CN115728284B - 一种基于表面增强拉曼光谱测定核酸适配体与小分子靶标间相互作用的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于表面增强拉曼光谱测定核酸适配体与小分子靶标间相互作用的方法，通过在室温下用盐酸羟胺还原硝酸银的方法制备高活性的纳米银胶颗粒，并将其作为增强试剂与样品溶液混合，通过分析核酸适配体和小分子靶标结合前后的表面增强拉曼光谱信号变化，辨别靶标结合对核酸适配体空间结构的影响，本发明具有分析速度快、灵敏度高的特点，为核酸适配体的筛选、设计和结构优化提供了新策略、新思路。
Description
技术领域
本发明涉及拉曼分析技术领域和相互作用检测技术领域，具体涉及一种基于表面增强拉曼光谱测定核酸适配体与小分子靶标相互作用的方法。
背景技术
核酸适配体作为一类能够特异性识别靶标的人工合成单链核苷酸分子，可与纳米材料或微流控技术等结合，被广泛应用于不同靶标的检测和递送系统。然而，由于其特异性识别靶标的机制尚不清楚，目前真正能够应用于生物分析和临床的核酸适配体数量非常有限，其分析应用多停留在方法学研究阶段。
日前，用来研究分子间相互作用的传统分析方法有核磁共振法、X-射线晶体衍射法等，虽然可以准确地区分结合前后的差异，但是存在样品量大、成本高、分析时间长等缺点。拉曼光谱法可以很好的展现生物分子固有的指纹信息，基于金属的粗糙表面，表面等离体共振效应的表面增强拉曼光谱（SERS）具有超高灵敏度，快速检测和表征分子结构的特点，已被广泛应用于生物分析，法医鉴定，食品检测等领域。然而，拉曼技术会受到荧光干扰，在检测低含量的生物分子间相互作用或特定化学键的方面存在局限性。
因此，亟需一种可以增强拉曼信号测定核酸适配体与小分子靶标相互作用的方法，采用拉曼光谱法提升分析速度与灵敏度，本发明提出一种纳米银胶颗粒，将其作为增强试剂以获得增强的拉曼信号用于测定核酸适配体与小分子靶标间相互作用。
发明内容
为解决上述问题，本发明公开了一种基于表面增强拉曼光谱测定核酸适配体与小分子靶标相互作用的方法，在室温下利用盐酸羟胺还原硝酸银来快速制备高活性的纳米银胶颗粒，将其作为增强试剂并通过加入聚集剂硫酸镁使核酸适配体靠近纳米银胶颗粒，以获得增强的拉曼信号；通过比较结合前后核酸适配体的特征峰形状、强度和位置，解读靶标结合对核酸适配体空间结构的影响，本发明具有分析速度快、灵敏度高的特点，为核酸适配体的筛选、设计和结构优化提供了新策略、新思路。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种基于表面增强拉曼光谱测定核酸适配体与小分子靶标间相互作用的方法，具体步骤如下：
（1）增强试剂纳米银胶颗粒的制备：将硝酸银溶液快速加入盐酸羟胺和氢氧化钠的混合溶液中，在室温下磁力搅拌混合均匀，得到灰绿色的混合溶液，并通过离心、去除上清液的方法进行浓缩得到纳米银胶颗粒；
（2）纳米银胶颗粒-小分子溶液的制备：将步骤（1）得到的浓缩后的纳米银胶颗粒与小分子溶液混合并加入聚集剂硫酸镁溶液，吹打混匀后加入去离子水，得到最终体积为300 μL 的纳米银胶颗粒-小分子溶液；
（3）纳米银胶颗粒-核酸适配体溶液的制备：将步骤（1）得到的纳米银胶颗粒与适配体溶液混合并加入聚集剂硫酸镁溶液，吹打混匀后加入去离子水，得到最终体积为300 μL 的纳米银胶颗粒-核酸适配体溶液；
（4）纳米银胶颗粒-核酸适配体与小分子混合溶液的制备：将步骤（1）得到的纳米银胶颗粒与适配体溶液混合并加入聚集剂硫酸镁溶液，吹打混匀后向溶液中加入小分子溶液并再次加入聚集剂硫酸镁溶液，经吹打混匀后加入去离子水，最终体积为300 μL，混合孵育30 min，得到纳米银胶颗粒-核酸适配体与小分子混合溶液；
