CN110567936A - 一种基于核酸适配体检测牛奶中环丙氨嗪的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于核酸适配体检测牛奶中环丙氨嗪的方法，该方法包括以下步骤：1)制备包括核酸适配体的检测试剂，并对牛奶样品进行预处理；2)绘制不同浓度的环丙氨嗪标准液与对应的拉曼强度的标准曲线；3)将检测试剂加入至预处理后的牛奶样品中，反应后测定拉曼强度，并利用标准曲线得到牛奶样品中环丙氨嗪的含量数据。与现有技术相比，本发明利用环丙氨嗪特异性核酸适配体控制合成具有拉曼效应的纳米银来进行环丙氨嗪检测，检测方法灵敏度高，选择性好，最低检测限为15.5ppb，操作简便，前处理简单，不需要大型仪器，成本低，可用于牛奶中环丙氨嗪的检测。
Description
技术领域
本发明属于牛奶中环丙氨嗪检测技术领域，涉及一种利用环丙氨嗪核酸适配体控制合成具有拉曼效应的纳米银，并通过拉曼光谱仪检测牛奶中环丙氨嗪的方法。
背景技术
环丙氨嗪(Cyromazine，Cyr)的化学名为2-环丙胺基-4,6-二氨基三嗪，与阿特拉津、西玛津、莠灭津、扑灭津等同属三嗪类或均三氮苯化合物，是一种高效抑制昆虫生长剂、杀寄生虫类杀虫剂，在畜禽养殖过程中作为饲料添加剂使用。研究表明环丙氨嗪进入动物体内绝大部分以原药或代谢物形式通过奶或者粪尿排泄，随后再经由畜禽粪便暴露在土壤和水环境中。土壤或水环境中的环丙氨嗪通过环境转归再次进入食物链，对不同营养级生物和人体的健康造成潜在隐患。环丙氨嗪在动物和植物体内经脱烷基化作用代谢为三聚氰胺(Melamine，Mel)，而三聚氰胺的主要代谢产物为三聚氰酸(Cyanuric acid，CA)、三聚氰酸一酰胺(Ammelide，Amd)和三聚氰酸二酰胺(Ammeline，Amn)。长期摄入三聚氰胺会导致膀胱结石，使膀胱癌的发生率明显提高。
对牛奶中环丙氨嗪及其代谢产物的快速检测，可以有效避免有毒有害物质进入人体。环丙氨嗪及其代谢物三聚氰胺是一组分子量小、且极性强的化合物，要想将环丙氨嗪及其相关代谢物从实际样品中提取出来非常困难。美国EPA严格规定了环丙氨嗪必须作为饲料添加剂且只能放置在厩舍喂饲槽中使用，但仍有通过喷洒用于饲养场所、堆肥、垃圾等处的灭蝇。环丙氨嗪经动物口服后绝大部分以原药或代谢产物三聚氰胺形式经动物尿粪排泄，在动物体内残留很少。美国EPA和PRC制定了环丙氨嗪在一系列动植物食品中的最高残留标准，其中牛奶为0.05mg/kg。
根据环丙氨嗪及其代谢产物三聚氰胺在食品中的限量标准要求，目前常用于环丙氨嗪及其代谢产物残留检测的方法有容量分析法；色谱分析方法，包括高效液相色谱法；免疫化学分析法；光学分析法等。在GB 29704-2013中采用超高效液相色谱-串联质谱法来测定动物性食品中环丙氨嗪的残留。随着环丙氨嗪类兽药残留检测列入生乳收购及乳制品产品出厂必检项目，而由于上述检测方法和条件的限制，面对庞大的检测数量会导致成本巨大且工作量重，难以满足现场快速检测的需求，这就在客观上要求改进现有的检测方法，开发出高通量、快速、高灵敏的环丙氨嗪检测方法，用于日常监控。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种基于核酸适配体检测牛奶中环丙氨嗪的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种基于核酸适配体检测牛奶中环丙氨嗪的方法，该方法包括以下步骤：
1)制备包括核酸适配体的检测试剂，并对牛奶样品进行预处理；
2)绘制不同浓度的环丙氨嗪标准液与对应的拉曼强度的标准曲线；
3)将检测试剂加入至预处理后的牛奶样品中，反应后测定拉曼强度，并利用标准曲线得到牛奶样品中环丙氨嗪的含量数据。
进一步地，步骤1)中，所述的检测试剂包括核酸适配体溶液、硝酸银溶液及硼氢化钠溶液。检测试剂均为水溶液。
