CN108760715A - 检测多氯联苯表面增强拉曼散射核酸适配体传感器及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测多氯联苯表面增强拉曼散射核酸适配体传感器及应用,采用金‑银核壳纳米颗粒作为拉曼基底,4‑巯基苯甲酸作为拉曼信号分子修饰在金‑银核壳纳米颗粒的表面,以PCB72核酸适配体作为污染物识别元件,构筑得到传感器。与现有技术相比,本发明采用先进的表面增强拉曼技术,大大提高了此传感器对PCB72的检测灵敏度,其线性检测范围是1pg/mL‑1000pg/mL,检测限可达0.3pg/mL;同时采用核酸适配体实现PCB72的特异性识别,大大提高了此传感器对PCB72的检测选择性。本发明可以用于实际水样的检测分析,与其他分析方法相比样品不需要经过复杂的前处理,分析方法简单、快速并且具有超高的灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于水污染检测与治理领域,尤其是涉及一种检测多氯联苯表面增强拉曼散射核酸适配体传感器及应用。
背景技术
多氯联苯(PCBs)是一类全球范围内的持久性有机污染物,因其极难分解、极难溶于水而易溶于脂肪和有机溶剂,所以能够在人类和动物脂肪中大量富集,它们可以通过干扰激素的合成、转运、储存、代谢和反馈调节来破坏雌激素/雄激素分泌系统、甲状腺激素分泌系统和其他内分泌系统,会对新生儿的性别和体重造成影响,严重损害人类健康和生命安全。在20世纪70年代,因为多氯联苯对环境和健康持久性的污染作用,在大多数国家被禁止生产和使用,在2001年,关于持久性有机污染物(POPs)的斯德哥尔摩公约禁止多氯联苯生产和使用。我国地表水环境质量标准(GB 3838-2002)规定多氯联苯的最大浓度限值是20ng/L。尽管通过了限制性规则,迄今为止,在室外空气、海水和水道沉积物中仍然能检测到一定量的多氯联苯,因其生物、物理和化学降解非常困难,因其在有机体的积累和毒性能够对环境和人类健康造成威胁。因此对环境中的PCBs的含量进行监测和毒性的评价对于保护环境和人类健康具有重要的意义。
目前,针对PCBs的检测主要有一些常规的仪器分析的方法,例如被人们广为接受的气相色谱-高分辨质谱联用(GC-HRMS),高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS),液相色谱-串联质谱联用(LC-MS/MS)等。这些检测方法虽然能够对多氯联苯进行准确和灵敏的评估,但在检测过程中样品前处理繁琐,大都需要多级萃取,实验耗时长、费用高,对检测仪器、实验环境、操作人员都有较高的要求。近年来研究人员研制出一系列的新的方法检测PCBs,主要包括电化学传感器、光电化学传感器、生物传感免疫法以及阻抗免疫法,这些方法相对简单,检测快速,但灵敏度、选择性有待进一步提高。
据近期发展研究发现,表面增强拉曼技术(SERS)具有很大的优势,已经发展成为一种功能强大的痕量检测的工具,广泛应用于分析化学、表面科学以及生物医学等领域。但要将表面增强拉曼效应应用于持久性有机污染物的检测,还需要在其基底的制备及其性能方面有所提高。
发明内容
本发明的目的是针对现有多氯联苯检测技术灵敏度不高、分析耗时、样品前处理复杂等难题而提供的一种表面增强拉曼散射核酸适配体传感分析方法。采用还原法制得稳定性良好的金-银核壳纳米颗粒(Au@Ag CS NPs)作为拉曼基底,很大程度上增强了拉曼信号。4-巯基苯甲酸(4-MBA)作为拉曼信号分子修饰在Au@AgCS NPs表面,PCB72核酸适配体作为污染物识别元件可以特异性识别PCB72,结合高灵敏的表面增强拉曼光谱技术和具有特异性识别功能的PCB72的核酸适配体,构筑了具有高灵敏性、高选择性检测PCB72的新颖的SERS生物传感器,其检测限可达0.3pg/mL,具有制备方法简单、操作简便、分析时间短等优点。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
