CN113092441A - 一种基于表面增强拉曼散射的超灵敏生物芯片及其制备方法 - Google Patents

一种基于表面增强拉曼散射的超灵敏生物芯片及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种基于表面增强拉曼散射的SARS‑CoV‑2超灵敏生物芯片及其制备方法，属于功能材料与生物传感检测技术领域。是以硅片为衬底组装金纳米颗粒，修饰新型冠状病毒刺突蛋白抗体(SARS‑CoV‑2spike antibody)和牛血清白蛋白得到SERS免疫基底；通过在Ag NPs表面依次修饰拉曼分子对巯基苯甲酸和SARS‑CoV‑2spike antibody，制备SERS免疫探针；然后将SERS免疫基底吸附不同浓度的新型冠状病毒刺突蛋白抗原(SARS‑CoV‑2spike antigen protein)和SERS免疫探针，得到具有三明治免疫夹心结构的基于表面增强拉曼散射的SARS‑CoV‑2超灵敏生物芯片。本发明解决了当前普遍采用静电吸附法制备的增强基底灵敏度低和均匀性差的问题，达到了进一步提高SERS检测灵敏度的目的。

Description

一种基于表面增强拉曼散射的超灵敏生物芯片及其制备方法
技术领域
本发明属于功能材料与生物传感检测技术领域，具体涉及一种基于表面增强拉曼散射(SERS)的SARS-CoV-2超灵敏生物芯片及其制备方法。
背景技术
由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的COVID-19疫情迅速蔓延，在世界各地造成了令人担忧的形势。目前已经证实该病毒可通过呼吸道飞沫、气溶胶和与非生物表面的接触传播，无症状感染和传播已成为重大公共卫生问题。因此，迫切需要开发敏感、快速和低成本的诊断工具来对受感染的个人进行早期筛查，以便能够促进适当的隔离和治疗。
在临床中，COVID-19的诊断方法主要有三种：(1)胸部CT扫描；(2)基于逆转录酶-聚合酶链反应(RT-qPCR)的核糖核酸(RNA)检测；(3)血清抗体免疫测定。但是胸部CT扫描和抗体检测均不适用于早期和无症状病例的筛查，RT-qPCR方法对实验室环境、检测人员和仪器都有较高的要求。因此，无需标本制备步骤，直接检测病毒抗原的高灵敏度免疫诊断方法是快速、准确诊断COVID-19的必要手段。SARS-CoV-2病毒及其结构蛋白包括刺突(S)糖蛋白、小包膜(E)蛋白、基质(M)蛋白、核衣壳(N)蛋白以及几种附属蛋白。其中，S蛋白对粘附宿主细胞至关重要，是诊断COVID-19最有价值的抗原生物标志物之一。在现有的众多分析工具中，表面增强拉曼散射(surface enhanced Raman scattering,SERS)具有灵敏度高及水干扰小等优点，其独特的指纹特性在生物样品鉴定中具有明显的优势。基于SERS的生物传感器不需要大量的样品制备步骤，为SARS-CoV-2检测提供了一种有效的方法。
目前，大多数方法都采用传统静电吸附制备的SERS免疫基底检测病毒或肿瘤标志物，但是传统的静电吸附法操作时间长，均匀性差，导致检测误差较大。因此，对于检测灵敏度低、重复性差等问题的解决，将会有效推动SERS技术在生物领域的应用。
发明内容
本发明的目的在于解决利用金属纳米颗粒修饰的SERS免疫基底检测灵敏度低、重复性差等问题，提供一种基于表面增强拉曼散射(SERS)的SARS-CoV-2超灵敏生物芯片及其制备方法。