进一步地，所述的核酸适配体溶液中，核酸适配体序列为5’-CCCGGTTGGTTGGTTGGTTTTCCC-3’。
进一步地，所述的核酸适配体溶液的浓度为70-2000nmol/L，所述的硝酸银溶液的浓度为0.08-0.12mmol/L，所述的硼氢化钠溶液的浓度为0.08-0.12mmol/L。
作为优选的技术方案，所述的核酸适配体溶液、硝酸银溶液、硼氢化钠溶液与牛奶样品的体积比为1:(8-10):(8-10):(0.8-1.2)，优选为1:9:9:1。
进一步地，所述的预处理过程为：向牛奶样品中加入三氯乙酸，静置后离心，取上清液，并调节上清液的pH值为4.5-6。三氯乙酸用于沉淀蛋白。
进一步地，步骤2)中，所述的标准曲线的绘制过程为：
2-1)将不同浓度的环丙氨嗪标准液分别加入至多个容器中；
2-2)分别向步骤2-1)中的多个容器中加入核酸适配体溶液，并在25-35℃下孵育15-25min；
2-3)分别向步骤2-2)中的多个容器中加入硝酸银溶液，并在-5℃至5℃下孵育3-8min；
2-4)分别向步骤2-3)中的多个容器中加入硼氢化钠溶液，并在20-30℃下反应7-15min；
2-5)测定步骤2-4)中的多个容器中溶液的拉曼强度，绘制出不同浓度的环丙氨嗪标准液与对应的拉曼强度的标准曲线。
进一步地，步骤2-5)中，所述的拉曼强度的测定方法为：取容器中的溶液置于硅片上，利用拉曼光谱仪测定硅片上溶液的拉曼强度。
进一步地，所述的拉曼光谱仪的激发波长为530-535nm，优选为532nm。
进一步地，步骤3)中，将检测试剂加入至预处理后的牛奶样品中的过程为：
3-1)向预处理后的牛奶样品中加入核酸适配体溶液，并在25-35℃下孵育15-25min，得到混合液A；
3-2)向步骤3-1)中的混合液A中加入硝酸银溶液，并在-5℃至5℃下孵育3-8min，得到混合液B；
3-3)向步骤3-2)中的混合液B中加入硼氢化钠溶液，并在20-30℃下反应7-15min。
进一步地，步骤3)中，所述的牛奶样品中的环丙氨嗪含量为0-0.5ppm。本发明方法能够用于测定环丙氨嗪含量为0-0.5ppm的牛奶样品中环丙氨嗪含量。
核酸适配体是通过指数富集配体系统体外进化(SELEX)技术，从大量寡聚核苷酸库中筛选出对靶物质具有高特异性和高结核性的核酸片段。与蛋白质类抗体和生物酶相比，核酸适配体具有更高的亲和力、稳定性和特异性，且易于标记设计出传感器，可用于核酸、蛋白、无机金属离子及病毒颗粒和细胞的检测。本发明筛选出能够与环丙氨嗪特异性结合的核酸适配体，并基于该核酸适配体使用拉曼光谱仪检测牛奶中的环丙氨嗪。
本发明的检测原理为：根据环丙氨嗪的结构特征，结合环丙氨嗪可以和胸腺嘧啶通过氢键相结合的性质，设计合成以胸腺嘧啶为主，富含鸟嘌呤的环丙氨嗪高特异性核酸适配体，再结合DNA链各碱基与银离子结合的亲密度，在DNA链前后各加上胞嘧啶。当牛奶中存在环丙氨嗪时，加入环丙氨嗪特异性核酸适配体，该核酸适配体与环丙氨嗪紧密结合在一起，此时进行原位还原纳米银处理环丙氨嗪样品，由于核酸的电负性以及条件控制使得纳米银颗粒紧密吸附在适配体表面，在其外部形成一层厚厚的纳米银壳，达到SERS(表面增强拉曼光谱)特异性增强的效果。通过环丙氨嗪的浓度和拉曼强度的关系，即拉曼强度的值与一定范围内环丙氨嗪的浓度呈线性关系，通过分析拉曼强度的变化，即可以实现牛奶中环丙氨嗪的检测。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
1)本发明提供了一种基于表面增强拉曼光谱的核酸适配体传感器检测牛奶中环丙氨嗪的方法，当检测体系中不存在环丙氨嗪时，其原位还原的纳米银的拉曼强度较小；当体系中加入环丙氨嗪后，环丙氨嗪和核酸适配体上的胸腺嘧啶结合，再进行原位还原纳米银，其相应拉曼强度会增强，即可通过测定拉曼强度来实现牛奶中环丙氨嗪的定量检测；
