CN104535566A - 一种检测灭蝇胺的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测灭蝇胺的方法。包括:制备polyT10纳米金溶液;加入不同浓度的灭蝇胺溶液,反应,加入氯化钠溶液,反应,得到标准溶液,测定标准溶液在520nm处的吸光度值,以吸光度值为纵坐标,灭蝇胺浓度对数为横坐标,绘制灭蝇胺含量测定的标准曲线;测定待测溶液在520nm处的吸光度值,根据标准曲线,得到待测样品中灭蝇胺的含量。本发明提供了一种果蔬产品中灭蝇胺残留的快速简单灵敏的测定方法,无需色谱-质谱等复杂仪器,操作简单,既可以肉眼观察颜色变化,也可以通过测定吸光度进行精确定量。本方法检测时间短,无需有毒提取试剂,所用纳米金及适配体成本低,可用于现场快速大量样品的初筛检查。
Description
技术领域
本发明属于农药残留快速检测技术领域,具体涉及一种检测灭蝇胺的方法。
背景技术
灭蝇胺是一种三嗪类农药,作为杀虫剂被广泛用于动物养殖及果蔬种植生产过程中,但其在动物体内及果蔬上的残留可以引起人类肿瘤的发生,其一部分可通过代谢降解为三聚氰胺,成为具有肾毒性的化合物,因此近年来各国相继制定了灭蝇胺的残留限量标准,如我国规定灭蝇胺的残留限量标准为0.5-1μg/g。但是目前灭蝇胺的检测方法都是基于色谱质谱的仪器分析方法,具有检测周期长、操作复杂、需要专业人员等缺点,不利于大批量样品的快速抽查和现场快速检测,因此急需开发一种简单灵敏的灭蝇胺快速检测方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何开发一种简单灵敏的快速检测灭蝇胺的方法。
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种基于polyT的灭蝇胺快速检测方法。
本发明所提供的基于polyT的灭蝇胺快速检测方法,包括下述:
1)polyT10纳米金溶液的制备
将polyT10溶液与纳米金溶液混合后进行反应得到polyT10纳米金溶液;所述polyT10代表由10个脱氧胸苷酸组成的寡核苷酸;所述polyT10的核苷酸序列如序列表中序列1所示;
2)标准曲线的制备
将所述polyT10纳米金溶液分别与不同浓度的灭蝇胺溶液混合后进行反应,得到多个灭蝇胺浓度不同的polyT10纳米金-灭蝇胺体系,将所述多个灭蝇胺浓度不同的polyT10纳米金-灭蝇胺体系分别与氯化钠溶液混合后进行反应,得到多个polyT10纳米金-灭蝇胺-氯化钠体系,即为多个标准溶液,所述多个polyT10纳米金-灭蝇胺-氯化钠体系中的每一个polyT10纳米金-灭蝇胺-氯化钠体系中的氯化钠含量相等,且所述氯化钠的含量能够诱导与1)中和polyT10结合的纳米金等量的纳米金发生团聚;分别测定所述多个标准溶液中的每一个标准溶液在520nm处的吸光度值,以所述吸光度值为纵坐标,灭蝇胺浓度对数为横坐标,绘制灭蝇胺含量测定的标准曲线;
3)待测样品中灭蝇胺含量的测定
将所述polyT纳米金溶液与待测样品溶液混合后反应,得到polyT10纳米金-待测样品体系,所述polyT10纳米金-待测样品体系中,polyT10纳米金的含量与2)中所述多个polyT10纳米金-灭蝇胺体系中的每一个polyT10纳米金-灭蝇胺体系中的polyT10纳米金含量相同;将所述polyT10纳米金-待测样品体系与氯化钠溶液混合后进行反应,得到polyT10纳米金-待测样品-氯化钠体系,即为待测溶液,所述polyT10纳米金-待测样品-氯化钠体系中,所述氯化钠的含量与2)中所述多个polyT10纳米金-灭蝇胺-氯化钠体系中的每一个polyT10纳米金-灭蝇胺-氯化钠体系中的氯化钠的含量相同;测定所述待测溶液在520nm处的吸光度值,根据所述标准曲线,得到所述待测样品中灭蝇胺的含量。
所述1)中,所述纳米金溶液是将100mL的摩尔浓度为1mM的HAuCl4溶液与100mL摩尔浓度为38.8mM的柠檬酸三钠溶液反应得到的。
所述纳米金溶液中,纳米金的直径为13nm。
所述1)中,所述polyT10与所述纳米金溶液的配比为1.25×10-10mol:50μL。
所述1)中,所述polyT10纳米金溶液是polyT10溶液与纳米金溶液混合后反应得到的溶液。
