CN110618123B - 一种高效表面增强拉曼散射基底材料及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于表面增强拉曼技术的基底材料及其制备方法。其中，表面增强拉曼技术的基底材料包括：纳米内核，纳米内核是由金纳米棒构成；纳米外壳，纳米外壳是由纳米银材料构成，纳米外壳均匀完全的包裹于纳米内核表面，纳米外壳外表面结合有维生素K4。该基底材料用作表面增强拉曼检测的探针可以显著的增强检测的灵敏度，实现尿液中KIM‑1含量的高敏感度检测，从而达到大动态范围的KIM‑1含量测定。

Description

一种高效表面增强拉曼散射基底材料及制备方法
技术领域
本发明涉及拉曼散射技术领域，特别涉及一种高效表面增强拉曼散射基底材料及制备方法。
背景技术
目前，以肾脏损伤为特征的急慢性肾脏疾病是世界范围内具有挑战性的健康问题之一，判断肾脏损伤一般采用化验尿常规、渗透压、血肌酐、尿素氮、内生肌酐清除率等几项指标，但是这些指标增高的时候，很多肾脏损伤已经非常严重或者已经产生了不可逆的损害，因此，很多学者指出可以把尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG酶)活性作为损伤的早期指标，但该指标一般在肾病发作8-16小时才显现，目前，经研究证明，尿液中肾损伤分子1(KIM-1)含量对早期诊断急性肾损伤具有显著特异性，KIM-1含量在肾损伤4-6小时就可以出现改变，能迅速、灵敏、特异地反映各种肾脏疾病的损伤及恢复过程，可成为一种检测早期肾损伤的可靠生物学标记物，因此，对于尿液中KIM-1含量高精度的检测对于以肾脏损伤为特征的急慢性肾脏疾病的诊断和治疗有很大意义。
目前，尿液中KIM-1含量的测定方法主要是ELISA方法，灵敏度为pg/ml，因此，该方法无法实现大动态范围内定量检测尿液中的KIM-1含量。
表面增强拉曼散射(SERS)技术由于其高灵敏度，窄线宽和指纹效应，已成为一种有吸引力且功能强大的分析技术，可实现多重生物传感。表面增强拉曼散射具有可达14到15个数量级的卓越的拉曼增强效率，使其能够可靠、准确地检测超痕量甚至单分子水平的分析物。此外，SERS检测可以在几分钟内快速完成。因此,表面增强拉曼散射已经广泛应用于各种化学传感、生物分析、生物传感和早期癌症诊断等领域，但是，目前表面增强拉曼散射基底材料大都选用光滑的宏观玻璃、金、银或双金属膜作为基底材料，并不具有充足的等离子体“热点”，这导致表面增强拉曼技术的灵敏度有限。
为了提高SERS检测的灵敏度，目前选用在SERS检测的基底材料上键合曼拉检测分子，其中效果最佳的为P-ATP分子，灵敏度为ng/ml-pg/ml，虽然键合P-ATP分子后，SERS检测的灵敏度有所提升，但是很多被检测物所需要的检测灵敏度以及检测范围宽度要求更高
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效表面增强拉曼散射基底材料及制备方法，实现尿液中KIM-1含量的高敏感度检测，可达fg/ml级，从而达到大动态范围的KIM-1含量测定。
本发明的一个方面在于，提供一种高效表面增强拉曼散射基底材包括：
纳米内核，所述纳米内核是由金纳米棒构成；和
纳米外壳，所述纳米外壳是由纳米银材料构成，所述纳米外壳均匀完全的包裹于所述纳米内核表面，所述纳米外壳外表面键合有拉曼检测分子维生素K4。
进一步地，所述维生素K4经重氮化巯解引入巯基。
进一步地，所述纳米内核的直径为19-26nm，长度为80-96nm。
进一步地，所述纳米外壳的厚度为2-18nm。
本发明的另一个方面在于，提供一种高效表面增强拉曼散射基底材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)金纳米棒的制备；