2)本发明进一步优化了核酸适配体的最佳反应浓度、最佳反应pH以及最佳反应时间等工艺条件，检测方法灵敏度高，选择性好，最低检测限为15.5ppb，操作简便，前处理简单，不需要大型仪器，成本低，可用于牛奶中环丙氨嗪的检测；
3)本发明利用环丙氨嗪特异性核酸适配体控制合成具有拉曼效应的纳米银来进行环丙氨嗪检测，核酸适配体既可以与环丙氨嗪进行特异性结合，又可以控制合成具有拉曼效应的纳米银。
附图说明
图1为本发明中基于核酸适配体检测牛奶中环丙氨嗪的原理示意图；
图2为本发明检测方法中核酸适配体浓度与拉曼强度的关系图；
图3为本发明检测方法中pH值与拉曼强度的关系图；
图4为本发明检测方法中反应时间与拉曼强度的关系图；
图5为本发明检测方法中环丙氨嗪浓度与拉曼强度的关系图(即标准曲线)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
如图1所示，基于表面增强拉曼光谱的核酸适配体传感器快速检测牛奶中环丙氨嗪的方法如下：
1)制备检测试剂：用蒸馏水配置浓度为2000nmol/L的ssDNA核酸适配体溶液，核酸适配体序列为5’-CCCGGTTGGTTGGTTGGTTTTCCC-3’；用蒸馏水配置浓度为0.1mmol/L的硝酸银溶液；用蒸馏水配置浓度为0.1mmol/L的硼氢化钠溶液。
2)牛奶样品的预处理：在10mL的离心管中，添加3mL 1wt％三氯乙酸溶液和3mL的牛奶样品，静置10分钟。然后10000r/min下离心10分钟，取上清液，并用2.0mol/L NaOH调节pH＝5。
3)绘制不同浓度的环丙氨嗪标准液与对应的拉曼强度的标准曲线：取11支包含不同浓度环丙氨嗪标准液的离心管，分别加入检测试剂，使得整个检测体系中环丙氨嗪含量维持在0-0.5ppm，在25℃反应10min；分别取各个离心管中的溶液置于硅片上，设置激发波长为532nm后用拉曼光谱仪测定其相应的拉曼强度，之后以不同浓度的环丙氨嗪与对应的拉曼强度作图，绘制标准曲线，如图5所示。
4)检测牛奶样品中环丙氨嗪：在牛奶样品中加入检测试剂，并在25℃反应10min，测定其拉曼强度；根据牛奶样品所得拉曼强度，查标准曲线，即可求得样品中环丙氨嗪含量。
经过多次验证，用本方法测定含环丙氨嗪浓度分别为0.1ppm、0.25ppm、0.5ppm的牛奶样品，得到的回收率为90～120％，证明了本方法的可靠性。本方法测定牛奶中环丙氨嗪的最低检测限为15.5ppb。
实施例2：
对实施例1中的检测工艺进一步优化，分别对核酸适配体浓度0-200nmol/L、pH值4-11、反应时间0-30min条件下0.5ppm环丙氨嗪溶液的拉曼强度进行测定，结果分别见图2、图3、图4所示。可以看出，核酸适配体的最佳浓度为70nmol/L以上，最佳反应pH为4.5-6，最佳反应时间为7-15min。
实施例3：
一种基于核酸适配体检测牛奶中环丙氨嗪的方法，牛奶样品中的环丙氨嗪含量为0-0.5ppm。该方法包括以下步骤：
1)制备包括核酸适配体的检测试剂：包括浓度为70nmol/L的核酸适配体溶液、浓度为0.12mmol/L的硝酸银溶液及浓度为0.08mmol/L的硼氢化钠溶液；核酸适配体溶液中，核酸适配体序列为5’-CCCGGTTGGTTGGTTGGTTTTCCC-3’。
对牛奶样品进行预处理：向牛奶样品中加入三氯乙酸，静置后离心，取上清液，并调节上清液的pH值为4.5。
2)绘制不同浓度的环丙氨嗪标准液与对应的拉曼强度的标准曲线：
2-1)将不同浓度的环丙氨嗪标准液分别加入至多个容器中；
2-2)分别向步骤2-1)中的多个容器中加入核酸适配体溶液，并在25℃下孵育25min；
2-3)分别向步骤2-2)中的多个容器中加入硝酸银溶液，并在-5℃下孵育8min；
2-4)分别向步骤2-3)中的多个容器中加入硼氢化钠溶液，并在20℃下反应15min；
