CN112326623A - 一种双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签、制备方法及免疫层析应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签、制备方法及免疫层析应用。该双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签由内到外依次包括：SiO2内核、PEI层、胶体金层、第一DTNB层、纳米Ag层和第二DTNB层；所述第二DTNB层的表面耦联新型冠状病毒重组抗原S蛋白。本发明还公开了上述复合纳米标签的制备方法以及其在免疫层析检测中的应用。该复合纳米标签在短时间内，同时检测临床血液样本中抗新冠IgM和IgG，具有超高的灵敏度及100％的准确度；并且分散性好、稳定性强且易于大批量制备，可用于复杂样本体系中目标物质的捕获、富集及快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及新型纳米材料及表面增强拉曼散射(SERS)领域，具体涉 及一种双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签、制备方法及免疫层析 应用。
背景技术
新型冠状病毒(COVID-19)具有高度传染性，容易通过空气(气溶胶、呼 吸道飞沫)和直接接触身体表面传播。一些COVID-19患者无明显症状，但 仍有传染性。到目前为止可以预防或治疗COVID-19的疫苗和药物少之甚 少，因此，及时、准确地诊断疑似病例是控制疫情的最有效途径。实时逆 转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和计算机断层成像等常用诊断技术已应用于 COVID-19的临床诊断，对重症患者具有良好的准确性和可靠性。但这些方 法存在假阴性率较高，检测时间长、检测地点具体、需要专业人员且设备 昂贵等缺点并且在早期患者和无症状携带者的快速筛查方面仍有不足之 处。
SERS免疫层析检测是一种将SERS与标记免疫学相结合，利用SERS 的高灵敏度和光谱选择性，结合抗体抗原的特异反应作用而进行的免疫分 析技术。将SERS标记检测技术与免疫层析检测技术相结合，近年来已成为 相关领域研究的热点。但传统依赖金/银胶体作为基底的免疫层析技术具有 检测灵敏度低、只能定性或半定量检测的缺陷。SiO2纳米颗粒具有稳定性 好、分散性强、粒径大小可控、生物毒性低且可通过离心分离，离心后不 易团聚等优点。所以基于SiO2纳米颗粒合成的新型拉曼增强纳米材料可代 替传统金/银胶体SERS标签作为多功能SERS标签用于免疫层析检测。
因此，特提出本发明。
发明内容
本发明提供了一种新型双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签， 所述复合纳米标签具有可控粒径、单分散性好的特点；所述双层拉曼分子 标记的硅核银壳复合纳米标签的制备基于聚乙酰亚胺(PEI)自组装，制备 过程简单、高效、可重复。本发明还提供了上述双层拉曼分子标记的硅核 银壳拉曼增强纳米标签作为SERS标签在免疫层析系统检测中的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签，包括：由内到外依 次包括：SiO2内核、PEI层、胶体金层、第一DTNB层、纳米Ag层和第二 DTNB层；
所述第二DTNB层的表面耦联新型冠状病毒重组抗原S蛋白。
DTNB是指5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoicacid))的简称。
作为一个总的发明构思，本申请还提供了一种双层拉曼分子标记的硅 核银壳复合纳米标签的制备方法，具体为以下步骤:
(1)在SiO2表面沉积PEI形成表面带正电荷的SiO2@PEI颗粒，将 SiO2@PEI颗粒加入到胶体金溶液中制备SiO2@Au-seed复合物；
将SiO2颗粒加入到水溶液中，通过超声反应使SiO2颗粒单分散，形成 SiO2的水溶液；将得到的SiO2水溶液加入到聚乙烯亚胺(PEI)溶液中，通 过超声反应使PEI在SiO2纳米颗粒表面自组装形成表面带正电荷的 SiO2@PEI颗粒；将SiO2@PEI颗粒离心后用去离子水清洗除去溶液中多余 的PEI，保存在去离子水中待用；
将合成的SiO2@PEI颗粒加入到带负电的3nm胶体金中，通过超声反 应使上述SiO2@PEI颗粒表面吸附一层胶体金颗粒，获得种子化SiO2复合 物(SiO2@Au-seed)；