1)用水对HAuCl4溶液进行稀释得到稀释液，向稀释液中的加入CTAB溶液得到溶液一；
2)将溶液一快速注入NaBH4溶液中，搅拌得到种子溶液，静置；
3)将CTAB和油酸钠溶解于水中，冷却后加入硝酸银溶液，保温后得到溶液二；
4)一边搅拌一边向溶液二中注射HAuCl4溶液，继续第一次搅拌，改变第二次搅拌速度，一边搅拌一边加入HCl溶液，继续第二次搅拌，最后加入抗坏血酸溶液，进行第三次搅拌，得到生长液；
5)将种子溶液注入生长液中得到混合溶液，将混合溶液静置，将静置后的混合溶液进行离心，收集沉淀物，将沉淀物分散于CTAC溶液中；
6)将步骤5)重复三次，将所述得沉淀物储存在CTAC溶液中，得到金纳米棒溶液；
(2)金核银壳纳米棒的制备；
将金纳米棒溶液用水稀释，向稀释液中加入硝酸银溶液，进行超声波处理后加入抗坏血酸溶液，经水浴保存、离心和分散得到金核银壳纳米棒悬浮液；
(3)拉曼检测分子的键合；
将维生素K4乙醇溶液经重氮化巯解引入巯基，再添加到金核银壳纳米棒悬浮液中得到混合物，温和摇动混合物，得到拉维生素K4标记的金核银壳纳米棒。
进一步地，步骤1)中所述水为去离子水；
所述HAuCl4溶液的浓度为25mM，所述稀释的倍数为50倍；
所述CTAB溶液的浓度为0.2M；
所述HAuCl4溶液与所述CTAB溶液的体积比为1:50；
步骤2)中所述NaBH4溶液的浓度为0.01M，温度为25-30℃，现用现配；
所述NaBH4溶液与所述HAuCl4溶液的体积比为1：6；
步骤2)中所述搅拌为磁力搅拌，所述磁力搅拌的速度为1200rpm，时间为2min，所述静置时间为30min，温度为25-30℃；
步骤3)中所述溶解温度为50℃，所述冷却温度为28-30℃；
步骤3)中所述水与步骤2)中所述NaBH4溶液的体积比为1250：3；
步骤3)中所述CTAB、油酸钠质量和硝酸银溶液体积与步骤1)中所述HAuCl4溶液的体积比为70g：12.34g：180ml：1ml；
所述硝酸银溶液得浓度为4.0M，所述保温的时间为1min；
步骤4)中所述HAuCl4溶液的浓度为1.0mM，所述HCl溶液的浓度为37wt％，所述抗坏血酸溶液得浓度为0.064M；
步骤4)中所述HAuCl4溶液、HCl溶液和所述抗坏血酸溶液与步骤3)中所述水的体积比为250:2.1:1.25:250；
步骤4)中所述第一次搅拌为磁力搅拌，速度为700rpm，持续时间为90min；
步骤4)中所述第二次搅拌为磁力搅拌，速度为400rpm，持续时间为15min；
步骤4)中所述第三次搅拌为磁力搅拌，速度为1200rpm，持续时间为30s；
步骤5)中所述种子溶液的加入量与步骤1)中所述HAuCl4溶液的体积比为4:1；
步骤5)中所述搅拌为磁力搅拌，速度为1500rpm，持续时间为30s；
步骤5)中所述静置的温度为28-30℃，时间为8-12h；
步骤5)中所述离心的转速为8000r/min，持续时间为10min
步骤5)中所述CTAC溶液的浓度为80mM，所述CTAC溶液与所述种子溶液的体积比为1:2；
步骤6)中所述CTAC溶液的浓度为80mM，所述CTAC溶液与所述种子溶液的体积比为1:2；
进一步地，步骤2中所述水为去离子水，所述稀释的倍数为8倍；
所述硝酸溶液的浓度为10mM，所述硝酸银溶液与所述金纳米棒溶液的体积比为(1:0.4)-(1:5)；
所述抗坏血酸溶液的体积与所述硝酸银溶液的体积比为1:1；
所述超声波处理的频率为100KHz，处理时间为2min；
所述水浴保存的温度为63-68℃，时间为4h；
所述离心的转速为8000r/min，时间为10min；
所述分散所用的溶液为去离子水，所述去离子水与所述金纳米棒溶液体积比为1:2.
