CN102586399A - 检测农药的方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用胆碱酯酶检测农药的方法和装置。具体地，本发明涉及一种基于固定有乙酰胆碱酯酶的磁性纳米粒子的新型农药检测方法，其中所述磁性纳米粒子充当载体以收集溶液中的乙酰胆碱酯酶。本发明还涉及采用上述方法的用于农药检测的便携式笔形探测器。

Description

检测农药的方法和装置

技术领域

本发明涉及使用胆碱酯酶检测农药的方法和装置。具体地，本发明涉及一种基于固定有胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE)的磁性纳米粒子的新型农药检测方法，其中所述磁性纳米粒子充当载体以收集溶液中的胆碱酯酶。本发明还涉及采用上述方法的用于农药检测的便携式探测器。

背景技术

根据数据统计，全球每年消耗约250万吨农药，其中大多数被施用于农作物。然而，超过95％的农药在雨水和阳光的照射下，最终进入水、土壤和空气中，造成了严重的环境污染。另一方面，农作物上残存的农药也会引发严重的食物中毒事件。世界卫生组织(WHO)估计全球每年会发生100万农药中毒案例，并有2万人死亡。因此，开发一种便携式家用农药传感器是迫切且重要的。

有机氯、有机磷和氨基甲酸酯在20世纪60年代是三种主要的农药。后续研究发现大多数有机氯是持久性的有机污染物，当它们释放到环境中时会造成潜在危险。例如，DDT在20世纪中期曾被广泛用于控制害虫，但研究发现它会在食物链中累积，并造成鸟类的不孕，引发生态灾难，目前已在大多数国家中被禁止使用。目前有机磷和氨基甲酸酯已大量取代了有机氯，这两种农药占据农药市场的70％。有机磷和氨基甲酸酯均通过抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性因而导致过量的乙酰胆碱(ACh，乙酰胆碱酯酶的底物)在突触间隙积累来起作用。过量的乙酰胆碱可引起遍及整个个体的神经肌肉麻痹(长时间的肌肉收缩)，导致因窒息而死亡。基于有机磷和氨基甲酸酯对乙酰胆碱酯酶活性的抑制效果，已经开发了一些农药传感器。基本上，它们的检测方法可分为以下两种方式：一种是通过添加称为埃尔曼试剂(Ellman’s reagent)的5，5′-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(5，5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB)经由分光光度计检测。DTNB与硫代胆碱(thiocholine，TCh)反应以得到TNB，所述硫代胆碱是乙酰硫代胆碱(ATCh，ACh被ATCh代替以得到二硫键)的水解产物，TNB即5-硫代-2-硝基苯甲酸，是一种在412nm具有最大吸收的黄色产物，如图1所示。另外的检测方法包括pH值测量法和电化学法等，如图20所示。

与需要专业人员并仅用于分析化学实验室传统方法(色谱方法和偶联的色谱-光谱方法：GC-MS，HPLC-MS)相比，乙酰胆碱酯酶检测系统通过简化或去除样品制备规程、使现场测试更方便快捷以及显著降低每次分析的成本而具有补充或者替代传统方法的潜力。然而，可靠性差和乙酰胆碱酯酶检测系统的短暂寿命仍限制了它的广泛应用。可靠性可通过增加信噪比(S/N)来增强，而由乙酰胆碱酯酶和农药之间的不可逆或部分可逆的抑制反应所致的乙酰胆碱酯酶短暂寿命可通过用新鲜的乙酰胆碱酯酶替代来容易地克服。增加信噪比的传统方式是通过将乙酰胆碱酯酶固定于具有高效电子转移的电极表面来进行的。已采用了多种基质材料，如普鲁士蓝、钴酞菁(CoPc)、聚(酰胺-胺)(PAMAM)、聚苯胺、金纳米粒子(AuNPs)、多壁碳纳米管(MWNTs)、Al₂O₃、SiO₂、ZnO等等。甲基对氧磷的低检测限在基于固定于AuNPs和丝纤蛋白修饰的Pt电极上的乙酰胆碱酯酶的电流分析生物传感器中已降至6×10^-11M。在实际应用中，此电流分析传感器的局限性是其在农药检测中的短暂寿命。虽然被抑制的乙酰胆碱酯酶可通过肟(如碘解磷定(prolidoxime iodide))部分地复活以保留乙酰胆碱酯酶的活性，但是电极上的乙酰胆碱酯酶固定层仍然需要频繁地替换，以保证测量的可靠性，而固定层的更换需要小心的操作，否则乙酰胆碱酯酶层会失去与电极的接触，从而影响到测量。

