的液晶敏感膜；
（7）5-CB液晶分子；
（8）DMOAP修饰的盖玻片。
2.根据权利要求1所述的肿瘤标志物检测试剂盒，其特征在于，所述的待检测肿瘤标志物为癌胚抗原、甲胎蛋白或前列腺特异抗原。
3.根据权利要求1所述的肿瘤标志物检测试剂盒，其特征在于，所述的免疫磁球的制备方法为：采用表面含有羧基功能基团的磁球，采用EDC/NHS将磁球表面的羧基活化，将待检测肿瘤标志物的抗体共价修饰到该磁球表面，然后用牛血清白蛋白进行封闭，得到免疫磁球。
4.根据权利要求1所述的肿瘤标志物检测试剂盒，其特征在于，生物素化的待检测肿瘤标志物抗体的制备方法为：利用生物素化试剂sulfo-NHS-LC-biotin与待检测肿瘤标志物抗体表面的氨基进行反应，然后利用NAP-5脱盐柱进行纯化以除去多余的生物素化试剂，得到生物素化的待检测肿瘤标志物抗体。
5.根据权利要求1所述的肿瘤标志物检测试剂盒，其特征在于，纳米金修饰的液晶敏感膜的制备方法为：首先采用谷胱甘肽作为配体，氯金酸作为金前体，硼氢化钠作为还原剂制备谷胱甘肽为配体的纳米金；之后利用硅烷化试剂DMOAP和APS对玻片进行硅烷化，使其表面带上能诱导液晶分子有序排列的长链烷烃以及能用于共价偶联的氨基，然后采用戊二醛作为偶联试剂将以谷胱甘肽为配体的纳米金共价偶联到玻片表面，得到纳米金修饰的液晶敏感膜。
6.根据权利要求1所述的肿瘤标志物检测试剂盒，其特征在于，DMOAP修饰的盖玻片，其特征在于其制备方法为：采用含有体积分数为0.5%的N，N-二甲基-N-十八烷基-3-氨丙基三甲氧基甲硅烷水溶液对玻片进行硅烷化处理，反应完以后洗净烘干，得到DMOAP修饰的盖玻片。
7.根据权利要求1所述的肿瘤标志物检测试剂盒，其特征在于，所述的磁球表面带有-COOH，直径为500nm。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109387641A (zh) * 2018-12-20 2019-02-26 深圳职业技术学院 一种以磁性氧化铁纳米粒子为信号放大器检测天蚕素b的装置及检测方法
CN109724949A (zh) * 2019-03-25 2019-05-07 青岛大学 一种用于肿瘤标志物可视化检测的上转换发光柔性杂化膜的制备方法
CN110133252A (zh) * 2019-05-10 2019-08-16 湖北民族大学 用于检测癌胚抗原的试剂盒和检测方法及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102914650A (zh) * 2012-06-14 2013-02-06 北京大成生物工程有限公司 神经元特异性烯醇化酶定量检测试剂盒及其制备方法与应用
CN103713134A (zh) * 2013-12-17 2014-04-09 武汉大学 一种可视化检测病毒的检测试剂盒及其检测方法
CN103868913A (zh) * 2014-02-11 2014-06-18 中生北控生物科技股份有限公司 碱性磷酸酶的酶促化学发光底物液
CN104698184A (zh) * 2015-02-10 2015-06-10 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 检测糖类抗原的试剂盒及其检测方法和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102914650A (zh) * 2012-06-14 2013-02-06 北京大成生物工程有限公司 神经元特异性烯醇化酶定量检测试剂盒及其制备方法与应用
CN103713134A (zh) * 2013-12-17 2014-04-09 武汉大学 一种可视化检测病毒的检测试剂盒及其检测方法
CN103868913A (zh) * 2014-02-11 2014-06-18 中生北控生物科技股份有限公司 碱性磷酸酶的酶促化学发光底物液
CN104698184A (zh) * 2015-02-10 2015-06-10 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 检测糖类抗原的试剂盒及其检测方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUI TAN，ET AL: "Signal-Enhanced Liquid-Crystal DNA Biosensors Based on Enzymatic Metal Deposition", 《ANGEW.CHEM.INT.ED.》 *
SHENGYUAN YANG，ET AL: "Gold nanoparticle based signal enhancement liquid crystal biosensors for DNA hybridization assays", 《CHEM.COMMUN.》 *
王莉: "新型液晶传感器用于蛋白质分子检测的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（工程科技辑）》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109387641A (zh) * 2018-12-20 2019-02-26 深圳职业技术学院 一种以磁性氧化铁纳米粒子为信号放大器检测天蚕素b的装置及检测方法
CN109724949A (zh) * 2019-03-25 2019-05-07 青岛大学 一种用于肿瘤标志物可视化检测的上转换发光柔性杂化膜的制备方法
CN110133252A (zh) * 2019-05-10 2019-08-16 湖北民族大学 用于检测癌胚抗原的试剂盒和检测方法及其应用

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