进一步地，步骤3中所述维生素K4乙醇溶液与所述金核银壳纳米棒悬浊液的体积比为1:500；
所述温和摇动的时间为2h。
本发明还提供了高效表面增强拉曼散射基底材料在制备检测肾损伤因子的表面增强拉曼散射基底材料中的用途。
进一步地，所述肾损伤因子为糖蛋白类免疫物质。
本发明的有益之处在于：
本发明提供的一种高效表面增强拉曼散射基底材料不再使用现有技术中广泛引用的宏观材料，而是选择纳米级金属颗粒，纳米级金属颗粒局部电磁场可以显著增强，与传统上的金纳米颗粒相比较，金核银壳纳米颗粒可以进一步增强电磁信号，同时在金核银壳表面键合维生素K4，使得两个纳米金属颗粒交界处两个纳米金属颗粒之间的电磁耦合可以产生高达1014的SERS增强因子(EF)，这种信号的增强可以大大增强检测灵敏度。
本发明还提供的一种高效表面增强拉曼散射基底材料得制备方法，该制备方法通过控制银壳生长液中硝酸银和抗坏血酸的浓度，可以很好地调节银壳的厚度，根据需求制备不同厚度的银壳。
应当理解，前述大体的描述和后续详尽的描述均为示例性说明和解释，并不应当用作对本发明所要求保护内容的限制。
附图说明
参考随附的附图，本发明更多的目的、功能和优点将通过本发明实施方式的如下描述得以阐明，其中：
图1A为金纳米棒透射电镜图像；图1B-图1F为在0.2、0.5、1.0、2.0和2.5mL硝酸银溶液中制备的不同厚度银壳的金核银壳纳米棒透射电镜图像；
图2为金纳米棒和在0.2、0.5、1.0、2.0和2.5mL硝酸银溶液中制备的不同厚度银壳的金核银壳纳米棒UV-NIR消光光谱；
图3为在实施例1-5中金核银壳纳米棒和金纳米棒的单层列阵膜上吸收的维生素K4的拉曼光谱；
图4为在光谱为1080cm-1处拉曼强度随银壳厚度变化的图；
图5为基于金核银壳纳米棒单层阵列膜对人体尿液中低浓度KIM-1的高灵敏度识别能力；
图6为SERS强度在1145cm-1处具有生物标记物浓度，插图显示其宽动态检测范围。
具体实施方式
通过参考示范性实施例，本发明的目的和功能以及用于实现这些目的和功能的方法将得以阐明。然而，本发明并不受限于以下所公开的示范性实施例；可以通过不同形式来对其加以实现。说明书的实质仅仅是帮助相关领域技术人员综合理解本发明的具体细节。
在下文中，将参考附图描述本发明的实施例。在附图中，相同的附图标记代表相同或类似的部件，或者相同或类似的步骤。
实施例1
本实施例提供了一种基于表面增强拉曼技术的基底材料及其制备方法，该基底材料结构为：
金纳米棒内核，直径为23nm，长度为89.2nm；
银纳米外壳，厚度为4nm；
该金核银壳纳米棒由以下制备方法制得，该制备方法包括以下步骤：
1、金纳米棒的制备
1)在20mL的玻璃瓶中将0.1mL浓度为25mM HAuCl4溶液用去离子水稀释至5mL，向稀释液中加入5mL 0.2M的CTAB溶液，得到溶液一；
2)将0.6mL0.01M的NaBH4溶液快速注入溶液一中，NaBH4溶液现用现配，对混合溶液进行磁力搅拌，速度为1200rpm，搅拌2min，最后获得的种子溶液在30℃静置30min待用；
3)将7.0g CTAB和1.234g油酸钠溶解于水中250mL 50℃水中，自然冷却到30℃，然后加入18ml,4.0mM的硝酸银溶液，保温1min，得到溶液二；
4)一边磁力搅拌一边向溶液二中注射250ml 1.0mM的HAuCl4溶液，在700rpm速度下搅拌90min，改变第二次磁力搅拌速度为400rpm，一边搅拌一边加入2.1ml 37wt％的HCl溶液，搅拌15min，最后加入1.25ml 0.064M的抗坏血酸溶液，进行第三次搅拌，搅拌速度为1200rpm，搅拌30s，得到生长液；