(2)将步骤(1)所得的SiO2@Au-seed复合物在超声条件下与5,5'- 二硫代双(2-硝基苯甲酸)DTNB溶液反应，通过Au-S键连接，形成 SiO2@Au-seed/DTNB纳米颗粒，完成第一层拉曼分子的标记；将 SiO2@Au-seed/DTNB离心后用去离子水清洗除去溶液中多余的PEI，保存 在去离子水中待用；
(3)将步骤(2)所得的SiO2@Au-seed/DTNB纳米颗粒以PVP(聚乙 烯吡咯烷酮)作为保护剂，AgNO3为原料，氨水为催化剂，甲醛为还原剂， 将银离子快速还原沉积，胶体金长大形成连续的、粗糙的纳米银外壳 (SiO2@Ag)，形成纳米银外壳的SiO2@Ag纳米颗粒；将SiO2@Ag离心 后用去离子水清洗除去溶液中多余的PEI，保存在去离子水中待用；
(4)将步骤(3)所得的SiO2@Ag纳米颗粒在超声条件下再次与5,5'- 二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)反应，通过Ag-S键连接，形成 SiO2@Ag/DTNB纳米颗粒，完成第二层拉曼信号分子标记；
(5)将步骤(4)所得的SiO2@Ag/DTNB纳米颗粒在碳二亚胺溶液和 N-羟基琥珀酰亚胺溶液的作用下，末端羧基被活化直接耦联新型冠状病毒 重组抗原S蛋白形成双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签。
上述的双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签制备方法，所述步 骤(1)中，所述SiO2核心颗粒的制备方法采用改进的
化学沉淀法制 备，硅源采用正硅酸乙酯(TEOS)，溶剂采用无水乙醇，还原剂采用28％ 氨水，室温反应4h。
上述的双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签制备方法，所述步 骤(1)中，PEI的分子量为5000～80000，PEI溶液的浓度为0.5mg/mL～ 5mg/mL，优选为1mg/mL；所述超声时间为20～60min，优选为40min， 所述离心后清洗转速和时长为6000r/min,6min，所述离心后清洗次数为2 次。
上述的双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签制备方法，所述步 骤(1)中，3nm胶体金用量优选为200mL；所述的超声反应的时间为20～ 60min，优选为30min；所述离心后清洗转速和时长为5000r/min,6min。
上述的双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签制备方法，所述步 骤(2)中，DTNB浓度优选为10μM；所述超声时间为30～90min，优选 为60min，所述离心后清洗转速和时长为5000r/min,6min。
上述的双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签制备方法，所述步 骤(3)中，所述AgNO3的浓度为0.1～0.5mM，优选为0.35mM；甲醛与 氨水的比例为2:1～3:1，优选为2:1；所述离心后清洗转速和时长为3000 r/min,6min，所述离心后清洗次数为1～2次。
上述的双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签制备方法，所述步 骤(4)中，DTNB浓度优选为10μM，碳二亚胺溶液和N-羟基琥珀酰亚胺 溶液浓度分别优选为0.01M和0.1M，所述超声时间为30～90min，优选 为60min；所述步骤(5)中，所述的活化反应时间为10～30min，优选为 15min。
作为一个总的发明构思，本发明还提供一种上述双层拉曼分子标记的 硅核银壳复合纳米标签作为免疫层析检测系统的多功能SERS标签在临床 血清样本中的应用。所述应用包括：将所述双层拉曼分子标记的硅核银壳 复合纳米标签重悬于缓冲液中，加入金标稀释液混匀后铺在硝酸纤维素膜 上制作结合垫；
在同一硝酸纤维素膜上包被两条检测线，分别为抗人IgM和抗人IgG； 一条质控线，为S蛋白抗体；
将所述结合垫、所述硝酸纤维素膜与吸水垫、样品垫，底板组装成试 纸条；
将待测样品分别滴加到所述免疫层析试纸条的样品垫上，静置15-20 分钟后，同时读取两条检测线上的拉曼信号，达到对阳性血清中IgM、IgG 两种抗体同时定量检测。
在一个具体的实施方案中，所述缓冲液为含Tween 20、BSA、NaN3的 10mM PBS缓冲液，Tween 20的含量为0～1％，优选为0.05％、BSA的浓 度为0～10％，优选为5％、NaN3的浓度为0～0.1％，优选0.02％；加入的 金标稀释液的体积为500～200μL，优选为100μL。