为了避免乙酰胆碱酯酶活性复活(耗时)以及乙酰胆碱酯酶层的替换(费力)，在本发明中，发明了一种基于固定有乙酰胆碱酯酶的水溶性磁性纳米粒子的新型农药检测方法。在此体系中，乙酰胆碱酯酶仍是信号源，而磁性纳米粒子充当乙酰胆碱酯酶载体以通过使用磁场收集乙酰胆碱酯酶来增加信噪比。当磁性纳米粒子大小小于20nm时，其表现出超顺磁性，这意指如果去除磁场，这些水溶性磁性纳米粒子可用水洗去。通过这种方式，抑制的乙酰胆碱酯酶在检测后可被容易地替换掉，由于每次都采用新的乙酰胆碱酯酶，不需要对其活性进行复活，也就避免了寿命短的缺点。

发明内容

本发明涉及使用固定有乙酰胆碱酯酶的磁性纳米粒子检测农药的方法和装置，具体地本发明涉及如下各项：

1.一种检测农药的方法，包括如下步骤：

(a)提供待测样品；

(b)制备磁性纳米粒子，使胆碱酯酶与所述磁性纳米粒子接触，从而得到固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子；

(c)向步骤(a)的所述待测样品中加入步骤(b)中得到的固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子，并温育；

(d)用磁场富集磁性纳米粒子；和

(e)去除磁场，将富集的磁性纳米粒子分散在酶活性检测体系中，检测所述胆碱酯酶的酶活性，并通过酶活性来确定待测样品中农药的存在或其含量。

2.项1的方法，其中所述农药为化学合成农药。

3.项1的方法，其中所述农药选自下组：有机磷类农药、氨基甲酸酯类农药、有机氮类农药、拟除虫菊酯类农药、有机氯类农药和有机氟类农药。

4.项3的方法，其中所述有机磷类农药选自下组：磷酸酯、一硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸酯、磷酰胺、硫代磷酰胺、焦磷酸酯。

5.项3的方法，其中所述有机磷类农药选自：草甘膦、乐果和马拉氧磷。

6.项3的方法，其中所述氨基甲酸酯类农药选自下组：N-甲基氨基甲酸酯类和二甲基氨基甲酸酯。

7.项3的方法，其中所述氨基甲酸酯类农药选自西维因和异丙威。

8.项1-7中任一项的方法，其中所述磁性纳米粒子是通过选自下组的方法制备的：湿化学法、化学气相法和物理方法。

9.项8的方法，其中所述湿化学法选自沉淀法、溶胶-凝胶法、微乳液及反相微乳液法、水热法和多元醇还原法；所述化学气相法选自化学气相沉积法、化学气相凝聚法和等离子蒸发法；所述物理方法选自蒸发冷凝法和磁控溅射方法。

10.项1-9中任一项的方法，其中所述磁性纳米粒子是合金、铁氧体和金属间化合物的磁性纳米粒子。

11.项1-10中任一项的方法，其中所述磁性纳米粒子是含铁、钴、镍及其合金的磁性纳米粒子，优选为Fe₃O₄的纳米粒子。

12.项1-11中任一项的方法，其中所述磁性纳米粒子的表面含有极性基团，优选柠檬酸根或羟基。

13.项1-12中任一项的方法，其中所述胆碱酯酶选自下组：乙酰胆碱酯酶、丙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶。

14.项13的方法，其中所述乙酰胆碱酯酶从选自下组的来源获得：微生物、植物和动物，优选电鳗或电鳐。

15.项1-14中任一项的方法，其中在步骤(b)之前还包括校准磁性纳米粒子的步骤，优选通过标准曲线进行。

16.项1-15中任一项的方法，其中在步骤(b)之前还包括校准胆碱酯酶浓度的步骤，优选通过标准曲线进行。

17.项1-16中任一项的方法，其中在步骤(b)之前还包括洗涤磁性纳米粒子的步骤，优选用去离子水洗涤1-5次，更优选洗涤4次。

18.项1-17中任一项的方法，其中在步骤(b)中将胆碱酯酶固定在磁性纳米粒子上是通过选自下组的方法进行的：吸附法、化学交联法、共价键合法、物理包埋法、电化学聚合法和分子自组装。