2-5)测定步骤2-4)中的多个容器中溶液的拉曼强度：取容器中的溶液置于硅片上，利用激发波长为535nm的拉曼光谱仪测定硅片上溶液的拉曼强度。之后绘制出不同浓度的环丙氨嗪标准液与对应的拉曼强度的标准曲线。
3)将检测试剂加入至预处理后的牛奶样品中：
3-1)向预处理后的牛奶样品中加入核酸适配体溶液，并在25℃下孵育25min，得到混合液A；
3-2)向步骤3-1)中的混合液A中加入硝酸银溶液，并在-5℃下孵育8min，得到混合液B；
3-3)向步骤3-2)中的混合液B中加入硼氢化钠溶液，并在20℃下反应15min。
反应后测定拉曼强度，并利用标准曲线得到牛奶样品中环丙氨嗪的含量数据。
实施例4：
一种基于核酸适配体检测牛奶中环丙氨嗪的方法，牛奶样品中的环丙氨嗪含量为0-0.5ppm。该方法包括以下步骤：
1)制备包括核酸适配体的检测试剂：包括浓度为150nmol/L的核酸适配体溶液、浓度为0.08mmol/L的硝酸银溶液及浓度为0.12mmol/L的硼氢化钠溶液；核酸适配体溶液中，核酸适配体序列为5’-CCCGGTTGGTTGGTTGGTTTTCCC-3’。
对牛奶样品进行预处理：向牛奶样品中加入三氯乙酸，静置后离心，取上清液，并调节上清液的pH值为4.5。
2)绘制不同浓度的环丙氨嗪标准液与对应的拉曼强度的标准曲线：
2-1)将不同浓度的环丙氨嗪标准液分别加入至多个容器中；
2-2)分别向步骤2-1)中的多个容器中加入核酸适配体溶液，并在35℃下孵育15min；
2-3)分别向步骤2-2)中的多个容器中加入硝酸银溶液，并在5℃下孵育3min；
2-4)分别向步骤2-3)中的多个容器中加入硼氢化钠溶液，并在30℃下反应7min；
2-5)测定步骤2-4)中的多个容器中溶液的拉曼强度：取容器中的溶液置于硅片上，利用激发波长为535nm的拉曼光谱仪测定硅片上溶液的拉曼强度。之后绘制出不同浓度的环丙氨嗪标准液与对应的拉曼强度的标准曲线。
3)将检测试剂加入至预处理后的牛奶样品中：
3-1)向预处理后的牛奶样品中加入核酸适配体溶液，并在35℃下孵育15min，得到混合液A；
3-2)向步骤3-1)中的混合液A中加入硝酸银溶液，并在5℃下孵育3min，得到混合液B；
3-3)向步骤3-2)中的混合液B中加入硼氢化钠溶液，并在30℃下反应7min。
反应后测定拉曼强度，并利用标准曲线得到牛奶样品中环丙氨嗪的含量数据。
实施例5：
一种基于核酸适配体检测牛奶中环丙氨嗪的方法，牛奶样品中的环丙氨嗪含量为0-0.5ppm。该方法包括以下步骤：
1)制备包括核酸适配体的检测试剂：包括浓度为100nmol/L的核酸适配体溶液、浓度为0.1mmol/L的硝酸银溶液及浓度为0.1mmol/L的硼氢化钠溶液；核酸适配体溶液中，核酸适配体序列为5’-CCCGGTTGGTTGGTTGGTTTTCCC-3’。
对牛奶样品进行预处理：向牛奶样品中加入三氯乙酸，静置后离心，取上清液，并调节上清液的pH值为5。
2)绘制不同浓度的环丙氨嗪标准液与对应的拉曼强度的标准曲线：
2-1)将不同浓度的环丙氨嗪标准液分别加入至多个容器中；
2-2)分别向步骤2-1)中的多个容器中加入核酸适配体溶液，并在30℃下孵育20min；
2-3)分别向步骤2-2)中的多个容器中加入硝酸银溶液，并在0℃下孵育5min；
2-4)分别向步骤2-3)中的多个容器中加入硼氢化钠溶液，并在25℃下反应10min；
2-5)测定步骤2-4)中的多个容器中溶液的拉曼强度：取容器中的溶液置于硅片上，利用激发波长为532nm的拉曼光谱仪测定硅片上溶液的拉曼强度。之后绘制出不同浓度的环丙氨嗪标准液与对应的拉曼强度的标准曲线。
3)将检测试剂加入至预处理后的牛奶样品中：
3-1)向预处理后的牛奶样品中加入核酸适配体溶液，并在30℃下孵育20min，得到混合液A；
3-2)向步骤3-1)中的混合液A中加入硝酸银溶液，并在0℃下孵育5min，得到混合液B；