（5）拉曼光谱的检测：采用拉曼光谱仪分别对骤（2）至步骤（4）配置的混合溶液进行拉曼图谱信息采集，激发波长为785 nm，积分时间为30 s，激光功率为100 mW, 仪器分辨率为±2 cm-1，扫描次数为3次，所有SERS图谱的数据，使用Labspec6软件进一步处理，选取波段为400-1800 cm-1 ；
（6）根据步骤（5）得到的核酸适配体表面增强拉曼光谱图，选取特征吸收峰，对比结合前后特征峰的峰形状、峰强度、位置、是否一致。
作为本发明的一种改进，所述步骤（1）中灰绿色混合溶液中硝酸银的最终浓度为1.0×10-3 M，盐酸羟胺的最终浓度为1.5×10-3 M，氢氧化钠的最终浓度为3.0×10-3 M；所述步骤（1）中溶液浓缩的倍数为100倍。
作为本发明的一种改进，所述步骤（1）中浓缩得到的纳米银胶颗粒的体积为60~150 μL。
作为本发明的一种改进，所述步骤（2）与步骤（4）混合后溶液中小分子的最终浓度均为1.0×10-3 M。
作为本发明的一种改进，所述步骤（2）中混合加入的聚集剂硫酸镁溶液浓度为1.0×10-2 M，体积为12~18 μL。
作为本发明的一种改进，所述步骤（3）与步骤（4）混合后溶液中核酸适配体的最终浓度均为1.0×10-4 M。
作为本发明的一种改进，所述步骤（3）中聚集剂硫酸镁溶液浓度为1.0×10-2 M，体积为20~60 μL。
作为本发明的一种改进，所述步骤（4）中聚集剂硫酸镁溶液浓度为1.0×10-2 M，第一次混合加入的聚集剂硫酸镁溶液体积为20~60 μL，第二次加入的聚集剂硫酸镁溶液体积为12~18 μL。
作为本发明的一种改进，所述步骤（6）中核酸适配体的特征峰波数为737 ±2 cm-1、1329 ± 2 cm-1、1458 ± 2 cm-1和1578 ± 2 cm-1。
作为本发明的一种改进，所述步骤（6）中以特征峰的峰强度为指标，选取结合前后的特征峰的峰强度，改变的相对幅度按下面的公式计算：
B=（ΔI/ I)×100%
其中，ΔI为核酸适配体与小分子靶标结合后与结合前的峰强度差值，I为核酸适配体未结合小分子靶标的峰强度，选择核酸适配体结合前后变化最为敏感的特征峰分析结合程度，找到对应的特征峰的归属。
本发明的有益效果为：
1.本发明在室温下利用盐酸羟胺快速还原硝酸银来制备增强试剂纳米银胶颗粒，整个反应几秒内完成十分迅速且无需加热。
2.本发明制得的纳米银胶颗粒背景干扰小，与核酸适配体溶液混合后无需加入清洗剂，只加入聚集剂硫酸镁便可获得相应的增强拉曼信号，提高了检测的灵敏度。
3.本发明采用拉曼光谱法，通过比较靶标结合前后核酸适配体的拉曼图谱变化，分析核酸适配体与靶标间的结合位点及其空间结构改变的原因，该方法具有快速、灵敏度高，重现性好等特点，也可用于核酸与药物分子等其它相互作用体系的研究。
附图说明
图1为本发明的实施例1和2过程中制得的纳米银胶颗粒的紫外可见光谱图。
图2为本发明的实施例1和2过程中制得的纳米银胶颗粒的扫描电子显微镜（SEM）图。
图3为本发明的实施例1过程中制得的纳米银胶颗粒浓缩倍数对适配体AMP17拉曼图谱的影响图，其中：标记a-e分别为40倍、60倍、80倍、100倍、120倍。
图4为本发明的实施例1中氨苄青霉素、适配体AMP17、适配体AMP17-氨苄青霉素复合物拉曼图谱，其中：标记a-d分别为氨苄青霉素、适配体AMP17、适配体AMP17-氨苄青霉素复合物、图谱b与c的差谱。
图5为本发明的实施例2中腺苷、适配体ABA、适配体ABA-腺苷复合物拉曼图谱。其中，标记a-d分别为腺苷、适配体ABA、适配体ABA-腺苷复合物、图谱b与c的差谱。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