19.项1-18中任一项的方法，其中在步骤(b)中将胆碱酯酶固定在磁性纳米粒子上是在pH 6-8，优选pH 7的条件下进行的。

20.项1-19中任一项的方法，其中在步骤(b)中将胆碱酯酶固定在磁性纳米粒子上的过程中，加入胆碱酯酶与磁性纳米粒子的比例为20U/g-330U/g，优选125U/g-300U/g，更优选280U/g。

21.项1-20中任一项的方法，其中在步骤(b)中将胆碱酯酶固定在磁性纳米粒子上是通过如下进行的：

(A)将磁性纳米粒子悬浮于去离子水或磷酸盐缓冲溶液中；

(B)将所述胆碱酯酶溶于含有牛血清白蛋白(BSA)的去离子水或磷酸盐缓冲溶液中；和

(C)将磁性纳米粒子溶液与胆碱酯酶溶液接触。

22.项1-21中任一项的方法，其中在步骤(b)中将胆碱酯酶固定在磁性纳米粒子上是通过如下进行的：

(a)将磁性纳米粒子悬浮于去离子水中；

(b)将所述胆碱酯酶溶于含有牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲溶液；和

(c)将磁性纳米粒子溶液与胆碱酯酶溶液接触。

23.项21-22中任一项的方法，其中磁性纳米粒子溶液的浓度为0.1-10g/L，优选0.5-5g/L，更优选1-3g/L，更优选约2g/L。

24.项21-22中任一项的方法，其中胆碱酯酶溶液的浓度为0.1-10U/ml，优选0.5-2U/ml，更优选1U/ml。

25.项21-22中任一项的方法，其中牛血清白蛋白在磷酸盐缓冲溶液中的浓度为0.1-5g/L，优选0.5-2g/L，更优选0.8-1.2g/L，更优选1g/L。

26.项1-25中任一项的方法，其中在步骤(c)中向所述待测样品中加入0.05-1ml，优选0.1-0.5ml，更优选0.25ml固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子溶液。

27.项1-26中任一项的方法，其中在步骤(c)中将待测样品与固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子在0-60℃，优选20-50℃，更优选40℃，温育2分钟-2小时，优选20分钟-1小时，更优选40分钟。

28.项1-27中任一项的方法，其中在步骤(d)中通过覆有外层的磁体富集磁性纳米粒子。

29.项28的方法，其中所述磁体的直径为约2-10mm，优选3-8mm，更优选4mm。

30.项1-29中任一项的方法，其中所述步骤(d)进行1-10分钟，优选1-5分钟，更优选100秒。

31.项1-30中任一项的方法，其中在步骤(d)中富集至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，更优选基本上100％的磁性纳米粒子。

32.项1-31中任一项的方法，其中在步骤(e)中所述酶活性检测体系具有2-11，优选6-10，更优选7-9的pH值。

33.项1-32中任一项的方法，其中在步骤(e)中检测所述胆碱酯酶的酶活性是通过pH测定法、电化学法或分光光度法检测的，优选是通过分光光度法检测的。

34.项33的方法，其中在步骤(e)中加入5，5′-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)和硫代胆碱(TCh)以通过分光光度法检测所述胆碱酯酶的酶活性。

35.项34的方法，其中通过分光光度法测定体系的吸光值变化速度，吸光值变化速度越快指示酶活性越高；反之，吸光值变化速度越慢指示酶活性越低。

36.项1-35中任一项的方法，其中在所述步骤(e)中测定的酶活性越高指示待测样品中农药的含量越低；反之，所述步骤(e)中测定的酶活性越低指示待测样品中农药的含量越高。

37.一种用于农药检测的便携式探测器，其包括：电源系统、储存系统、控制系统和测定分析系统。

38.项37的探测器，其中所述电源系统为电池(1)，其用于给探测器的其它各系统供电。

39.项37-38中任一项的探测器，其中所述储存系统包括DTNB容器(5)、硫代胆碱容器(6)、磁性纳米粒子溶液容器(13)以及用于富集和转移磁性纳米粒子的设置有磁体的磁体装置(14)。