5)将0.4mL种子溶液注入生长液中1500rpm速度下搅拌30s，最后，将混合液在30℃条件下静置10h，将静置后的混合液在8000r/min的速度速度下离心10min，收集沉淀物，将沉淀物分散于80mM的CTAC溶液中；
6)将步骤5)重复三次，将所述得沉淀物储存在CTAC溶液中，得到金纳米棒溶液；
2、金核银壳纳米棒的制备
将0.5mL金纳米棒溶液用水稀释至4ml，向稀释液中加入0.2ml 10mM的硝酸银溶液，在100KHz频率下超声波处理2min，后加入0.2ml 0.1M的抗坏血酸溶液，经65℃水浴保存4h、8000r/min离心10min，收集沉淀物分散到1ml去离子水中，得到金核银壳纳米棒悬浮液。
3、拉曼检测分子的键合
将2μL,5mM的维生素K4乙醇溶液经重氮化巯解引入巯基后添加到1.0ml金核银壳纳米棒悬浮液中得到混合物，温和摇动混合物2h，得到维生素K4标记的金核银壳纳米棒溶液。
实施例2
本实施例提供了一种基于表面增强拉曼技术的基底材料及其制备方法，该基底材料结构为：
金纳米棒内核，直径为21.7，长度为93.8；
银纳米外壳，厚度为6nm；
该金核银壳纳米棒由以下制备方法制得，该制备方法包括以下步骤：
1、金纳米棒的制备
1)在20mL的玻璃瓶中将0.1mL浓度为25mM HAuCl4溶液用去离子水稀释至5mL，向稀释液中加入5mL 0.2M的CTAB溶液，得到溶液一；
2)将0.6mL0.01M的NaBH4溶液快速注入溶液一中，NaBH4溶液现用现配，对混合溶液进行磁力搅拌，速度为1200rpm，搅拌2min，最后获得的种子溶液在30℃静置30min待用；
3)将7.0g CTAB和1.234g油酸钠溶解于水中250mL 50℃水中，自然冷却到30℃，然后加入18ml,4.0mM的硝酸银溶液，保温1min，得到溶液二；
4)一边磁力搅拌一边向溶液二中注射250ml 1.0mM的HAuCl4溶液，在700rpm速度下搅拌90min，改变第二次磁力搅拌速度为400rpm，一边搅拌一边加入2.1ml 37wt％的HCl溶液，搅拌15min，最后加入1.25ml 0.064M的抗坏血酸溶液，进行第三次搅拌，搅拌速度为1200rpm，搅拌30s，得到生长液；
5)将0.4mL种子溶液注入生长液中1500rpm速度下搅拌30s，最后，将混合液在30℃条件下静置10h，将静置后的混合液在8000r/min的速度速度下离心10min，收集沉淀物，将沉淀物分散于80mM的CTAC溶液中；
6)将步骤5)重复三次，将所述得沉淀物储存在CTAC溶液中，得到金纳米棒溶液。
2、金核银壳纳米棒的制备
将0.5mL金纳米棒溶液用水稀释至4mL，向稀释液中加入0.5ml 10mM的硝酸银溶液，在100KHz频率下超声波处理2min，后加入0.5 0.1M的抗坏血酸溶液，经65℃水浴保存4h、8000r/min离心10min，收集沉淀物分散到1ml去离子水中，得到金核银壳纳米棒悬浮液。
3、拉曼检测分子的键合
将2μL,5mM的维生素K4乙醇溶液经重氮化巯解引入巯基后添加到1.0ml金核银壳纳米棒悬浮液中得到混合物，温和摇动混合物2h，得到维生素K4标记的金核银壳纳米棒溶液。
实施例3
本实施例提供了一种基于表面增强拉曼技术的基底材料及其制备方法，该基底材料结构为：
金纳米棒内核，直径为24.3nm，长度为84.6nm；
银纳米外壳，厚度为8nm；
该金核银壳纳米棒由以下制备方法制得，该制备方法包括以下步骤：
1、金纳米棒的制备
1)在20mL的玻璃瓶中将0.1mL浓度为25mM HAuCl4溶液用去离子水稀释至5mL，向稀释液中加入5mL 0.2M的CTAB溶液，得到溶液一；