一种基于表面增强拉曼散射(SERS)的SARS-CoV-2超灵敏生物芯片，其特征在于：以硅片为衬底组装金纳米颗粒，修饰新型冠状病毒刺突蛋白抗体(SARS-CoV-2spikeantibody)和牛血清白蛋白(BSA)得到SERS免疫基底；通过在Ag NPs表面依次修饰拉曼分子对巯基苯甲酸(4MBA)和SARS-CoV-2spike antibody，制备SERS免疫探针；然后将SERS免疫基底吸附不同浓度的新型冠状病毒刺突蛋白抗原(SARS-CoV-2spike antigen protein)和SERS免疫探针(Ag@4MBA@SARS-CoV-2spike antibody)，所述免疫基底具有两层致密的金纳米颗粒，所述超灵敏生物芯片具有三明治免疫夹心结构。
本发明所述的金纳米颗粒，标记为Au NPs。
本发明所述的银纳米颗粒，标记为Ag NPs。
本发明所述SESR免疫探针修饰的拉曼分子为对巯基苯甲酸(4MBA)。
本发明所述新型冠状病毒刺突蛋白抗体为SARS-CoV-2spike antibody。
本发明所述新型冠状病毒刺突蛋白抗原为SARS-CoV-2spike protein。
金和银纳米颗粒是我们按已知方法合成的，SARS-CoV-2spike antibody、SARS-CoV-2spike protein、4MBA、BSA购买得到。
如果没有特别说明，本发明所述的溶液均是水溶液，PBS为磷酸缓冲盐溶液。
一种基于表面增强拉曼散射(SERS)的SARS-CoV-2超灵敏生物芯片的制备方法，利用抗体和抗原的特异性吸附功能，其步骤如下：
(1)利用三相液液界面自组装方法在硅片上组装Au NPs，然后修饰SARS-CoV-2spike antibody作为SERS免疫基底：具体为将1mL Au NPs溶液用去离子水稀释8～15倍，进行第一次离心，然后将沉淀分散到1mL聚乙烯吡咯烷酮溶液(PVP)中，进行第二次离心，再将沉淀分散于1mL乙醇中；随后，在90～150μL Au NPs的乙醇溶液中加入1～1.2mL二氯甲烷和1.8～2mL去离子水，将得到的混合溶液剧烈摇晃30～60s；再缓慢加入400～450μL正己烷，此时在液体表面形成了致密的Au NPs单层膜，用亲水处理后的硅片将Au NPs单层膜捞起；重复上述制备致密的Au NPs单层膜的操作1次，然后用上述硅片再次将致密的Au NPs单层膜捞起，从而在硅片上组装2层Au NPs单层膜，得到SERS活性基底；将SERS活性基底浸入20～25μM的巯基十一酸乙醇溶液(MUA)中1.5～3.0h，取出后用乙醇溶液冲洗2～4次；然后在SERS活性基底上滴加10～15μL、10～12μg/mL SARS-CoV-2spike antibody的PBS溶液，4℃孵育4～6小时，用PBS和去离子水依次冲洗2～4次；最后向上述基底表面滴加10～15μL、质量百分数3～5％的BSA的PBS溶液，4℃孵育1.5～3.0小时，用PBS和去离子水依次冲洗2～4次，得到SARS-CoV-2spike antibody修饰的SERS免疫基底；
(2)通过在Ag NPs表面依次修饰拉曼分子对巯基苯甲酸(4MBA)和SARS-CoV-2spike antibody，制备SERS免疫探针：具体是将200～300μL、0.1mM4MBA的乙醇溶液加入到1mL Ag NPs溶液中，27～32℃搅拌8～12h，8000～9000rpm离心10～20分钟后分散于1mLPBS中，得到4MBA修饰的Ag NPs溶液，记为Ag@4MBA溶液；再将30～50μL、10～12μg/mL SARS-CoV-2spike antibody的PBS溶液加入到1mL Ag@4MBA溶液中，4℃孵化4～6h，6000～7000rpm离心10～20分钟后分散于1mL PBS中；最后向上述溶液中加入50～80μL、质量百分数3％～5％的BSA的PBS溶液孵化1.5～3.0小时，6000～7000rpm离心10～20分钟后分散于1mL PBS中，得到SERS免疫探针溶液，记为Ag@4MBA@SARS-CoV-2spike antibody溶液；