40.项39的探测器，其中所述磁体装置(14)包括外套(14a)和内部磁体(14b)，其中所述内部磁体(14b)可从外套(14a)中移出。

41.项40的探测器，其中所述外套(14a)是用玻璃或聚四氟乙烯制成的。

42.项37-41中任一项的探测器，其中所述控制系统包括与DTNB容器(5)相连用于控制DTNB的加入的按钮(3)、与硫代胆碱容器(6)相连用于控制胆碱酯酶的加入的按钮(4)以及控制固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子溶液的释放的按钮(12)。

43.项37-42中任一项的探测器，其中所述测定分析系统包括提供光谱检测所需波长的发光二极管(8)；与所述发光二极管(8)相连控制该发光二极管的芯片(2)；经按钮(3)与DTNB容器(5)相连的、经按钮(4)与硫代胆碱容器(6)相连的、且可插入磁体装置(14)的比色池(9)；用于将所采集的光信号转换成电信号的光电转换装置(10)；显示检测结果的液晶屏(7)以及分别与光电转换装置(10)和液晶屏(7)相连的数据处理芯片(11)。

44.项37-43中任一项的探测器，所述探测器是笔形探测器。

45.使用项37-44中任一项的探测器检测农药的方法，其包括如下步骤：

(a)按下按钮(12)以使固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子的溶液接触待测样品；

(b)利用磁体装置(14)富集样品中的磁性纳米粒子，将磁体装置(14)插入微型比色池(9)后，移出磁体装置(14)的内部磁体(14b)；

(c)按下按钮(3)，将DTNB和磁体装置(14)的外套(14a)上的固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子加入比色池(9)；

(d)接通电源，待液晶屏上读数稳定后按下按钮(4)以将乙酰硫代胆碱加入比色池中；和

(e)通过测定分析系统根据比色池的颜色变化速度在液晶屏(7)上显示出样品中农药的浓度。

46.项45的方法，其中步骤(a)进行1-5分钟，优选3分钟。

47.项45的方法，其中步骤(b)中的富集进行10-60秒，优选30秒。

48.项37-44中任一项的探测器用于检测农药的用途。

附图简述

图1显示ATCh水解的化学方程式和TCh和DTNB之间的反应和TNB的UV-vis谱。

图2显示通过固定有乙酰胆碱酯酶的磁性纳米粒子的农药检测的示意性方法。

图3显示通过磁体的磁性纳米粒子的再-收集。

图4(a)显示在100℃沉淀的磁性纳米粒子XRD图样以及Fe3O4作为参比；图4(b)显示磁性纳米粒子粉末的TG曲线。

图5(a)显示磁性纳米粒子的UV-vis谱；图5(b)显示磁性纳米粒子浓度的标准曲线和在412nm的吸光度。

图6(a)显示在412nm扫描的反应的UV-vis谱；图6(b)显示乙酰胆碱酯酶浓度的标准曲线和在反应开始时的斜率。

图7(a)显示磁性纳米粒子的洗涤次数对于乙酰胆碱酯酶固定量的影响；图7(b)显示PBS缓冲液的pH值对于乙酰胆碱酯酶固定量的影响。

图8(a)显示在PBS(pH＝7.4)中加入的乙酰胆碱酯酶的体积对响应时间的影响；图8(b)显示添加125μl的乙酰胆碱酯酶(1U/ml)溶液的检测系统的pH值对乙酰胆碱酯酶活性的影响。

图9显示游离的和固定化的乙酰胆碱酯酶的稳定性分析。

图10显示DTNB的稳定性分析(在环境温度储存40h)。

图11显示乙酰胆碱酯酶对于以下不同农药的响应：乐果、草甘膦、西维因、异丙威和马拉氧磷。

图12显示固定有乙酰胆碱酯酶的磁性纳米粒子的西维因抑制曲线。

图13显示在一定量的磁性纳米粒子溶液中固定乙酰胆碱酯酶时，乙酰胆碱酯酶加入量与实际固定的酶量之间的关系(n＝3)。

图14显示固定的乙酰胆碱酯酶量与pH值的关系(n＝3)。

图15显示检测时的pH值对乙酰胆碱酯酶(游离态，未固定在磁性纳米粒子表面)活性的影响：图15(a)显示在不同pH值的412nm处吸光度的变化，其中紫外-可见光分光光谱曲线的斜率随pH值的变化反映了酶活性随pH值的变化；图15(b)显示pH值为2-11时的酶活性曲线(其中的酶活性为相对于具有最高酶活性的点(pH＝9)进行归一化后的结果)。