2)将0.6mL0.01M的NaBH4溶液快速注入溶液一中，NaBH4溶液现用现配，对混合溶液进行磁力搅拌，速度为1200rpm，搅拌2min，最后获得的种子溶液在30℃静置30min待用；
3)将7.0g CTAB和1.234g油酸钠溶解于水中250mL 50℃水中，自然冷却到30℃，然后加入18ml,4.0mM的硝酸银溶液，保温1min，得到溶液二；
4)一边磁力搅拌一边向溶液二中注射250ml 1.0mM的HAuCl4溶液，在700rpm速度下搅拌90min，改变第二次磁力搅拌速度为400rpm，一边搅拌一边加入2.1ml 37wt％的HCl溶液，搅拌15min，最后加入1.25ml 0.064M的抗坏血酸溶液，进行第三次搅拌，搅拌速度为1200rpm，搅拌30s，得到生长液；
5)将0.4mL种子溶液注入生长液中1500rpm速度下搅拌30s，最后，将混合液在30℃条件下静置10h，将静置后的混合液在8000r/min的速度速度下离心10min，收集沉淀物，将沉淀物分散于80mM的CTAC溶液中；
6)将步骤5)重复三次，将所述得沉淀物储存在CTAC溶液中，得到金纳米棒溶液。
2、金核银壳纳米棒的制备
将0.5mL金纳米棒溶液用水稀释至4ml，向稀释液中加入1.0ml 10mM的硝酸银溶液，在100KHz频率下超声波处理2min，后加入1.0ml 0.1M的抗坏血酸溶液，经65℃水浴保存4h、8000r/min离心10min，收集沉淀物分散到1ml去离子水中，得到金核银壳纳米棒悬浮液。
3、拉曼检测分子的键合
将2μL,5mM的维生素K4乙醇溶液经重氮化巯解引入巯基后添加到1.0ml金核银壳纳米棒悬浮液中得到混合物，温和摇动混合物2h，得到维生素K4标记的金核银壳纳米棒溶液。
实施例4
本实施例提供了一种基于表面增强拉曼技术的基底材料及其制备方法，该基底材料结构为：
金纳米棒内核，直径为22.8nm，长度为90.4nm；
银纳米外壳，厚度为10nm；
该金核银壳纳米棒由以下制备方法制得，该制备方法包括以下步骤：
1、金纳米棒的制备
1)在20mL的玻璃瓶中将0.1mL浓度为25mM HAuCl4溶液用去离子水稀释至5mL，向稀释液中加入5mL 0.2M的CTAB溶液，得到溶液一；
2)将0.6mL0.01M的NaBH4溶液快速注入溶液一中，NaBH4溶液现用现配，对混合溶液进行磁力搅拌，速度为1200rpm，搅拌2min，最后获得的种子溶液在30℃静置30min待用；
3)将7.0g CTAB和1.234g油酸钠溶解于水中250mL 50℃水中，自然冷却到30℃，然后加入18ml,4.0mM的硝酸银溶液，保温1min，得到溶液二；
4)一边磁力搅拌一边向溶液二中注射250ml 1.0mM的HAuCl4溶液，在700rpm速度下搅拌90min，改变第二次磁力搅拌速度为400rpm，一边搅拌一边加入2.1ml 37wt％的HCl溶液，搅拌15min，最后加入1.25ml 0.064M的抗坏血酸溶液，进行第三次搅拌，搅拌速度为1200rpm，搅拌30s，得到生长液；
5)将0.4mL种子溶液注入生长液中1500rpm速度下搅拌30s，最后，将混合液在28℃条件下静置10h，将静置后的混合液在8000r/min的速度速度下离心10min，收集沉淀物，将沉淀物分散于80mM的CTAC溶液中；
6)将步骤5)重复三次，将所述得沉淀物储存在CTAC溶液中，得到金纳米棒溶液。
2、金核银壳纳米棒的制备
将0.5mL金纳米棒溶液用水稀释至4ml，向稀释液中加入2.0ml 10mM的硝酸银溶液，在100KHz频率下超声波处理2min，后加入2.0ml 0.1M的抗坏血酸溶液，经65℃水浴保存4h、8000r/min离心10min，收集沉淀物分散到1ml去离子水中，得到金核银壳纳米棒悬浮液。