所述1)中,所述polyT10纳米金溶液中,polyT10的量为使得polyT10纳米金-氯化钠体系中的纳米金不团聚;所述polyT10纳米金-氯化钠体系是向polyT10纳米金溶液中加入氯化钠得到的混合溶液,所述混合溶液中氯化钠的含量与2)中所述多个polyT10纳米金-灭蝇胺-氯化钠体系中的每一个polyT10纳米金-灭蝇胺-氯化钠体系中的氯化钠的含量相同。
所述团聚表现为纳米金溶液由红色变为蓝色。
所述2)中,所述多个可为2个以上,如10个。
所述2)中,所述polyT10纳米金-灭蝇胺-氯化钠体系中,所述polyT10与氯化钠的摩尔比为1.25×10-10mol:9×10-6mol。
所述3)中,所述待测样品为水果和/或蔬菜(如黄瓜)提取液。
具体地,本发明所提供的基于polyT的灭蝇胺快速检测方法,包括下述:
1)polyT10纳米金溶液的制备
将100mL浓度为1mM的HAuCl4溶液与10mL浓度为38.8mM的柠檬酸三钠溶液反应20分钟,得到纳米金溶液;将50μL 2.5μM polyT10加入到50μL所述纳米金溶液中,反应5分钟后,得到polyT10纳米金溶液;
2)标准曲线的制备
向多个50μL的所述polyT10纳米金溶液中的每一个中分别加入50μL不同浓度的灭蝇胺溶液,反应5分钟后,加入10μL 0.9M的NaCl,再反应5分钟,然后观察纳米金溶液颜色变化,同时测定520nm的吸光度值,以520nm的吸光度值为纵坐标,灭蝇胺浓度对数为横坐标,绘制灭蝇胺含量测定的标准曲线;
3)待测样品中灭蝇胺含量的测定
向50μL所述polyT纳米金溶液中加入50μL待测样品溶液,得到polyT10纳米金-待测样品体系,反应5分钟后,加入10μL 0.9M的NaCl,再反应5分钟,然后观察纳米金溶液颜色变化,同时测定520nm的吸光度值,根据所述标准曲线,得到所述待测样品中灭蝇胺的含量。
本发明设计了一段含有10个胸腺嘧啶核苷的寡核苷酸(polyT10),polyT10可以通过与纳米金的配位结合吸附到纳米金上,并保护纳米金在加入高浓度盐溶液的情况下不团聚,纳米金溶液仍然保持红色。当向其中加入含有灭蝇胺的样品时,polyT10优先和灭蝇胺结合,从纳米金上解离,这个时候再加入高浓度的盐溶液就会导致纳米金颗粒发生团聚,纳米金溶液颜色从红色变为蓝色,程度随着灭蝇胺浓度增高而加深。
本发明提供了一种果蔬产品中灭蝇胺残留的快速简单灵敏的测定方法,该方法无需色谱-质谱等复杂仪器,操作简单,只需简单匀浆过滤加样步骤即可检测,而且既可以肉眼观察颜色变化,也可以通过测定吸光度进行精确定量。本方法检测时间短,整个过程可在30分钟内完成,并且无需有机等有毒提取试剂,所用纳米金及适配体成本低,因此本方法可以用于现场快速大量样品的初筛检查。
附图说明
图1A为灭蝇胺通过氢键与胸腺嘧啶形成的稳定结合的示意图。
图1B为本发明基于polyT的灭蝇胺快速检测方法的原理图。
图2A为纳米金溶液的颜色随着NaCl浓度的变化图。
图2B为纳米金溶液520nm吸光度值随着NaCl浓度的变化图。
图3A为特定NaCl含量下纳米金溶液的颜色随着polyT10浓度的变化图。
图3B为特定NaCl含量下纳米金溶液520nm吸光度值随着polyT10浓度的变化图。
图4A为特定NaCl含量特定polyT10含量下纳米金溶液的颜色随着灭蝇胺浓度的变化图。
图4B为特定NaCl含量特定polyT10含量下纳米金溶液520nm吸光度值随着灭蝇胺浓度的变化图。
图4C为以520nm的吸光度值为纵坐标,灭蝇胺浓度对数为横坐标绘制的标准曲线。
图5为黄瓜提取液稀释倍数对纳米金体系的吸光度的影响。
图6为本发明方法的特异性验证。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明,但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法;下述实施例中所用的试剂、生物材料等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例中溶液的溶剂均为水。
本发明中灭蝇胺可以通过氢键与脱氧胸苷酸形成如附图1A所示的稳定结合。
本发明的基于polyT的灭蝇胺快速检测方法的原理如图1B所示。
下述实施例所用的纳米金溶液通过下述步骤制备:加热煮沸100mL浓度为1mM的HAuCl4溶液,剧烈搅拌下加入10mL浓度为38.8mM的柠檬酸三钠溶液,继续煮沸20分钟,然后室温冷却,得到纳米金溶液(其中纳米金的直径为13nm)。