检测多氯联苯表面增强拉曼散射核酸适配体传感器,采用金-银核壳纳米颗粒(Au@Ag CS NPs)作为拉曼基底,4-巯基苯甲酸作为拉曼信号分子修饰在金-银核壳纳米颗粒的表面,以PCB72核酸适配体作为污染物识别元件,结合表面增强拉曼光谱技术和PCB72的核酸适配体的特异性识别能力,构筑具有高灵敏性、高选择性的检测PCB72的新颖的SERS生物传感器。
所述金-银核壳纳米颗粒采用以下方法制备得到:
(1)将氯金酸溶液加热至沸腾之后,加入柠檬酸钠溶液,继续加热并在沸腾情况下搅拌15-20min,至溶液变为酒红色,说明有Au NPs形成;
(2)将硝酸银溶液加入至沸腾的上述溶液中,在搅拌的情况下逐滴加入柠檬酸钠溶液,保持溶液沸腾1h,关闭加热,室温条件下冷却,获得含有金-银核壳纳米颗粒的溶液,将溶液保存于4℃条件下遮光储存。
步骤(1)中氯金酸溶液的浓度为0.01wt%-0.05wt%,柠檬酸钠溶液的浓度为1wt%-5wt%,氯金酸溶液与柠檬酸钠溶液的体积比为100:1.5。
步骤(2)中硝酸银溶液的浓度为0.5wt%-1wt%,柠檬酸钠溶液的浓度为1wt%-5wt%,硝酸银溶液、沸腾溶液以及柠檬酸钠溶液的体积比为0.8:100:1。
将4-巯基苯甲酸加入到含有金-银核壳纳米颗粒的溶液中,混合反应至少4h,对金-银核壳纳米颗粒的表面进行修饰。
所述4-巯基苯甲酸在溶液中的浓度为1μM-8μM。
所述PCB72核酸适配体的碱基序列为:
5'-CACTCGGACCCCATTCTCCTTCCATCCCTCATCCGTCCAC-3'
检测多氯联苯表面增强拉曼散射核酸适配体传感器的应用,采用以下步骤:
(1)将PCB72核酸适配体溶液和PCB72溶液混合反应至少0.5h;
(2)将步骤(1)得到的溶液与经4-巯基苯甲酸修饰的含有金-银核壳纳米颗粒的溶液混合反应10-30min,然后采用表面增强拉曼光谱仪进行拉曼测试,通过拉曼强度与被测物质PCB72浓度的对数关系绘制工作曲线,采用此检测方法对环境水样中PCB72实现高灵敏度检测,其检测限可达0.3pg/mL。
步骤(1)中PCB72核酸适配体溶液的浓度为0.5μM-10μM,PCB72溶液的浓度为0-1000pg/mL,PCB72核酸适配体溶液和PCB72溶液的体积比为1:1。
步骤(2)中混合后溶液体积控制在200μL。
选取电机厂附近、黄浦江水样作为实验中的实际水样,在实际样品分析之前,所有样品均需通过普通的滤纸进行过滤来除去悬浮颗粒和其他固体颗粒,滤液再次经过0.22μM滤膜过滤来纯化实际样品,之后存放在玻璃瓶中,置于4℃冰箱中储存。所有的实际样品必须尽快分析,以减少实际样品本身的生物降解。并且,所有样品在实际分析之前都要进行稀释,减少复杂基体溶液对检测的干扰。采用步骤(2)中相同的方法利用表面增强拉曼散射仪进行拉曼测试,依据其工作曲线得到所取环境水样中PCB72的含量。
该传感器可以对多种可能与PCB72共存的干扰物进行分析检测,通过采用一定浓度的PCB72和100倍于PCB72浓度的干扰物进行拉曼强度的检测,实验结果表明此传感器可以实现高选择性分析,所述的干扰物包括PCB77、PCB101、PCB126、阿特拉津、萘、芘、双酚A、腐植酸。
与现有技术相比,本发明采用的核酸适配体可以通过指数富集配体系统进化(SELEX)技术从随机寡核苷酸库中筛选得到,是连接不同目标分子的寡核苷酸或肽链。核酸适配体作为识别单元,一方面与靶分子具有很高的亲和力,依靠其特殊结构的功能团识别特性,它可以在体外把小分子与相似小分子灵敏的分辨出来,利用核酸适配体检测小分子的检测限一般可以达到毫摩尔至纳摩尔级别。另一方面,核酸适配体具有超越抗体的各种优点,包括更小的尺寸,更容易人工合成和修饰,更好的抗热稳定性。因此本发明将超灵敏的表面增强拉曼光谱技术和具有特异性识别功能的PCB72核酸适配体结合,构筑了具有高灵敏性、高选择性检测PCB72的新颖的SERS生物传感器,具有以下优点:
(1)与传统分析方法如高效气相色谱质谱法相比,本发明中构筑的基于核酸适配体的SERS传感器不需要借助复杂大型的仪器、操作简单、灵敏度高、可实现对PCB72的快速检测。
(2)与现有的生物传感器相比,本发明构筑的基于核酸适配体的SERS传感器制备简单,具有较高的稳定性和重现性,选取Au@Ag CS NPs作为拉曼基底很大程度上提高了此传感器的灵敏度,采用合成成本低、稳定性高、易于修饰的核酸适配体作为传感器的识别元素,很大程度上提升了此传感分析方法的选择性。
(3)本发明在分析实际水样的过程中不需要繁琐的样品前处理过程,只需要简单的过滤处理,节省了样品检测时间,可快速得到实验结果,有望适用于环境监测中的现场快速分析。
附图说明
图1为表面增强拉曼散射强度与PCB72浓度的对数关系的线性拟合曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。应当指出的是,对本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
一种用于多氯联苯检测的表面增强拉曼散射核酸适配体传感分析方法,该传感器通过以下步骤构筑:
(1)所用玻璃仪器均经过王水浸泡、高纯水清洗干净并烘干待用。100mL 0.01%(w/w)HAuCl4煮沸,然后加1.5mL 1%(w/w)的柠檬酸钠。100℃下搅拌15-20min,至溶液变为酒红色,即合成了Au NPs。然后将800μL的AgNO3溶液(0.5%,w/w)加入至沸腾的100mL AuNPs溶液中,在搅拌下逐滴加入1mL 1%(w/w)的柠檬酸钠溶液,然后保持溶液沸腾1h,关闭加热,室温条件下冷却。
(2)10mM 4-MBA加入到Au@Ag CS NPs中,使4-MBA最终浓度为5μM,然后反应一段时间。取浓度为6μM的核酸适配体溶液和浓度范围为1-1000pg/mL的PCB72溶液按比例1:1反应30min。分别取以上两组溶液180μL和20μL混合,然后反应25min,确保最终混合溶液体积为200μL,之后进行拉曼测试,通过拉曼强度与被测物质PCB72浓度的对数关系绘制工作曲线,如图1所示,其线性回归方程为y=5359.571+2153.746x(x为logCPCB72),线性相关系数R2可达0.993,最低检测限为0.3pg/mL。
实施例2
为了确保此传感分析方法表现出最优的SERS效应,需要对4-MBA的浓度、核酸适配体的浓度以及反应时间进行优化。具体步骤为:取浓度范围为1μM-8μM的4-MBA进行拉曼强度测试,获得最优的4-MBA浓度;然后改变核酸适配体浓度,考虑1μM-10μM浓度范围内的核酸适配体的最优浓度;最后考虑不同反应时间对拉曼强度的影响。研究结果表明,4-MBA的最优浓度为5μM,核酸适配体的最优浓度为6μM,最佳反应时间为25min。
实施例3
一种良好的传感分析方法还需要保证信号的重现性和基底的稳定性。具体实验步骤为:制备5批混合溶液进行拉曼检测,每批选择10个点,其相对标准偏差为8.82%,此实验结果表明这种传感分析方法具有良好的信号重现性,可以确保其方法的可靠性;实验还对同一批基底每隔10天进行一次拉曼测试,结果证明基底在60天以内具有相似的拉曼效果,表现出基底的稳定性。
实施例4
采用以上传感分析方法对PCB72进行拉曼线性检测和选择性检测。根据以上优化的实验参数对不同浓度的PCB72标准溶液进行拉曼测试,通过分析结果发现一定浓度范围内,随PCB72浓度的增加,拉曼强度也会相应增加,因此这种分析方法可以实现PCB72的定量检测。此传感分析方法对PCB72的检测限可达0.3pg/mL,线性检测范围为1-1000pg/mL。对多种可能与PCB72共存的干扰物进行分析检测,通过分别测定一定浓度PCB72和100倍于PCB72浓度的干扰物的拉曼强度,此传感器表现出一定的选择性,所述的干扰物包括PCB77、PCB101、PCB126、阿特拉津、萘、芘、双酚A、腐植酸。
实施例5