图16显示了固定时聚合物的添加与乙酰胆碱酯酶固定量的关系(n＝3)。

图17(a)显示PDDA的加入对乙酰胆碱酯酶活性有抑制作用(乙酰胆碱酯酶浓度相同)；图17(b)显示乙酰胆碱被乙酰胆碱酯酶催化分解原理图。

图18显示溶剂体系对乙酰胆碱酯酶固定量的影响(n＝3)。

图19显示BSA对乙酰胆碱酯酶固定量的影响。

图20显示乙酰胆碱酯酶活性检测的几种方法。

图21显示乙酰胆碱酯酶催化ATCh分解引起的pH值响应。

图22显示电化学方法检测酶的活性。

图23显示ATCh的加入量对电流的关系曲线。

图24显示利用表面负载有乙酰胆碱酯酶的磁性纳米粒子进行农药检测示意图。

图25显示不同温度下异丙威对乙酰胆碱酯酶的抑制率随反应时间的变化曲线。

图26显示三种利用乙酰胆碱酯酶检测农药含量方法间的对比。

图27为显示检测装置的构造的图示。

发明详述

定义

如本申请中所使用的术语“农药”意指在农业生产中，为保障、促进植物和农作物的成长，所施用的杀虫、杀菌、杀灭有害动物(或杂草)的物质统称。特指在农业上用于防治病虫以及调节植物生长、除草等药剂。

农药按主用途不同可分为杀虫剂、杀螨剂、杀鼠剂、杀软体动物剂、杀菌剂、杀线虫剂、除草剂、植物生长调节剂等。农药按来源不同可分为矿物源农药(无机化合物)、生物源农药(天然有机物、抗生素、微生物)及化学合成农药等。矿物源农药是起源于天然矿物原料的无机化合物和石油的农药。它包括砷化物、硫化物铜化物、磷化物和氟化物，以及石油乳剂等。目前使用较多的品种有硫悬浮剂、波尔多液等。生物源农药是指利用生物资源开发的农药。它包括动物源农药(如杀虫双、烯虫酯、昆虫性引诱剂、赤眼蜂等)植物源农药(如除虫菊素、印楝素、丁香油、乙烯利等)和微生物源农药(井冈霉素、白僵菌、苏云金杆菌等)。

化学合成农药是由人工合成并通过化学工业生产的农药，其品种多，应用范围广，药效高。主要的化学合成农药包括有机磷类农药、氨基甲酸酯类农药、有机氮类农药、拟除虫菊酯类农药、有机氯类农药和有机氟类农药等。有机磷类农药具体包括磷酸酯、一硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸酯、磷酰胺、硫代磷酰胺、焦磷酸酯等。优选地，有机磷类农药的代表为草甘膦、乐果和马拉氧磷。氨基甲酸酯类农药具体包括N-甲基氨基甲酸酯类和二甲基氨基甲酸酯等。优选地，氨基甲酸酯类农药的代表为西维因和异丙威。

纳米粒子

如本申请中所使用的术语“纳米粒子”是指粒度在1-100nm之间的粒子，又称超细微粒。它们处于微观体系和宏观体系之间，是由数目不多的原子或分子组成的集团，因此纳米粒子具有表面积大、表面曲率大等物理化学特性，并具有体积效应、表面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应。

磁性纳米粒子

如本申请中所使用的术语“磁性纳米粒子”是指具有磁性的纳米粒子，也称磁性纳米材料。磁性纳米材料的特性不同于常规的磁性材料，其原因是与磁性相关的特征物理长度恰好处于纳米量级，例如：磁单畴尺寸、超顺磁性临界尺寸、交换作用长度以及电子平均自由路程等大致处于1-100nm量级，当磁性体的尺寸与这些特征物理长度相当时，就会呈现反常的磁学性质。

举例而言，当磁性纳米粒子的粒径小于其超顺磁性临界尺寸时，粒子进入超顺磁性状态，无矫顽力和剩磁。众所周知，对于块状磁性材料(如Fe、Co、Ni)，其体内往往形成多畴结构以降低体系的退磁场能。纳米粒子尺寸处于单畴临界尺寸时具有高的矫顽力。小尺寸效应和表面效应导致磁性纳米粒子具有较低的居里温度。另外，磁性纳米粒子的饱和磁化强度(Ms)比常规材料低，并且其比饱和磁化强度随粒径的减小而减小。当粒子尺寸降低到纳米量级时，磁性材料甚至会发生磁性相变。