(3)向步骤(1)得到的SERS免疫基底表面滴加10～15μL浓度为1fg/mL～1ng/mL的SARS-CoV-2spike antigen protein的PBS溶液，37℃孵育2～3小时后用PBS和去离子水依次冲洗2～4次；然后滴加15～20μL步骤(2)制备的SERS免疫探针溶液，4℃孵育2～3小时，然后用PBS和去离子水依次冲洗2～4次，得到具有三明治免疫夹心结构的基于表面增强拉曼散射(SERS)的SARS-CoV-2超灵敏生物芯片，第一层为SERS免疫探针，中间层为SARS-CoV-2spike antigen protein，最后一层为SARS-CoV-2spike antibody修饰的SERS免疫基底。
本发明的原理：本发明以提高SERS免疫检测的灵敏度和可重复性为切入点，结合抗体抗原的特异性识别功能，创造性的提出利用三相液液界面自组装方法制备SERS免疫基底，解决当前普遍采用静电吸附法制备的增强基底灵敏度低和均匀性差的问题，制备出一种具有双层金纳米颗粒修饰的SARS-CoV-2超灵敏生物芯片。
本发明的有益效果：本发明所述的一种基于表面增强拉曼散射(SERS)的SARS-CoV-2超灵敏生物芯片具有以下优点：
(1)组装在硅片上的金纳米颗粒致密排列，分布均匀，能够有效的提高检测均匀性，在同一SERS免疫基底随机检测15次的相对标准偏差(Relative Standard Deviation)可控制在4.6％左右；
(2)组装在硅片上的金纳米颗粒之间具有规则的热点，可显著增强SERS免疫检测的灵敏度，最佳组装层数为2层。
(3)组装在硅片上的两层金纳米颗粒可与SERS免疫探针中的银纳米颗粒之间产生显著的局域表面等离子体共振(LSPR)效应，进而实现双场增强进一步提高SERS响应。
(4)构建的三明治免疫检测芯片具有优异的特异性，对其他干扰抗原的响应可忽略不计；
(5)所得的金纳米颗粒粒度可达到纳米级，平均尺寸可达到47m左右，粒径小且分布均匀；
(6)所得的SERS免疫基底在硅片上更便于操作并且对检测结果不会产生背景干扰；
(7)SERS免疫检测可重复性高，重复两次实验所得的结果，检测限变化率不超过5％。
本发明所述的基于表面增强拉曼散射基底(SERS)的SARS-CoV-2超灵敏生物芯片的制备方法，利用三相液液界面自组装技术，可使组装在硅片上的金纳米颗粒致密排列，分布均匀，有效地提高了检测均匀性。更重要的是组装在硅片上金纳米颗粒的最佳层数为2层，金纳米颗粒之间具有规则的热点，同时金纳米颗粒与SERS免疫探针中的银纳米颗粒之间也可以产生显著的局域表面等离子体共振(LSPR)效应，进而实现双场增强，以达到进一步提高SERS检测灵敏度的目的。
附图说明
图1为本发明所述的一种基于表面增强拉曼散射基底(SERS)的SARS-CoV-2超灵敏生物芯片的结构示意图。
图2为本发明实施例1所得的SERS活性基底的扫描电镜图，金纳米颗粒组装2层，金纳米颗粒的平均粒径为47nm。
图3为本发明实施例2所得的SERS免疫探针的透射电镜图，银纳米颗粒的平均粒径为45nm。
图4为本发明实施例3所得的基于SERS的SARS-CoV-2超灵敏生物芯片的扫描电镜图。图4中底部为球形的纳米颗粒是Au NPs，吸附在上面的尺寸偏小的纳米颗粒为Ag NPs。说明除了SERS免疫基底，还有SERS免疫探针，即根据抗体抗原的特异性识别功能，成功的构建了三明治免疫夹心结构。
图5为本发明实施例3所得的基于SERS的SARS-CoV-2超灵敏生物芯片在PBS中检测SARS-CoV-2spike antigen protein的SERS光谱图，在PBS中检测限可低至1fg/mL。