选取电机厂附近、黄浦江水样作为实验中实际水样,在实际样品分析之前,所有样品均需通过普通的滤纸进行过滤来除去悬浮颗粒和其他固体颗粒,滤液再次经过0.22μM滤膜过滤来纯化实际样品,之后存放在玻璃瓶中,置于4℃冰箱中。所有的实际样品必须尽快分析,以减少实际样品本身的生物降解。并且,所有样品在实际分析之前都要进行稀释,减少复杂基体溶液对检测的干扰。采用以上传感分析方法以及实验参数,根据PCB72的定量标准曲线得到实际水样中PCB72的含量,并与GC-MS的测定结果进行对比,基本一致。
实施例6
检测多氯联苯表面增强拉曼散射核酸适配体传感器,采用金-银核壳纳米颗粒(Au@Ag CS NPs)作为拉曼基底,将4-巯基苯甲酸加入到含有金-银核壳纳米颗粒的溶液中,混合反应至少4h,对金-银核壳纳米颗粒的表面进行修饰,4-巯基苯甲酸在溶液中的浓度为1μM,以PCB72核酸适配体作为污染物识别元件,其碱基序列为:5'-CACTCGGACCCCATTCTCCTTCCATCCCTCATCCGTCCAC-3',结合表面增强拉曼光谱技术和PCB72的核酸适配体的特异性识别能力,构筑具有高灵敏性、高选择性的检测PCB72的新颖的SERS生物传感器。
金-银核壳纳米颗粒采用以下方法制备得到:
(1)将浓度为0.01wt%氯金酸溶液加热至沸腾之后,加入浓度为1wt%柠檬酸钠溶液,氯金酸溶液与柠檬酸钠溶液的体积比为100:1.5,继续加热并在沸腾情况下搅拌15min,至溶液变为酒红色,说明有Au NPs形成;
(2)将浓度为0.5wt%硝酸银溶液加入至沸腾的上述溶液中,在搅拌的情况下逐滴加入浓度为1wt%柠檬酸钠溶液,硝酸银溶液、沸腾溶液以及柠檬酸钠溶液的体积比为0.8:100:1,保持溶液沸腾1h,关闭加热,室温条件下冷却,获得含有金-银核壳纳米颗粒的溶液,将溶液保存于4℃条件下遮光储存。
检测多氯联苯表面增强拉曼散射核酸适配体传感器的应用,采用以下步骤:
(1)将浓度为0.5μM的PCB72核酸适配体溶液和浓度为0-1000pg/mL的PCB72溶液按体积比为1:1混合反应至少0.5h;
(2)将步骤(1)得到的溶液与经4-巯基苯甲酸修饰的含有金-银核壳纳米颗粒的溶液混合,溶液体积控制在200μL进一步反应10-30min,然后采用表面增强拉曼光谱仪进行拉曼测试,通过拉曼强度与被测物质PCB72浓度的对数关系绘制工作曲线,采用此检测方法对环境水样中PCB72实现高灵敏度检测,其检测限可达0.3pg/mL。
实施例7
检测多氯联苯表面增强拉曼散射核酸适配体传感器,采用金-银核壳纳米颗粒(Au@Ag CS NPs)作为拉曼基底,将4-巯基苯甲酸加入到含有金-银核壳纳米颗粒的溶液中,混合反应至少4h,对金-银核壳纳米颗粒的表面进行修饰,4-巯基苯甲酸在溶液中的浓度为8μM,以PCB72核酸适配体作为污染物识别元件,其碱基序列为:5'-CACTCGGACCCCATTCTCCTTCCATCCCTCATCCGTCCAC-3',结合表面增强拉曼光谱技术和PCB72的核酸适配体的特异性识别能力,构筑具有高灵敏性、高选择性的检测PCB72的新颖的SERS生物传感器。
金-银核壳纳米颗粒采用以下方法制备得到:
(1)将浓度为0.05wt%氯金酸溶液加热至沸腾之后,加入浓度为5wt%柠檬酸钠溶液,氯金酸溶液与柠檬酸钠溶液的体积比为100:1.5,继续加热并在沸腾情况下搅拌15min,至溶液变为酒红色,说明有Au NPs形成;
(2)将浓度为1wt%硝酸银溶液加入至沸腾的上述溶液中,在搅拌的情况下逐滴加入浓度为5wt%柠檬酸钠溶液,硝酸银溶液、沸腾溶液以及柠檬酸钠溶液的体积比为0.8:100:1,保持溶液沸腾1h,关闭加热,室温条件下冷却,获得含有金-银核壳纳米颗粒的溶液,将溶液保存于4℃条件下遮光储存。
检测多氯联苯表面增强拉曼散射核酸适配体传感器的应用,采用以下步骤:
(1)将浓度为10μM的PCB72核酸适配体溶液和浓度为0-1000pg/mL的PCB72溶液按体积比为1:1混合反应至少0.5h;