本发明的磁性纳米粒子可通过本领域已知的常规方法制备，包括但不限于湿化学法、化学气相法和物理方法。其中所述湿化学法包括沉淀法、溶胶-凝胶法、微乳液及反相微乳液法、水热法和多元醇还原法等；所述化学气相法包括化学气相沉积法、化学气相凝聚法和等离子蒸发法等；所述物理方法包括蒸发冷凝法和磁控溅射方法等。参见，例如张效岩等，磁性材料及器件，第35卷第6期，2004年12月，第14-17页。

本发明的磁性纳米粒子是合金、铁氧体和金属间化合物的磁性纳米粒子。优选地，所述磁性纳米粒子是含铁、钴、镍及其合金的磁性纳米粒子，优选为Fe₃O₄的纳米粒子。在一个优选的实施方案中，所述磁性纳米粒子的表面X含有极性基团，优选柠檬酸根或羟基。

胆碱酯酶

如本申请中所使用的术语“胆碱酯酶”是指水解多种胆碱酯以生成胆碱与羧酸的酶。胆碱酯酶可分为真性胆碱酯酶和假性胆碱脂酶。真性胆碱酯酶也称乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，EC3.1.1.7)，其为催化乙酰胆碱使其水解为胆碱和乙酸的酶且其催化活性能被有机磷类或氨基甲酸酯类农药所抑制，它主要来源于动物体内的胆碱能神经末梢突触间隙，特别是运动神经终板突触后膜的皱摺中聚集较多；也存在于胆碱能神经元内和红细胞中。优选地，所述乙酰胆碱酯酶源自电鳗或电鳐。此酶对于乙酰胆碱作用最强，特异性也较高。假性胆碱酯酶包括丙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶等，其广泛存在于动物体内的神经胶质细胞、血浆、肝、肾、肠中。对乙酰胆碱的特异性较低，假性胆碱酯酶可水解其他胆碱酯类，如琥珀酰胆碱。

固定

如本申请中所使用的术语“固定”，也称固定化，是指用物理或化学方法使酶成为不易从载体上流失的形式。在本发明中，将胆碱酯酶(特别是乙酰胆碱酯酶)固定在磁性纳米粒子上的方法可使用本领域已知的各种常规方法来制备，所述常规方法包括但不限于吸附法、化学交联法、共价键合法、物理包埋法、电化学聚合法和分子自组装等。参见，例如，高盐生等，山东化工，2008年第37卷第4期，第21-22，30页。

富集

如本申请中所使用的术语“富集”是指以1.1倍以上的因数高浓度地收集，具体地，本发明中的“富集磁性纳米粒子”的意思是收集所加入的全部纳米粒子的至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，还更优选至少90％，如至少95％、96％、97％、98％、99％，更优选至少99.5％，最优选100％。

酶活性检测法

在本发明中，酶活性的检测可以采用光谱法，pH值测量法和电化学方法。

如本申请中所使用的术语“光谱法”，也称分光光度法，是通过如下进行的：胆碱酯酶与农药接触后受到农药的抑制而失活，加入DTNB+ATCh后，残余的胆碱酯酶可将乙酰硫代胆碱水解为硫代胆碱和乙酸，而DTNB与硫代胆碱反应以得到TNB，后者经由分光光度计检测在412nm具有最大吸收。

在光谱法中，当412nm的吸光度值变化速度越快，说明TNB浓度增加越快，即硫代胆碱浓度增加越快，即酶活性高，即农药含量低；反之，吸光值变化速度慢，说明TNB增加慢，即硫代胆碱增加慢，即酶活性低，即农药含量高。由此，根据吸光度值的变化来确定待测样品中农药的存在或其含量。光谱法检测的检测速度快、灵敏度高，是优选的检测方法。

如本申请中所使用的术语“pH值测量法”是通过如下进行的：ACh(ATCh)被乙酰胆碱酯酶水解后生成乙酸和胆碱(硫代胆碱)，因此，可通过检测由于反应生成乙酸而导致的溶液pH值的变化来检测乙酰胆碱酯酶的活性。

为此，申请人分析了乙酰胆碱酯酶催化ATCh分解引起的pH值响应，如图21所示。随着反应的进行，溶液的pH值会逐渐下降，但由于乙酰胆碱酯酶的活性与溶液的pH值密切相关(如图15所示)，pH值的下降会抑制乙酰胆碱酯酶的催化活性，溶液的pH值需要在比较长的时间内才能达到平衡(接近5小时)，因此检测pH值的变化无法实现快速检测。