图6为本发明实施例3所得的基于SERS的SARS-CoV-2超灵敏生物芯片在未经过预处理的唾液中检测SARS-CoV-2spike antigen protein的SERS光谱图，在没有任何预处理的唾液中检测限为10fg/mL。
具体实施方式
本发明所述的一种基于表面增强拉曼散射(SERS)的SARS-CoV-2超灵敏生物芯片具体方案如下：以硅片为衬底组装金纳米颗粒，修饰抗体和BSA得到SERS免疫基底，然后吸附不同浓度的抗原和SERS免疫探针，所述免疫基底具有两层致密的金纳米颗粒，所述超灵敏生物芯片具有三明治免疫夹心结构。
实施例1：SERS免疫基底的制备
(1)Au NPs溶液的制备：
将0.985mg氯金酸(HAuCl4)与0.365g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)混合后用去离子水定容至10mL，然后在300rpm下快速加入0.6mL、10×10-3M硼氢化钠溶液(NaBH4)，搅拌2分钟，在27℃下放置3h以确保反应完全，得到CTAB包覆的金纳米团簇溶液。将2mL、200×10- 3M十六烷基三甲基氯化铵溶液(CTAC)与1.5mL、100×10-3M抗坏血酸溶液(AA)、50μL CTAB包覆的金纳米团簇溶液混合，待反应物完全溶解后再加入2mL、0.5×10-3M HAuCl4溶液，在27℃下反应15分钟，然后14500rpm离心30分钟重新悬浮于1mL、20×10-3MCTAC溶液中，得到粒径为10nm的金纳米颗粒种子溶液。将2mL、100×10-3MCTAC溶液与130μL、10×10-3M AA溶液和10μL、10nm金纳米颗粒种子溶液混合，然后加入2mL、0.5×10-3M HAuCl4溶液，在27℃下反应10min，14500rpm离心10min，得到Au NPs溶液；
(2)在硅片上组装2层Au NPs：
将1mL步骤(1)得到的Au NPs溶液用去离子水稀释10倍，进行第一次离心，然后将沉淀分散到1mL聚乙烯吡咯烷酮溶液(PVP)中，进行第二次离心，将沉淀再分散于1mL乙醇中，4℃保存。随后，在100μL上述Au NPs乙醇溶液中加入1mL二氯甲烷和1.8mL去离子水，将混合物溶液剧烈摇晃30s。然后再缓慢加入400μL正己烷，此时在液体表面形成了致密的AuNPs单层膜，用亲水处理后的硅片将Au NPs单层膜捞起。重复上述制备致密的Au NPs单层膜的操作1次，然后用上述硅片再次将致密的Au NPs单层膜捞起，从而在硅片上组装2层AuNPs单层膜，得到SERS活性基底；
(3)SERS免疫基底的制备：
将SERS活性基底浸入20μM的巯基十一酸乙醇溶液(MUA)中2h，取出后用乙醇溶液冲洗3次。然后在SERS活性基底上滴加15μL、10μg/mL的SARS-CoV-2spike antibody的PBS溶液，4℃孵育6h，然后用磷酸缓冲盐溶液(PBS)和去离子水依次冲洗3次。最后向上述基底上滴加15μL、质量百分数5％的BSA的PBS溶液，4℃孵化2小时，用PBS和去离子水冲洗3次，得到SARS-CoV-2spike antibody修饰的SERS免疫基底。
实施例2：SERS免疫探针溶液的制备
(1)Ag NPs溶液的制备：
将0.02536g抗坏血酸和0.21175g柠檬酸三钠溶解于240mL去离子水中，然后加入2.4mL、0.1M的硝酸银溶液(AgNO3)，30℃下搅拌15分钟，100℃下熟化2小时，得到Ag NPs溶液。
(2)Ag@4MBA溶液的制备：