3、拉曼检测分子的键合
将2μL,5mM的维生素K4乙醇溶液经重氮化巯解引入巯基后添加到1.0ml金核银壳纳米棒悬浮液中得到混合物，温和摇动混合物2h，得到维生素K4标记的金核银壳纳米棒溶液。
实施例5
本实施例提供了一种基于表面增强拉曼技术的基底材料及其制备方法，该基底材料结构为：
金纳米棒内核，直径为24.0nm，长度为91.5nm；
银纳米外壳，厚度为16nm；
该金核银壳纳米棒由以下制备方法制得，该制备方法包括以下步骤：
1、金纳米棒的制备
1)在20mL的玻璃瓶中将0.1mL浓度为25mM HAuCl4溶液用去离子水稀释至5mL，向稀释液中加入5mL 0.2M的CTAB溶液，得到溶液一；
2)将0.6mL0.01M的NaBH4溶液快速注入溶液一中，NaBH4溶液现用现配，对混合溶液进行磁力搅拌，速度为1200rpm，搅拌2min，最后获得的种子溶液在30℃静置30min待用；
3)将7.0g CTAB和1.234g油酸钠溶解于水中250mL 50℃水中，自然冷却到30℃，然后加入18ml,4.0mM的硝酸银溶液，保温1min，得到溶液二；
4)一边磁力搅拌一边向溶液二中注射250ml 1.0mM的HAuCl4溶液，在700rpm速度下搅拌90min，改变第二次磁力搅拌速度为400rpm，一边搅拌一边加入2.1ml 37wt％的HCl溶液，搅拌15min，最后加入1.25ml 0.064M的抗坏血酸溶液，进行第三次搅拌，搅拌速度为1200rpm，搅拌30s，得到生长液；
5)将0.4mL种子溶液注入生长液中1500rpm速度下搅拌30s，最后，将混合液在25℃条件下静置10h，将静置后的混合液在8000r/min的速度速度下离心10min，收集沉淀物，将沉淀物分散于80mM的CTAC溶液中；
6)将步骤5)重复三次，将所述得沉淀物储存在CTAC溶液中，得到金纳米棒溶液。
2、金核银壳纳米棒的制备
将0.5mL金纳米棒溶液用水稀释至4ml，向稀释液中加入2.5ml 10mM的硝酸银溶液，在100KHz频率下超声波处理2min，后加入2.5ml 0.1M的抗坏血酸溶液，经65℃水浴保存4h、8000r/min离心10min，收集沉淀物分散到1ml去离子水中，得到金核银壳纳米棒悬浮液。
3、拉曼检测分子的键合
将2μL,5mM的维生素K4乙醇溶液经重氮化巯解引入巯基后添加到1.0ml金核银壳纳米棒悬浮液中得到混合物，温和摇动混合物2h，得到维生素K4标记的金核银壳纳米棒溶液。
实验例1
按照以下方法，分别制作实施例1-5中金核银壳纳米棒和金纳米棒的单层列阵膜：
将0.2mL已制备金悬浮液用蒸馏水稀释至2ml，在100KHz频率下超声处理10min后得到非聚集颗粒，然后，将非聚集颗粒放置在预处理过的硅片上，并在在一个密封的盒子里自组装成单层阵列薄膜，切成片，尺寸约为5mm×5mm。
实验例2
对实施例1-5中获得的金核银壳纳米棒进行以下测定：
(1)利用加速电压为200kv的场发射透射电镜(JEM-2100F,JEOL)获得透射电镜(TEM)图像，结果如图1所示；
(2)用岛津紫外-1800紫外-可见分光光度计测定了紫外-可见消光光谱，结果如图2所示；
(3)采用Renishaw inVia共焦拉曼光谱仪，以20倍物镜和785nm激光为激发源，在徕卡显微镜上进行拉曼光谱采集。光谱在800-1800cm-1范围内，曝光时间为10秒，结果如图3-4所示。
综合以上测定结果，可以得出，在金纳米棒直径为22nm，长度为90nm,银纳米壳厚度为16nm的情况下SERS强度最好，可达到金纳米作为基底材料的100倍。