如本申请中所使用的术语“电化学方法”是通过如下进行的：乙酰胆碱(乙酰硫代胆碱)被乙酰胆碱酯酶水解后生成乙酸和胆碱(硫代胆碱)，因此，可施加一定电压测定胆碱(硫代胆碱)的氧化电流(负向电流)来检测乙酰胆碱酯酶的活性。如图所示，在未加入乙酰胆碱酯酶时，循环伏安曲线上未出现明显的氧化峰，当加入乙酰胆碱酯酶后在0.7V附近出现了硫代胆碱的氧化峰。

考虑到胆碱(硫代胆碱)上-OH官能团的氧化电位较高，检测时会造成较大的干扰，因此现有技术中在利用电化学方法进行检测时通常是利用乙酰硫代胆碱(ATCh)作为底物，ATCh被乙酰胆碱酯酶催化水解形成具有-SH官能团的硫代胆碱(TCh)，其氧化电位约为0.7V。如图22所示，根据0.7V氧化电流的大小可以计算出溶液中TCh的含量，从而可以知道乙酰胆碱酯酶的活性，进而根据乙酰胆碱酯酶的抑制率推断出农药的含量。如图23所示，随着ATCh加入量的增大，更多的TCh被水解出来，因此0.7V处的氧化电流增大。相对于检测pH值响应，电化学方法可以实现更快速的响应。如图23所示，响应时间约为40秒，但相对于光谱检测方法，电化学检测方式的灵敏度较差，需要消耗大量的乙酰胆碱酯酶和ATCh，增加了检测成本。

此外，需要着重强调的是，本发明的分光光度法与现有技术中所使用的检测方法(包括用酶液直接检测吸光度的方法，以及电极负载磁性纳米粒子和乙酰胆碱酯酶的检测方法)相比有显著的优势，这些优势至少体现在如下方面：

1.与用酶液直接检测吸光度的对比

用酶液直接检测吸光度指的是直接将游离态的乙酰胆碱酯酶溶液(假定酶溶液浓度为A，加入体积为V_AChE)与待测液(含有农药，体积为V_农药)混合进行酶抑制反应，充分反应后取若干体积的上述溶液(V_加入)到一定体积的DTNB溶液中(V_DTNB)，最后加入ATCh(V_ATCh)进行光谱检测。

由于在此过程中乙酰胆碱酯酶的浓度被逐渐稀释，待检测的信号源被减弱，根据计算可知光谱检测时乙酰胆碱酯酶的浓度为：

按照上述同样试验参数，只是采用本发明的方法，即在酶抑制反应后使用磁性纳米粒子对乙酰胆碱酯酶富集，并将其全部转移到DTNB溶液中，则光谱检测时待测液中乙酰胆碱酯酶的浓度为：

$C2=\frac{A*V_{\mathrm{AChE}}}{V_{\mathrm{DTNB}}+V_{\mathrm{ATCh}}}$

由于0＜V_加入≤V_AChE+V_农药，因此C1＜C2，也就是从理论上说，本申请方法中乙酰胆碱酯酶的信号强度明显高于酶液直接检测法。

2.与电极负载磁性纳米粒子和乙酰胆碱酯酶的检测方法对比

针对于在直接光谱检测时由于乙酰胆碱酯酶被稀释而造成信号源强度被减弱的弊端，现有技术中还采用将乙酰胆碱酯酶通过聚合物(或者掺杂有其它无机纳米粒子，例如纳米金、纳米二氧化硅，甚至包括磁性纳米粒子)将其直接固定在电极表面，采用电化学方法检测酶的活性。需要说明的是这里的磁性纳米粒子只是起到了促进电极表面电子传输功能，并未利用其去富集溶液中的乙酰胆碱酯酶。在电化学方法检测时，先将固定有乙酰胆碱酯酶的电极浸泡到含有农药的待测液中，经过10-20min温育以使电极上附着的酶充分与待测液中的农药反应，然后将电极转移到含有ATCh的溶液，通过检测ATCh水解产物TCh的氧化电流大小(如图2和图3所示)，从而获得酶活性的相关数据，进而知道待测液中农药的含量。