(2)将步骤(1)得到的溶液与经4-巯基苯甲酸修饰的含有金-银核壳纳米颗粒的溶液混合,溶液体积控制在200μL进一步反应10-30min,然后采用表面增强拉曼光谱仪进行拉曼测试,通过拉曼强度与被测物质PCB72浓度的对数关系绘制工作曲线,采用此检测方法对环境水样中PCB72实现高灵敏度检测,其检测限可达0.3pg/mL。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是,本发明并不局限于上述特定实施方式,本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改,这并不影响本发明的实质内容。
序列表
<110> 同济大学
<120> 检测多氯联苯表面增强拉曼散射核酸适配体传感器及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cactcggacc ccattctcct tccatccctc atccgtccac 40
Claims (10)
1.检测多氯联苯表面增强拉曼散射核酸适配体传感器,其特征在于,采用金-银核壳纳米颗粒作为拉曼基底,4-巯基苯甲酸作为拉曼信号分子修饰在金-银核壳纳米颗粒的表面,以PCB72核酸适配体作为污染物识别元件,构筑得到传感器。
2.根据权利要求1所述的检测多氯联苯表面增强拉曼散射核酸适配体传感器,其特征在于,所述金-银核壳纳米颗粒采用以下方法制备得到:
(1)将氯金酸溶液加热至沸腾之后,加入柠檬酸钠溶液,继续加热并在沸腾情况下搅拌15-20min,至溶液变为酒红色;
(2)将硝酸银溶液加入至沸腾的上述溶液中,在搅拌的情况下逐滴加入柠檬酸钠溶液,保持溶液沸腾1h,关闭加热,室温条件下冷却,获得含有金-银核壳纳米颗粒的溶液。
3.根据权利要求2所述的检测多氯联苯表面增强拉曼散射核酸适配体传感器,其特征在于,步骤(1)中氯金酸溶液的浓度为0.01wt%-0.05wt%,柠檬酸钠溶液的浓度为1wt%-5wt%,氯金酸溶液与柠檬酸钠溶液的体积比为100:1.5。
4.根据权利要求2所述的检测多氯联苯表面增强拉曼散射核酸适配体传感器,其特征在于,步骤(2)中硝酸银溶液的浓度为0.5wt%-1wt%,柠檬酸钠溶液的浓度为1wt%-5wt%,硝酸银溶液、沸腾溶液以及柠檬酸钠溶液的体积比为0.8:100:1。
5.根据权利要求1所述的检测多氯联苯表面增强拉曼散射核酸适配体传感器,其特征在于,将4-巯基苯甲酸加入到含有金-银核壳纳米颗粒的溶液中,混合反应至少4h,对金-银核壳纳米颗粒的表面进行修饰。
6.根据权利要求5所述的检测多氯联苯表面增强拉曼散射核酸适配体传感器,其特征在于,所述4-巯基苯甲酸在溶液中的浓度为1μM-8μM。
7.根据权利要求1所述的检测多氯联苯表面增强拉曼散射核酸适配体传感器,其特征在于,所述PCB72核酸适配体的序列为:
5'-CACTCGGACCCCATTCTCCTTCCATCCCTCATCCGTCCAC-3'。
8.检测多氯联苯表面增强拉曼散射核酸适配体传感器的应用,其特征在于,采用以下步骤:
(1)将PCB72核酸适配体溶液和PCB72溶液混合反应至少0.5h;
(2)将步骤(1)得到的溶液与经4-巯基苯甲酸修饰的含有金-银核壳纳米颗粒的溶液混合反应10-30min,然后采用表面增强拉曼光谱仪进行拉曼测试,通过拉曼强度与被测物质PCB72浓度的对数关系绘制工作曲线。
9.根据权利要求8所述的检测多氯联苯表面增强拉曼散射核酸适配体传感器的应用,其特征在于,步骤(1)中PCB72核酸适配体溶液的浓度为0.5μM-10μM,PCB72溶液的浓度为0-1000pg/mL,PCB72核酸适配体溶液和PCB72溶液的体积比为1:1。
10.根据权利要求8所述的检测多氯联苯表面增强拉曼散射核酸适配体传感器的应用,其特征在于,步骤(2)中混合后溶液体积控制在200μL。
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