3-3)向步骤3-2)中的混合液B中加入硼氢化钠溶液，并在25℃下反应10min。
反应后测定拉曼强度，并利用标准曲线得到牛奶样品中环丙氨嗪的含量数据。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于核酸适配体检测牛奶中环丙氨嗪的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)制备包括核酸适配体的检测试剂，并对牛奶样品进行预处理；
2)绘制不同浓度的环丙氨嗪标准液与对应的拉曼强度的标准曲线；
3)将检测试剂加入至预处理后的牛奶样品中，反应后测定拉曼强度，并利用标准曲线得到牛奶样品中环丙氨嗪的含量数据。
2.根据权利要求1所述的一种基于核酸适配体检测牛奶中环丙氨嗪的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的检测试剂包括核酸适配体溶液、硝酸银溶液及硼氢化钠溶液。
3.根据权利要求2所述的一种基于核酸适配体检测牛奶中环丙氨嗪的方法，其特征在于，所述的核酸适配体溶液中，核酸适配体序列为5’-CCCGGTTGGTTGGTTGGTTTTCCC-3’。
4.根据权利要求2所述的一种基于核酸适配体检测牛奶中环丙氨嗪的方法，其特征在于，所述的核酸适配体溶液的浓度为70-2000nmol/L，所述的硝酸银溶液的浓度为0.08-0.12mmol/L，所述的硼氢化钠溶液的浓度为0.08-0.12mmol/L。
5.根据权利要求2所述的一种基于核酸适配体检测牛奶中环丙氨嗪的方法，其特征在于，所述的预处理过程为：向牛奶样品中加入三氯乙酸，静置后离心，取上清液，并调节上清液的pH值为4.5-6。
6.根据权利要求2所述的一种基于核酸适配体检测牛奶中环丙氨嗪的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的标准曲线的绘制过程为：
2-1)将不同浓度的环丙氨嗪标准液分别加入至多个容器中；
2-2)分别向步骤2-1)中的多个容器中加入核酸适配体溶液，并在25-35℃下孵育15-25min；
2-3)分别向步骤2-2)中的多个容器中加入硝酸银溶液，并在-5℃至5℃下孵育3-8min；
2-4)分别向步骤2-3)中的多个容器中加入硼氢化钠溶液，并在20-30℃下反应7-15min；
2-5)测定步骤2-4)中的多个容器中溶液的拉曼强度，绘制出不同浓度的环丙氨嗪标准液与对应的拉曼强度的标准曲线。
7.根据权利要求6所述的一种基于核酸适配体检测牛奶中环丙氨嗪的方法，其特征在于，步骤2-5)中，所述的拉曼强度的测定方法为：取容器中的溶液置于硅片上，利用拉曼光谱仪测定硅片上溶液的拉曼强度。
8.根据权利要求7所述的一种基于核酸适配体检测牛奶中环丙氨嗪的方法，其特征在于，所述的拉曼光谱仪的激发波长为530-535nm。
9.根据权利要求2所述的一种基于核酸适配体检测牛奶中环丙氨嗪的方法，其特征在于，步骤3)中，将检测试剂加入至预处理后的牛奶样品中的过程为：
3-1)向预处理后的牛奶样品中加入核酸适配体溶液，并在25-35℃下孵育15-25min，得到混合液A；
3-2)向步骤3-1)中的混合液A中加入硝酸银溶液，并在-5℃至5℃下孵育3-8min，得到混合液B；
3-3)向步骤3-2)中的混合液B中加入硼氢化钠溶液，并在20-30℃下反应7-15min。
10.根据权利要求1所述的一种基于核酸适配体检测牛奶中环丙氨嗪的方法，其特征在于，步骤3)中，所述的牛奶样品中的环丙氨嗪含量为0-0.5ppm。
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|---|---|
| CN110567936B (zh) | 2021-07-20 |
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