实验例3
将本发明中的带维生素K4标记的金核银壳纳米棒替换传统SERS中的基底材料，用于人工尿液中标准KIM1生物标记物的分析。
首先，取6.0ml带维生素K4标记的金核银壳纳米棒溶液，在7000rpm下离心10分钟并且分散到6.0mL去离子水中。接下来，将12μL，25％wt戊二醛溶液添加到6.0ml维生素K4标记的金核银壳纳米棒溶液中，轻度摇动1.5h，产物在6000rpm下离心10min，将沉淀物分散到6ml，9μg/mL的KIM1检测抗体溶液中，得到顶层结构溶液，将该混合溶液在4℃条件下保存12h，然后用1.0mL 1×PBS缓冲液离心纯化，在4℃条件下保存待用。
然后，用150mM的半胱胺溶液对金核银壳纳米棒溶液进行氨基功能化处理，然后，加入12μL，25％wt戊二醛溶液，使金核银壳纳米棒溶液功能化，之后在功能化后的金核银壳纳米棒溶液中加入12mL，20μg/mL KIM1的捕获抗体溶液，于4℃温度下保存12h，接下来，向保存后的溶液加入12mL，1％BSA溶液，静置1h以阻断非特异性结合活性位点，得到衬底结构溶液。
取6份人工尿液溶液各200μL，分别在6份溶液中加入浓度为1ng/mL、10pg/mL、100fg/mL、1fg/mL、0.1fg/mL和0fg/mL的KIM1，混合均匀后得到待测尿液，待用。
将衬底溶液平均分为6份，分别在6份衬底溶液中加入6种待测尿液，在室温下温育1h，得到待测KIM1尿液。
最后，在每份待测KIM1尿液中加入200μL顶层结构溶液，经特异性结合后形成待测的检测抗体-待测抗原-捕获抗体“夹心”结构溶液，进行SERS检测，如图5所示，,拉曼强度随KIM1浓度的增加呈单调下降趋势，LOD从高于背景的3倍标准偏差低至0.1fg/mL；图6显示了1145cm-1峰值的拉曼强度随KIM1浓度的变化。图6中的插图显示了其较宽的线性动态响应范围，从1ng/mL到0.1fg/mL。
结合这里披露的本发明的说明和实践，本发明的其他实施例对于本领域技术人员都是易于想到和理解的。说明和实施例仅被认为是示例性的，本发明的真正范围和主旨均由权利要求所限定。

Claims (7)

1.一种高效表面增强拉曼散射基底材料，包括：
纳米内核，所述纳米内核是由金纳米棒构成；和
纳米外壳，所述纳米外壳是由纳米银材料构成，所述纳米外壳均匀完全的包裹于所述纳米内核表面，所述纳米外壳外表面结合有拉曼检测分子；
所述拉曼检测分子为维生素K4，所述维生素K4经重氮化巯解引入巯基；
所述纳米内核的直径为19-26nm，长度为80-96nm；
所述纳米外壳的厚度为2-18nm。
2.一种权利要求1所述的高效表面增强拉曼散射基底材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)金纳米棒的制备；
1)用水对HAuCl4溶液进行稀释得到稀释液，向稀释液中的加入CTAB溶液得到溶液一；
2)将溶液一快速注入NaBH4溶液中，搅拌得到种子溶液，静置；
3)将CTAB和油酸钠溶解于水中，冷却后加入硝酸银溶液，保温后得到溶液二；
4)一边搅拌一边向溶液二中注射HAuCl4溶液，继续第一次搅拌，改变第二次搅拌速度，一边搅拌一边加入HCl溶液，继续第二次搅拌，最后加入抗坏血酸溶液，进行第三次搅拌，得到生长液；
5)将种子溶液注入生长液中得到混合溶液，将混合溶液静置，将静置后的混合溶液进行离心，收集沉淀物，将沉淀物分散于CTAC溶液中；
6)将步骤5)重复三次，将所述得沉淀物储存在CTAC溶液中，得到金纳米棒溶液；
(2)金核银壳纳米棒的制备；