将200μL、0.1mM的对巯基苯甲酸(4MBA)的乙醇溶液加入到1mL步骤(1)得到的AgNPs溶液中，30℃搅拌12h，8500rpm离心15分钟并分散于1mL PBS中，得到4MBA修饰的Ag NPs溶液(Ag@4MBA)；
(3)SERS免疫探针溶液的制备：
将30μL、10μg/mL SARS-CoV-2spike antibody的PBS溶液加入1mL步骤(2)中的Ag@4MBA溶液中，4℃孵化6h，然后6500rpm离心15分钟后分散于1mL PBS中。最后向上述溶液中加入50μL、质量百分数5％的BSA的PBS溶液孵化2小时，6500rpm离心15分钟后分散于1mLPBS中，得到SERS免疫探针溶液(Ag@4MBA@SARS-CoV-2spike antibody)。
实施例3：SARS-CoV-2超灵敏生物芯片的制备和检测
(1)目标抗原的孵育：
向实施例1所得的SERS免疫基底表面滴加10μL浓度分别为1fg/mL、10fg/mL、100fg/mL、1pg/mL、10pg/mL、100pg/mL和1ng/mL的SARS-CoV-2spike antigen protein的PBS溶液以及对照组的BSA的PBS溶液，37℃孵育2.5h，然后用PBS和大量去离子水冲洗3次。
(2)SARS-CoV-2超灵敏生物芯片的制备
向步骤(1)得到的基底上滴加15μL实施例2得到的SERS免疫探针溶液，4℃孵育2.5h，然后用PBS和去离子水冲洗3次，从而得到SARS-CoV-2超灵敏生物芯片。
(3)SARS-CoV-2超灵敏生物芯片的检测
将步骤(2)得到的SARS-CoV-2超灵敏生物芯片置于显微拉曼光谱仪置物架上，采用785nm激光对其进行检测。图5、图6的光谱中可以观察到两个很强的4MBA的特征峰，分别位于1077cm-1和1586cm-1处。由于SARS-CoV-2spike antibody修饰的SERS免疫基底可以特异性吸附待检测的抗原SARS-CoV-2spike protein，抗原会再次吸附SARS-CoV-2spikeantibody修饰的SERS免疫探针，构成三明治免疫夹心结构。SERS免疫探针修饰着拉曼分子4MBA，4MBA具备拉曼活性，是一种常用的探针分子。所以SERS免疫基底吸附的抗原越多，再次吸附的SERS免疫探针也相应增多，SERS信号越强。总的来说，待检测的抗原浓度越高，4MBA信号越强。在PBS中检测限可低至1fg/mL，在没有任何预处理的唾液中检测限为10fg/mL，低于纳米酶化学发光纸法检测SARS-CoV-2抗原的检测限0.1ng/mL。

Claims (4)

1.一种基于表面增强拉曼散射的SARS-CoV-2超灵敏生物芯片的制备方法，其步骤如下：
(1)将1mL Au NPs溶液用去离子水稀释8～15倍，进行第一次离心，然后将沉淀分散到1mL聚乙烯吡咯烷酮溶液中，进行第二次离心，再将沉淀分散于1mL乙醇中；随后，在90～150μL Au NPs的乙醇溶液中加入1～1.2mL二氯甲烷和1.8～2mL去离子水，将得到的混合溶液剧烈摇晃30～60s；再缓慢加入400～450μL正己烷，此时在液体表面形成了致密的Au NPs单层膜，用亲水处理后的硅片将Au NPs单层膜捞起；重复上述制备致密的Au NPs单层膜的操作1次，然后用上述硅片再次将致密的Au NPs单层膜捞起，从而在硅片上组装2层Au NPs单层膜，从而得到SERS活性基底；将SERS活性基底浸入20～25μM的巯基十一酸乙醇溶液中1.5～3.0h，取出后用乙醇溶液冲洗2～4次；然后在SERS活性基底上滴加10～15μL、10～12μg/mL SARS-CoV-2spike antibody的PBS溶液，4℃孵育4～6小时，用PBS和去离子水依次冲洗2～4次；最后向上述基底表面滴加10～15μL、质量百分数3～5％的BSA的PBS溶液，4℃孵育1.5～3.0小时，用PBS和去离子水依次冲洗2～4次，得到SARS-CoV-2spike antibody修饰的SERS免疫基底；