在一个具体的实施方案中，所述抗人IgM的浓度为0.2～1.0mg/mL， 优选为0.5mg/mL；抗人IgG的浓度为0.2～1.0mg/mL，优选为0.5mg/mL； 新型冠状病毒S蛋白抗体的浓度为0.2～1.0mg/mL，优选为0.5mg/mL。
在一个具体的实施方案中，所述硝酸纤维素膜型号为CN140，质控线 下存在两条检测线，两条检测线和质控线的间距均为5mm。
将人类临床血清以不同倍数稀释后插入免疫层析试纸条(检测线处分 别划有抗人IgM和IgG)，15分钟后读取免疫层析试纸条检测线处的拉曼 信号，从而实现人类临床血清中的IgM和IgG的快速、高灵敏检测。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
(1)本发明提出的双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签性能优 越，从结构上看，具有双层拉曼信号分子，可提供更强的拉曼信号；具有 可调控的SiO2核心，可控制复合纳米材料的大小；此外该材料的分散性好、 稳定性强、易储存，羧基化纳米银外壳提供了新型冠状病毒重组抗原S蛋 白偶联的位点，是目前综合性能最先进的硅核银壳复合纳米材料。
(2)本发明提出采用PEI自组装法制备双层拉曼分子标记的硅核银壳 复合纳米标签，制备方法便捷、成熟、重复性好，可实现批量生产。
(3)本发明提出的双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签具有广 阔的应用前景，包括在生物成像、生物传感、现场快速检测等领域的应用。 双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签可作为高性能的SERS免疫标 签用于临床血清样本中抗新冠IgM和IgG的快速捕获与富集，避免了样本 复杂的前处理过程。
(4)本发明提出的双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签作为多 功能SERS标签用于免疫层析检测，既可以富集目标物质，又可以提供超强 拉曼信号，因此可以有效提高SERS免疫层析检测的灵敏度，尤其适用于低 浓度样本的快速定量检测。所述检测过程操作简单、得出结果较快且灵敏 度极高，可同时对IgM和IgG进行检测，最低检测限可达稀释1.28×107倍。
综上，本发明的双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签，制备路 线简单、高效、可重复。使用粒径可控的SiO2作为核心，实现了该纳米标 签的可控制备。且粒径均一，分散性好，表面的羧基易于抗体修饰，在生 物样本检测特别是超敏SERS免疫层析检测领域具有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下 面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍， 显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普 通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获 得其他的附图。
图1为本发明的双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签的制备方 法示意图；
图2为本发明的双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签制备过程 中各组分的透射电子显微镜图及元素面扫描结果，其中A图为SiO2纳米颗 粒，B图为SiO2@Au-seed纳米颗粒，C图为SiO2@Ag纳米颗粒，D-F图分 别为放大倍数后SiO2、SiO2@Au-seed、SiO2@Ag纳米颗粒的透射电子显微 镜图，G图为SiO2@Ag纳米颗粒元素面扫描图；
图3为本发明实例1的双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签的 制备过程表征图，其中A图为SiO2、SiO2@PEI、SiO2@Au-seed和SiO2@Ag 纳米颗粒的UV可见光光谱结果，B图为上述各组分的zeta电位变化图，C 图为SiO2@Au-seed/DTNB、SiO2@Ag/DTNB及双层DTNB修饰的SiO2@Ag 纳米颗粒的SERS信号强度对比图；
图4为本发明实施例2的双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签 修饰S蛋白的制备过程；
图5为本发明实施例2的双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签 作为高性能SERS标签与免疫层析系统结合检测血清中人IgM和IgG的实 验流程图；