（1）称量16.97 mg的硝酸银溶于10 mL水中，称量10.40 mg盐酸羟胺和12.00 mg氢氧化钠加入到100 mL的烧瓶中溶于90 mL的水中，将10 mL（1.0×10-2 M）硝酸银溶液快速加入到90 mL（1.67×10-3 M）盐酸羟胺和氢氧化钠（3.0×10-3 M）混合溶液中，过程中保持磁力搅拌，整个反应在几秒内完成，并通过离心浓缩的方式将其分别浓缩40、60、80、100、120倍，得到所需的纳米银胶颗粒试剂。
通过紫外可见吸收光谱检测表明，其最大吸收波长为411 nm，如图1所示，通过SEM检测显示（如图2所示），纳米银粒子的粒径大约50 nm。
（2）将90 μL离心浓缩后的纳米银胶颗粒与30 μL的1.0×10-2 M氨苄青霉素溶液混合并加入16 μL的1.0×10-2 M的硫酸镁溶液，吹打混匀，加入去离子水, 最终体积300 μL。
利用拉曼光谱仪收集拉曼光谱的信息，如图4a所示。
（3）将90 μL离心浓缩后的纳米银胶颗粒与60 μL的5.0×10-4 M核酸适配体AMP17溶液混合并加入40 μL的1.0×10-2 M的硫酸镁溶液，吹打混匀，加入去离子水，最终体积300μL。
采用拉曼光谱仪收集拉曼光谱的信息，结果如图4b所示。
（4）将90 μL离心浓缩后的纳米银胶颗粒与60 μL的5.0×10-4 M适配体AMP17溶液混合并加入40 μL的1.0×10-2 M的硫酸镁溶液，吹打混匀，再向溶液中加入30 μL的1.0×10-2 M小分子氨苄青霉素溶液并加入16 μL的1.0×10-2 M的硫酸镁溶液，吹打混匀，加入去离子水，最终体积300 μL，混合孵育30 min。
用拉曼光谱仪收集拉曼光谱的信息，结果如图4c所示。
结果发现，图4c和图4b的特征峰非常类似，而氨苄青霉素的特征峰在与适配体AMP17结合后消失。原因可能是，氨苄青霉素相对于核酸适配体AMP17的质量和体积都很小，与适配体AMP17结合后嵌入适配体的内部；氨苄青霉素在溶液中几乎不电离，与负电性的适配体AMP17竞争基底的能力弱。
对图4b和4c做差谱如图4d所示，适配体AMP17的4个特征峰分别位于737 cm-1、1330cm-1、1458 cm-1和1580 cm-1处，相比于结合前的峰强度有所降低，变化幅度分别为B 737cm-1 = -38.4%、B 1330cm-1 = -45.0%、B 1458cm-1 = -43.9%、B 1580cm-1 = -35.5%，而737 cm-1、1330 cm-1和 1580 cm-1处的峰可归属于碱基A和G的环呼吸振动，1458 cm-1处的峰可归属于脱氧核糖的振动和碱基A的环呼吸振动，可能是结合后相应碱基A和G与纳米银粒子表面的距离增大，导致峰的强度减弱。510 cm-1处的峰是一个新的特征峰，既不属于适配体AMP17也不属于氨苄青霉素，可归属于碱基G的变形振动。适配体AMP17特征峰强度的降低以及新峰的出现都证明了适配体AMP17与氨苄青霉素发生了相互作用，以及适配体AMP17空间结构的改变。
实施例2
（1）称量16.97 mg的硝酸银溶于10 mL水中，称量10.40 mg盐酸羟胺和12.00 mg氢氧化钠加入到100 mL的烧瓶中溶于90 mL的水中，将10 mL（1.0×10-2 M）硝酸银溶液快速加入到90 mL（1.67×10-3 M）盐酸羟胺和氢氧化钠（3.0×10-3 M）混合溶液中，过程中保持磁力搅拌，整个反应在几秒内完成，并通过离心浓缩的方式将其浓缩100倍，得到所需的纳米银胶颗粒试剂。
经紫外可见吸收光谱检测，其最大吸收波长为411 nm，如图1所示，根据SEM检测（如图2所示）结果可见，纳米银粒子的粒径大约为50 nm。
（2）将90 μL离心浓缩后的纳米银胶颗粒与30 μL的1.0×10-2 M小分子腺苷溶液混合并加入16 μL的1.0×10-2 M的硫酸镁溶液，吹打混匀，加入去离子水, 最终体积300 μL。