将金纳米棒溶液用水稀释，向稀释液中加入硝酸银溶液，进行超声波处理后加入抗坏血酸溶液，经水浴保存、离心和分散得到金核银壳纳米棒悬浮液；
(3)拉曼检测分子的键合；
将维生素K4乙醇溶液经重氮化巯解引入巯基，再添加到金核银壳纳米棒悬浮液中得到混合物，温和摇动混合物，得到拉维生素K4标记的金核银壳纳米棒。
3.根据权利要求2所述的一种高效表面增强拉曼散射基底材料制备方法，其特征在于，步骤1)中所述水为去离子水；
所述HAuCl4溶液的浓度为25mM，所述稀释的倍数为50倍；
所述CTAB溶液的浓度为0.2M；
所述HAuCl4溶液与所述CTAB溶液的体积比为1：50；
步骤2)中所述NaBH4溶液的浓度为0.01M，现用现配；
所述NaBH4溶液与所述HAuCl4溶液的体积比为1：6；
步骤2)中所述搅拌为磁力搅拌，所述磁力搅拌的速度为1200rpm，时间为2min，所述静置时间为30min，温度为25-30℃；
步骤3)中所述溶解温度为50℃，所述冷却温度为28-30℃；
步骤3)中所述水与步骤2)中所述NaBH4溶液的体积比为1250：3；
步骤3)中所述CTAB、油酸钠质量和硝酸银溶液体积与步骤1)中所述HAuCl4溶液的体积比为70g：12.34g：180ml：1ml；
所述硝酸银溶液得浓度为4.0M，所述保温的时间为1min；
步骤4)中所述HAuCl4溶液的浓度为1.0mM，所述HCl溶液的浓度为37wt％，所述抗坏血酸溶液得浓度为0.064M；
步骤4)中所述HAuCl4溶液、HCl溶液和所述抗坏血酸溶液与步骤3)中所述水的体积比为250：2.1：1.25：250；
步骤4)中所述第一次搅拌为磁力搅拌，速度为700rpm，持续时间为90min；
步骤4)中所述第二次搅拌为磁力搅拌，速度为400rpm，持续时间为15min；
步骤4)中所述第三次搅拌为磁力搅拌，速度为1200rpm，持续时间为30s；
步骤5)中所述种子溶液的加入量与步骤1)中所述HAuCl4溶液的体积比为4：1；
步骤5)中所述搅拌为磁力搅拌，速度为1500rpm，持续时间为30s；
步骤5)中所述静置的温度为25-30℃，时间为8-12h；
步骤5)中所述离心的转速为8000r/min，持续时间为10min
步骤5)中所述CTAC溶液的浓度为80mM，所述CTAC溶液与所述种子溶液的体积比为1：2；
步骤6)中所述CTAC溶液的浓度为80mM，所述CTAC溶液与所述种子溶液的体积比为1：2。
4.根据权利要求2所述的一种高效表面增强拉曼散射基底材料制备方法，其特征在于，步骤2中所述水为去离子水，所述稀释的倍数为8倍；
所述硝酸溶液的浓度为10mM，所述硝酸银溶液与所述金纳米棒溶液的体积比为(1：0.4)-(1：5)；
所述抗坏血酸溶液的体积与所述硝酸银溶液的体积比为1：1；
所述超声波处理的频率为100kHz，处理时间为2min；
所述水浴保存的温度为63-68℃，时间为4h；
所述离心的转速为8000r/min，时间为10min；
所述分散所用的溶液为去离子水，所述去离子水与所述金纳米棒溶液体积比为1：2。
5.根据权利要求2所述的一种高效表面增强拉曼散射基底材料制备方法，其特征在于，步骤3中所述维生素K4乙醇溶液与所述金核银壳纳米棒悬浊液的体积比为1：500；
所述温和摇动的时间为2h。
6.权利要求1所述的高效表面增强拉曼散射基底材料在制备检测肾损伤因子的表面增强拉曼散射基底材料中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述肾损伤因子为糖蛋白类免疫物质。
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