图6为本发明实施例3的双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签 作为高性能SERS标签与免疫层析系统结合检测血清中人IgM和IgG的前 期实验优化图，其中A图为NC膜选择优化，B图为上样液优化，C图为 制备SERS标签所用S蛋白浓度的优化，D图为免疫反应时间优化；
图7为本发明实施例3的双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签 及胶体金标签的免疫层析系统检测血清中人IgM和IgG的试纸条及拉曼光 谱分析结果。从图中可知，SERS结果的检测限比胶体金比色检测限高800 倍；
图8为本发明实施案例3基于双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米 标签的免疫层析系统检测临床血清(13例阳性，13例阴性)的检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然， 所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发 明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得 的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明制备的双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签，包括SiO2核心、PEI自组装层，银离子还原形成的外壳，双层DTNB分子。第一层拉 曼信号分子DTNB通过Au-S键牢固结合在SiO2@Au-seed表面，第二层DTNB 通过Ag-S键与Ag壳紧密结合。合成的硅核银壳复合纳米标签具有良好的分 散性与超强的SERS性能。
一种上述本实施例的双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签的制 备方法，如图1所示，包括以下步骤：
(1)制备SiO2@PEI纳米颗粒：
取1mL SiO2颗粒溶液溶解于100mL去离子水中，后与新鲜配置的PEI 溶液(1mg/mL)超声反应40分钟。6000rpm/6min离心，并用去离子水洗2 遍后重悬于5mL去离子水中待用。
(2)制备SiO2@Au-seed纳米颗粒：
将制备的SiO2@PEI溶液(5mL)加入到200mL 3nm胶体金溶液中， 剧烈超声30分钟，表面带强正电的SiO2@PEI大量吸附带负电荷的胶体金， 形成SiO2@Au-seed纳米颗粒。5000rpm/6min离心，用去离子水洗一遍后 重悬于10mL乙醇中待用。
(3)制备SiO2@Au-seed/DTNB纳米颗粒：
将制备的SiO2@Au-seed溶液(10mL)与10μM新鲜配置的DTNB溶 液超声反应60分钟。5000rpm/6min离心，重悬于10mL乙醇中待用。
(4)制备SiO2@Ag纳米颗粒：
将制备的SiO2@Au-seed/DTNB溶液(1mL)加入到30mL含1.5wt.％ PVP和0.35mMAgNO3的去离子水中，随后加入35μL 37％的甲醛溶液和 70μL 28％的氨水溶液剧烈超声5分钟后，3000rpm/6min离心，用去离子水 洗二遍后重悬于10mL乙醇中待用。
(5)制备双层DTNB修饰的SiO2@Ag纳米颗粒：
将制备的SiO2@Ag溶液(10mL)与10μM新鲜配置的DTNB溶液超 声反应60分钟。3000rpm/6min离心，重悬于10mL乙醇中待用。
图2为本实施例步骤(3)制得的SiO2@Au-seed/DTNB纳米颗粒，步 骤(5)制得的SiO2@Ag/DTNB纳米颗粒的高清透射电子显微镜图 (HRTEM)、各组分放大倍数后高分辨率的透射电镜(HRTEM)和 SiO2@Ag/DTNB纳米颗粒元素面扫描图。由上述结果可见，双层拉曼分子 标记的硅核银壳复合纳米标签粒径均一，层次分明，银离子还原形成的外 壳包裹在SiO2颗粒表面，使得产物同时具有优异SERS性能。
本实施例所制得的双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签的表征 结果如图3所示。其中A图为SiO2、SiO2@PEI、SiO2@Au-seed/DTNB和 SiO2@Ag/DTNB纳米颗粒的UV可见光光谱结果，B图为上述各组分的zeta 电位变化图。本发明提出的双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签采 用PEI介导的自组装法制备，原理是利用PEI的强正电吸附作用。由图3 的B图可知，各组分的zeta电位的变化可以监控自组装反应与吸附反应的 进行。C图为SiO2@Au-seed/DTNB、SiO2@Ag/DTNB及双层DTNB修饰的 SiO2@Ag纳米颗粒的SERS信号强度对比图，由图可知我们提出的双层 DTNB修饰SiO2@Ag纳米标签的SERS增强活性远远高于单层DTNB。