下述实施例中所使用的polyT10的核苷酸序列如序列表中序列1所示,且所述polyT10为上海生工公司的产品。
实施例1、检测体系中NaCl浓度的优化
为了获取最佳实验效果,对检测体系中的NaCl浓度进行优化。将10μL不同浓度(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4和1.5M)的NaCl溶液加入到150μL体系中(所述体系由50μL所述纳米金溶液和100μL水组成),观察纳米金颜色变化,并测定520nm的吸光度值。
图2A为纳米金溶液的颜色随着NaCl浓度的变化图。
图2B为纳米金溶液520nm吸光度值随着NaCl浓度的变化图。
从图2可以看出,随着加入的NaCl浓度增加,纳米金溶液的颜色逐渐变蓝,从520nm吸光度值看,当加入的NaCl浓度为0.9M时,可以几乎团聚所有的纳米金,因此选定0.9M的NaCl作为后面实验的盐浓度。
实施例2、检测体系中polyT10浓度的优化
将不同浓度的polyT10溶液(1,1.5,2,2.5,3,3.5,4,4.5和5μM)与50μL所述纳米金溶液共同孵育5分钟,然后加入50μL纯水和10μL 0.9M NaCl,然后观察溶液颜色变化并测定520nm吸光度值。
图3A为特定NaCl含量下纳米金溶液的颜色随着polyT10浓度的变化图。
图3B为特定NaCl含量下纳米金溶液520nm吸光度值随着polyT10浓度的变化图。
如图3所示,加入的polyT10溶液中,polyT10的浓度最低为2.5μM即可以保护0.9M NaCl诱导的纳米金团聚和溶液颜色变蓝,因此选定2.5μM polyT10作为后续检测体系中的加入的polyT10溶液的浓度。
实施例3、检测方法的灵敏度与线性范围
先将50μL 2.5μM polyT10加入到50μL纳米金溶液中,反应5分钟后,得到polyT10纳米金溶液;再将50μL不同浓度(0、1、2、5、10、20、50、100、300、500ng/mL)的灭蝇胺加入其中,再反应5分钟后,得到多个灭蝇胺浓度不同的polyT10纳米金-灭蝇胺体系,加入10μL 0.9M的NaCl,再反应5分钟,得到多个标准溶液,然后观察标准溶液颜色变化,同时测定520nm的吸光度值。
图4A为特定NaCl含量特定polyT10含量下纳米金溶液的颜色随着灭蝇胺浓度的变化图。
图4B为特定NaCl含量特定polyT10含量下纳米金溶液520nm吸光度值随着灭蝇胺浓度的变化图。
如图4A和4B所示,随着灭蝇胺浓度增高,纳米金溶液颜色逐渐变蓝,其在520nm处的吸光度值逐渐降低。
以520nm的吸光度值为纵坐标,灭蝇胺浓度对数为横坐标,进行检测方法灵敏度与线性范围分析。
图4C为以520nm的吸光度值为纵坐标,灭蝇胺浓度对数为横坐标绘制的标准曲线。
从图4C可看出,该方法可检测1-500ng/ml的灭蝇胺,灵敏度达到1ng/ml(520吸光度测定)或5ng/ml(肉眼观察纳米金溶液颜色变化),其在1-500ng/ml和1-50ng/ml的范围内相关性系数分别为0.9556和0.9789,具有良好的线性关系。其1-50ng/ml的线性方程y=-0.053x+0.5735(R2=0.9789)被用作后面黄瓜样品中灭蝇胺含量测定的标准曲线,其中,y代表520nm的吸光度值,x代表灭蝇胺浓度对数。
实施例4、黄瓜样品基质的影响
为了检测本方法在果蔬等农产品中灭蝇胺检测中的实用性,选择黄瓜作为实际样品分析其基质对本方法的影响。取新鲜黄瓜,切小块然后放入果汁机或匀浆器打汁,然后用0.22μm滤膜过滤即得黄瓜提取液,分别稀释10、50、100、200倍观察其对检测体系520nm吸光度的影响。
图5为黄瓜提取液稀释倍数对纳米金体系的吸光度的影响。
如图5所示,低稀释倍数的黄瓜提取液对纳米金体系的吸光度有一定的增加,稀释200倍时对纳米金体系的吸光度几乎无影响,因此选用200倍稀释进行黄瓜实际样品检测。
实施例5、特异性实验
为了检测方法的特异性,分别向黄瓜提取液中和水中加入甲醇、氯氰菊酯、氰戊菊酯、乐果、甲基对硫磷和甲胺磷,浓度分别为300ng/ml,加入检测体系进行检测,结果如图6所示,除氯氰菊酯、氰戊菊酯和甲基对硫磷有轻微交叉外,其他农药均无反应,体现了较好的特异性。
实施例6、黄瓜中灭蝇胺检测实验