利用拉曼光谱仪收集拉曼光谱的信息，结果如图5a所示。
（3）将90 μL离心浓缩后的纳米银胶颗粒与60 μL的5.0×10-4 M适配体ABA溶液混合并加入40 μL的1.0×10-2 M的硫酸镁溶液，吹打混匀，加入去离子水，最终体积300 μL。
采用拉曼光谱仪收集拉曼光谱的信息，结果如图5b所示。
（4）将90 μL离心浓缩后的纳米银胶颗粒与60 μL的5.0×10-4 M适配体ABA溶液混合并加入40 μL的1.0×10-2 M的硫酸镁溶液，吹打混匀，再向溶液中加入30 μL的1.0×10-2 M小分子腺苷溶液并加入16 μL的1.0×10-2 M的硫酸镁溶液，吹打混匀，加入去离子水，最终体积300 μL，混合孵育30 min。
实验结果如图5c所示，发现图5c和图5b的谱图非常类似，主要是适配体的特征峰，而小分子腺苷的特征峰消失了。原因可能是，腺苷分子在溶液中显电中性，与负电性的适配体ABA竞争基底的能力较弱。
对图5b和5c做差谱如图5d所示，适配体ABA位于737 cm-1、1329 cm-1和1577 cm-1处的峰有所升高，变化幅度分别为B 737cm-1 = 41.3%、B 1329cm-1= 52.9%、B 1577cm-1 = 22.9%，而737cm-1、1329 cm-1和1577 cm-1处的峰可归属于碱基A和G的环呼吸振动，可能是构象改变后，碱基A和G与纳米银粒子的距离变短，或者是构象改变后，碱基A和G暴露出来使得碱基的数目增加，特征峰强度增加；而1457 cm-1处的峰归属于脱氧核糖的振动和和碱基A的环呼吸振动，结合后峰强度有所降低，结合程度B 1457cm -1 = -34.35%。适配体ABA的特征峰强度既有升高又有降低，证明了适配体ABA与腺苷存在结合，且空间结构也发生了变化。
需要说明的是，上述仅仅是本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的保护范围，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，在上述实施例的基础上还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于表面增强拉曼光谱测定核酸适配体与小分子靶标相互作用的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)增强试剂纳米银胶颗粒的制备：将硝酸银溶液快速加入盐酸羟胺和氢氧化钠的混合溶液中，在室温下磁力搅拌混合均匀，得到灰绿色的混合溶液，并通过离心、去除上清液的方法进行浓缩得到纳米银胶颗粒；
(2)纳米银胶颗粒-小分子溶液的制备：将步骤(1)得到的浓缩后的纳米银胶颗粒与小分子溶液混合并加入聚集剂硫酸镁溶液，吹打混匀后加入去离子水，得到最终体积为300μL的纳米银胶颗粒-小分子溶液；
(3)纳米银胶颗粒-核酸适配体溶液的制备：将步骤(1)得到的纳米银胶颗粒与适配体溶液混合并加入聚集剂硫酸镁溶液，吹打混匀后加入去离子水，得到最终体积为300μL的纳米银胶颗粒-核酸适配体溶液；
(4)纳米银胶颗粒-核酸适配体与小分子混合溶液的制备：将步骤(1)得到的纳米银胶颗粒与适配体溶液混合并加入聚集剂硫酸镁溶液，吹打混匀后向溶液中加入小分子溶液并再次加入聚集剂硫酸镁溶液，经吹打混匀后加入去离子水，最终体积为300μL，混合孵育30min，得到纳米银胶颗粒-核酸适配体与小分子混合溶液；
(5)拉曼光谱的检测：采用拉曼光谱仪分别对步骤(2)至步骤(4)配置的混合溶液进行拉曼图谱信息采集，激发波长为785nm，积分时间为30s，激光功率为100mW,仪器分辨率为±2cm-1，扫描次数为3次，所有SERS图谱的数据，使用Labspec6软件进一步处理，选取波段为400-1800cm-1；