实施例2
本发明提出的双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签的表面为羧 基化银壳，表面具有大量游离羧基可以用于新型冠状病毒重组抗原S蛋白 的偶联，可以非常简便的实现纳米材料的表面功能化。本发明的双层拉曼 分子标记的硅核银壳复合纳米标签表面S蛋白修饰的步骤如图4所示，包 括以下步骤：
取500μL双层DTNB修饰的SiO2@Ag溶液，加入含50μL碳二亚胺溶 液(0.01M)和10μLN-羟基琥珀酰亚胺溶液(0.1M)的500μL MES缓冲 液(100mM，pH5.5)超声反应15分钟活化SiO2@Ag-DTNB表面的羧基。随 后与30μg/mL的新型冠状病毒重组抗原S蛋白室温震荡孵育反应2h，未反 应的羧基基团用80μL BSA(10％)继续封闭反应1h。得到的SiO2@Ag SERS 探针用10mM PBST缓冲液(含0.05％Tween 20,pH7.4)洗二遍后，重悬至 500μL含0.05％Tween20,5％BSA,0.02％NaN3的10mM PBS缓冲液中， 加入100μL金标稀释液，混匀后铺在硝酸纤维素膜上制作结合垫，与吸水 垫、样品垫，硝酸纤维素膜和底板组装成试纸条待用。
实施例3
本发明提出的双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签作为高性能 SERS标签用于免疫层析系统的检测。本实施例采用新型冠状病毒重组抗原 S蛋白修饰的双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签与免疫层析系统 相结合，同时检测人阳性血清中不同浓度的IgM和IgG。图5为本实施例所示 的双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签作为SERS标签与免疫层析系 统联用快速检测人血清中IgM和IgG的实验流程图。图6为本实施例所示的双 层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签作为高性能SERS标签与免疫层析 系统结合检测血清中人IgM和IgG的前期实验优化图。图7为检测人新冠阳性 血清中不同稀释倍数的IgM和IgG的检测结果(785nm激发波长)。其中图7 中A图为基于双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签的免疫层析试纸 条对血清不同稀释倍数的IgM和IgG的试纸条检测结果。从图中可见，试纸 条检测线(T线)上的显色条带随着新冠阳性血清稀释倍数的增加而逐渐减 弱，肉眼观察灵敏度低于稀释1.6×104倍。图7中B为检测人新冠阳性血清中 不同稀释倍数的IgM和IgG的胶体金比色结果，肉眼观察灵敏度与图6中A一 致。但根据图7中C图拉曼光谱仪读值的结果可得，基于双层拉曼分子标记 的硅核银壳复合纳米标签的免疫层析最低检测限可达稀释1.28×107倍，比胶 体金免疫层析可视化的最低检测线低800倍。图7中D图则是基于双层拉曼分 子标记的硅核银壳复合纳米标签的拉曼信号的校准曲线。误差线为测量20 次所得，检测结果的相关系数分别为：抗新冠IgM为R2＝0.959，抗新冠IgG为R2＝0.990。图8为本发明实施例3基于双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳 米标签的免疫层析系统检测临床血清结果(13例阳性，13例阴性)。结果 显示该基于双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签的免疫层析系统具 有很好的特异性，只针对新型冠状病毒的IgM和IgG抗体有效。
以上所述只为说明本发明的技术构思和特点，其目的在于让熟悉此项 技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，所作的任何修改、等同替 换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签，其特征在于，由内到外依次包括：SiO2内核、PEI层、胶体金层、第一DTNB层、纳米Ag层和第二DTNB层；
所述第二DTNB层的表面耦联新型冠状病毒重组抗原S蛋白。