(2)将200～300μL、0.1mM 4MBA的乙醇溶液加入到1mL Ag NPs溶液中，27～32℃搅拌8～12h，8000～9000rpm离心10～20分钟后分散于1mL PBS中，得到4MBA修饰的Ag NPs溶液，记为Ag@4MBA溶液；再将30～50μL、10～12μg/mL SARS-CoV-2spike antibody的PBS溶液加入到1mL Ag@4MBA溶液中，4℃孵化4～6h，6000～7000rpm离心10～20分钟后分散于1mL PBS中；最后向上述溶液中加入50～80μL、质量百分数3％～5％的BSA的PBS溶液孵化1.5～3.0小时，6000～7000rpm离心10～20分钟后分散于1mL PBS中，得到SERS免疫探针溶液；
(3)向步骤(1)得到的SERS免疫基底表面滴加10～15μL浓度为1fg/mL～1ng/mL的SARS-CoV-2spike antigen protein的PBS溶液，37℃孵育2～3小时后用PBS和去离子水依次冲洗2～4次；然后滴加15～20μL步骤(2)制备的SERS免疫探针溶液，4℃孵育2～3小时，然后用PBS和去离子水依次冲洗2～4次，得到具有三明治免疫夹心结构的基于表面增强拉曼散射的SARS-CoV-2超灵敏生物芯片，第一层为SERS免疫探针，中间层为SARS-CoV-2spikeantigen protein，最后一层为SARS-CoV-2spike antibody修饰的SERS免疫基底。
2.如权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼散射的SARS-CoV-2超灵敏生物芯片的制备方法，其特征在于：是将0.985mg氯金酸与0.365g十六烷基三甲基溴化铵混合后用去离子水定容至10mL，然后在300rpm下快速加入0.6mL、10×10-3M硼氢化钠溶液，搅拌2分钟，在27℃下放置3h以确保反应完全，得到十六烷基三甲基溴化铵包覆的金纳米团簇溶液；将2mL、200×10-3M十六烷基三甲基氯化铵溶液与1.5mL、100×10-3M抗坏血酸溶液、50μL十六烷基三甲基溴化铵包覆的金纳米团簇溶液混合，待反应物完全溶解后再加入2mL、0.5×10-3MHAuCl4溶液，在27℃下反应15分钟，然后14500rpm离心30分钟重新悬浮于1mL、20×10-3M十六烷基三甲基氯化铵溶液中，得到粒径为10nm的金纳米颗粒种子溶液；将2mL、100×10-3M十六烷基三甲基氯化铵溶液与130μL、10×10-3M抗坏血酸溶液溶液和10μL、10nm金纳米颗粒种子溶液混合，然后加入2mL、0.5×10-3MHAuCl4溶液，在27℃下反应10min，14500rpm离心10min，得到Au NPs溶液。
3.如权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼散射的SARS-CoV-2超灵敏生物芯片的制备方法，其特征在于：是将0.02536g抗坏血酸和0.21175g柠檬酸三钠溶解于240mL去离子水中，然后加入2.4mL、0.1M的硝酸银溶液，30℃下搅拌15分钟，100℃下熟化2小时，得到AgNPs溶液。
4.一种基于表面增强拉曼散射的SARS-CoV-2超灵敏生物芯片，其特征在于：是由权利要求1～3任何一项所述的方法制备得到。
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