选择无农药使用种植的黄瓜样品,匀浆过滤稀释200倍后用本方法分别测定6份样品,最终测定黄瓜样品中的灭蝇胺含量平均值为84ng/g,标准差为56ng/g,因此将本方法的检测限定义为阴性样品的平均值+3倍的标准差即为84+3×56=252ng/g。将不同的浓度的灭蝇胺加入到黄瓜匀浆液中,过滤稀释200倍后检测,计算本方法的定量限及回收率。如表1所示,添加浓度从500ng/g到10000ng/g,回收率位于83.7-104.8之间,变异系数低于7%,说明本方法具有很好的准确性和精密度,而且500ng/g的添加浓度能够稳定的检出,因此定义本方法的定量限为500ng/g。
表1.polyT10-纳米金法测定黄瓜中灭蝇胺的准确度与精密度(n=3)
Claims (6)
1.一种灭蝇胺检测方法,包括下述:
1)polyT10纳米金溶液的制备
将polyT10溶液与纳米金溶液混合后进行反应得到polyT10纳米金溶液;所述polyT10代表由10个脱氧胸苷酸组成的寡核苷酸;所述polyT10的核苷酸序列如序列表中序列1所示;
2)标准曲线的制备
将所述polyT10纳米金溶液分别与不同浓度的灭蝇胺溶液混合后进行反应,得到多个灭蝇胺浓度不同的polyT10纳米金-灭蝇胺体系,将所述多个灭蝇胺浓度不同的polyT10纳米金-灭蝇胺体系分别与氯化钠溶液混合后进行反应,得到多个polyT10纳米金-灭蝇胺-氯化钠体系,即为多个标准溶液,所述多个polyT10纳米金-灭蝇胺-氯化钠体系中的每一个polyT10纳米金-灭蝇胺-氯化钠体系中的氯化钠含量相等,且所述氯化钠的含量能够诱导与1)中和polyT10结合的纳米金等量的纳米金发生团聚;分别测定所述多个标准溶液中的每一个标准溶液在520nm处的吸光度值,以所述吸光度值为纵坐标,灭蝇胺浓度对数为横坐标,绘制灭蝇胺含量测定的标准曲线;
3)待测样品中灭蝇胺含量的测定
将所述polyT纳米金溶液与待测样品溶液混合后反应,得到polyT10纳米金-待测样品体系,所述polyT10纳米金-待测样品体系中,polyT10纳米金的含量与2)中所述多个polyT10纳米金-灭蝇胺体系中的每一个polyT10纳米金-灭蝇胺体系中的polyT10纳米金含量相同;将所述polyT10纳米金-待测样品体系与氯化钠溶液混合后进行反应,得到polyT10纳米金-待测样品-氯化钠体系,即为待测溶液,所述polyT10纳米金-待测样品-氯化钠体系中,所述氯化钠的含量与2)中所述多个polyT10纳米金-灭蝇胺-氯化钠体系中的每一个polyT10纳米金-灭蝇胺-氯化钠体系中的氯化钠的含量相同;测定所述待测溶液在520nm处的吸光度值,根据所述标准曲线,得到所述待测样品中灭蝇胺的含量。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述1)中,所述纳米金溶液是将100mL的摩尔浓度为1mM的HAuCl4溶液与100mL摩尔浓度为38.8mM的柠檬酸三钠溶液反应得到的;
所述纳米金溶液中,纳米金的直径为13nm。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述1)中,所述polyT10与所述纳米金溶液的配比为1.25×10-10mol:50μL。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其特征在于:所述1)中,所述polyT10纳米金溶液中,polyT10的量为使得polyT10纳米金-氯化钠体系中的纳米金不团聚;所述polyT10纳米金-氯化钠体系是向polyT10纳米金溶液中加入氯化钠得到的混合溶液,所述混合溶液中氯化钠的含量与2)中所述多个polyT10纳米金-灭蝇胺-氯化钠体系中的每一个polyT10纳米金-灭蝇胺-氯化钠体系中的氯化钠的含量相同。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其特征在于:所述2)中,所述polyT10纳米金-灭蝇胺-氯化钠体系中,所述polyT10与氯化钠的摩尔比为1.25×10-10mol:9×10-6mol。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法,其特征在于:所述待测样品为水果和/或蔬菜提取液。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150422 |