2.一种双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在SiO2表面沉积PEI形成表面带正电荷的SiO2@PEI颗粒，将SiO2@PEI颗粒加入到胶体金溶液中制备SiO2@Au-seed复合物；
(2)将步骤(1)所得的SiO2@Au-seed复合物在超声条件下与DTNB溶液反应，形成SiO2@Au-seed/DTNB纳米颗粒；
(3)将步骤(2)所得的SiO2@Au-seed/DTNB纳米颗粒以PVP作为保护剂，AgNO3为原料，氨水为催化剂，甲醛为还原剂，将银离子快速还原沉积，形成纳米银外壳的SiO2@Ag纳米颗粒；
(4)将步骤(3)所得的SiO2@Ag纳米颗粒在超声条件下再次与DTNB溶液反应，形成SiO2@Ag/DTNB纳米颗粒；
(5)将步骤(4)所得的SiO2@Ag/DTNB纳米颗粒在碳二亚胺溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液的作用下，末端羧基被活化直接耦联新型冠状病毒重组抗原S蛋白形成双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签。
3.根据权利要求2所述的双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签的制备方法，其特征在于，步骤(1)包括：
将SiO2水溶液加入到PEI溶液中，通过超声反应使PEI在SiO2纳米颗粒表面自组装形成表面带正电荷的SiO2@PEI颗粒；
将合成的SiO2@PEI颗粒加入到带负电的3nm胶体金中，通过超声反应使所述SiO2@PEI颗粒表面吸附一层胶体金颗粒，获得SiO2@Au-seed复合物；
优选地，所述PEI溶液的浓度为0.5mg/mL～5mg/mL，优选为1mg/mL；所述超声的时长为20～60min，优选为40min。
4.根据权利要求2所述的双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签的制备方法，其特征在于，所述DTNB溶液的浓度为10mM；所述超声的时长为20～60min，优选为30min。
5.根据权利要求2所述的双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述AgNO3的浓度为0.1～0.5mM，优选为0.35mM；甲醛与氨水的比例为2:1～3:1，优选为2:1。
6.根据权利要求2-5任一项所述的双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述DTNB的羧基基团与所述新型冠状病毒重组抗原S蛋白的氨基端耦联形成肽链。
7.根据权利要求1所述的双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签在免疫层析中的应用，其特征在于，所述应用包括：
将所述双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签重悬于缓冲液中，加入金标稀释液混匀后铺在硝酸纤维素膜上制作结合垫；
在同一硝酸纤维素膜上包被两条检测线，分别为抗人IgM和抗人IgG；一条质控线，为S蛋白抗体；
将所述结合垫、所述硝酸纤维素膜与吸水垫、样品垫，底板组装成试纸条；
将待测样品分别滴加到免疫层析试纸条的样品垫上，静置15-20分钟后，同时读取两条检测线上的拉曼信号，达到对阳性血清中IgM、IgG两种抗体同时定量检测。
8.根据权利要求7所述的双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签在免疫层析中的应用，其特征在于，所述缓冲液为含Tween 20、BSA、NaN3的10mM PBS缓冲液，Tween 20的含量为0～1％，优选为0.05％；BSA的浓度为0～10％，优选为5％；NaN3的浓度为0～0.1％，优选0.02％；加入的金标稀释液的体积为500～200μL，优选为100μL。
9.根据权利要求7所述的双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签在免疫层析中的应用，其特征在于，所述抗人IgM的浓度为0.2～1.0mg/mL，优选为0.5mg/mL；抗人IgG的浓度为0.2～1.0mg/mL，优选为0.5mg/mL；新型冠状病毒S蛋白抗体的浓度为0.2～1.0mg/mL，优选为0.5mg/mL。
10.根据权利要求7所述的双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签在免疫层析中的应用，其特征在于，所述硝酸纤维素膜型号为CN140，质控线下存在两条检测线。
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