(6)根据步骤(5)得到的核酸适配体表面增强拉曼光谱图，选取特征吸收峰，对比结合前后特征峰的峰形状、峰强度、位置、是否一致；
所述步骤(2)与步骤(4)混合后溶液中小分子为氨苄青霉素或腺苷，所述步骤(3)与步骤(4)混合后溶液中适配体是以氨苄青霉素或腺苷为靶标对应的核酸适配体。
2.根据权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼光谱测定核酸适配体与小分子靶标间相互作用的方法，其特征在于：所述步骤(1)中灰绿色混合溶液中硝酸银的最终浓度为1.0×10-3M，盐酸羟胺的最终浓度为1.5×10-3M，氢氧化钠的最终浓度为3.0×10-3M；所述步骤(1)中溶液浓缩的倍数为100倍。
3.根据权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼光谱测定核酸适配体与小分子靶标间相互作用的方法，其特征在于：所述步骤(1)中浓缩得到的纳米银胶颗粒的体积为60～150μL。
4.根据权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼光谱测定核酸适配体与小分子靶标间相互作用的方法，其特征在于：所述步骤(2)与步骤(4)混合后溶液中小分子最终浓度均为1.0×10-3M。
5.根据权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼光谱测定核酸适配体与小分子靶标间相互作用的方法，其特征在于：所述步骤(2)中混合加入的聚集剂硫酸镁溶液浓度为1.0×10-2M，体积为12-18μL。
6.根据权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼光谱测定核酸适配体与小分子靶标间相互作用的方法，其特征在于：所述步骤(3)与步骤(4)混合后溶液中核酸适配体的最终浓度均为1.0×10-4M。
7.根据权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼光谱测定核酸适配体与小分子靶标间相互作用的方法，其特征在于：所述步骤(3)中聚集剂硫酸镁溶液浓度为1.0×10-2M，体积为20-60μL。
8.根据权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼光谱测定核酸适配体与小分子靶标间相互作用的方法，其特征在于：所述步骤(4)中聚集剂硫酸镁溶液浓度为1.0×10-2M，第一次混合加入的聚集剂硫酸镁溶液体积为20-60μL，第二次加入的聚集剂硫酸镁溶液体积为12-18μL。
9.根据权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼光谱测定核酸适配体与小分子靶标间相互作用的方法，其特征在于：所述步骤(6)中核酸适配体的特征峰波数为737±2cm-1、1329±2cm-1、1458±2cm-1和1578±2cm-1。
10.根据权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼光谱测定核酸适配体与小分子靶标间相互作用的方法，其特征在于：所述步骤(6)中以特征峰的峰强度为指标，选取结合前后的特征峰的峰强度，改变的相对幅度按下面的公式计算：
B＝(ΔI/I)×100％
其中，ΔI为核酸适配体与小分子靶标结合后与结合前的峰强度差值，I为核酸适配体未结合小分子靶标的峰强度，选择核酸适配体结合前后变化最为敏感的特征峰分析结合程度，找到对应的特征峰的归属。
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