相对于酶液直接检测法，由于在检测过程中乙酰胆碱酯酶始终附着在电极表面，不存乙酰胆碱酯酶在检测过程中被稀释的问题，因此电极负载检测方法成功的克服了酶信号源减弱的弊端，但是受限于电极的接触面积，该方法只能检测到与电极接触区域里的农药，而无法反映出整个待测液中的农药，换句话说该检测方法实际上降低了农药作为信号源的强度，这里需要说明的一点儿是，利用乙酰胆碱酯酶检测农药过程中，利用了乙酰胆碱酯酶与农药间的相互抑制作用，检测时二者间无论哪一者的浓度产生了偏差均可造成信号源强度的减弱；其次，由于乙酰胆碱酯酶与农药之间的反应是不可逆的或者仅仅是部分可逆，因此需要频繁的更换电极表面固定有乙酰胆碱酯酶的聚合物薄膜，而这种更换有可能会造成电极与聚合物薄膜间的接触出现问题，造成较大的实验偏差；最后，如前所述，由于电化学检测方法的干扰因素较多，检测灵敏度要低于光谱法，因此在检测时需要消耗大量价格昂贵的乙酰胆碱酯酶，增加了检测成本。

综合考虑了酶液直接检测法和电极负载检测方法优缺点，本发明提出了利用固定有乙酰胆碱酯酶的磁性纳米粒子进行农药监测的方法，该方法既保证了乙酰胆碱酯酶的浓度在检测过程中不被降低，又确保了乙酰胆碱酯酶能够充分的与待测液中的农药分子充分接触发生反应，三种检测方法示意图如图26所示。

本发明的方法

本发明提供了一种检测农药的方法，包括如下步骤：

(a)提供待测样品；

(b)制备磁性纳米粒子，使胆碱酯酶与所述磁性纳米粒子接触，从而得到固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子；

(c)向步骤(a)的所述待测样品中加入步骤(b)中得到的固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子，并温育；

(d)用磁场富集磁性纳米粒子；和

(e)去除磁场，将富集的磁性纳米粒子分散在酶活性检测体系中，检测所述胆碱酯酶的酶活性，并通过酶活性来确定待测样品中农药的存在或其含量。

在一个优选的实施方案中，所述磁性纳米粒子的大小随制备反应温度升高而减小(温度越高成核越快，且较小的粒子在溶液中具有更好的分散性)。在一个优选的实施方案中，所述磁性纳米粒子小于20nm。在一个优选的实施方案中，在100℃制备得到的磁性纳米粒子溶液的稳定性超过15天，例如至少20天，优选至少30天。本发明制得的这些水溶性磁性纳米粒子可通过磁体在短时间(例如40s，优选35秒，更优选30s)重新收集，如图3所示。在一个优选的实施方案中，磁性纳米粒子的组合物是Fe₃O₄，如在100℃沉淀的粉末的X-光衍射(XRD)图样所示，根据谢乐公式计算出的粒子大小为9.7nm。在另一个优选的实施方案中，磁性纳米粒子的表面包含例如大约7.76wt.％的极性基团(柠檬酸根和/或羟基)，如热解重量(TG)分析(图4b)所示，其可导致磁性纳米粒子的良好的水溶性和/或分散性。

在一个优选的实施方案中，本发明的方法在步骤(b)之前还包括校准磁性纳米粒子的步骤，优选通过标准曲线进行。

将磁性纳米粒子在400至500nm的波长具有宽的UV-vis吸收，将磁性纳米粒子溶液在412nm的吸光度对磁性纳米粒子溶液的浓度(g/L)作图(即标准曲线)，显示出良好的线性，如图5所示。根据此标准曲线，可由磁性纳米粒子溶液在412nm的吸光度精确地得知其浓度，这将用于校准磁性纳米粒子的步骤。

在一个优选的实施方案中，本发明的方法在步骤(b)之前还包括校准胆碱酯酶浓度的步骤，优选通过标准曲线进行。

胆碱(硫代胆碱)与DTNB生成TNB的显色反应(即，第2反应)比乙酰硫代胆碱的水解反应(第1反应)更快，因而吸光度变化的速度由乙酰硫代胆碱水解确定。当反应开始时，底物(乙酰硫代胆碱)是过量的，水解反应是一级反应且反应的速率-决定步是乙酰胆碱酯酶的浓度(图6a)。通过测量在412nm扫描的UV-vis谱的斜率(κ)，然后将得到的斜率(κ)对胆碱酯酶浓度(U/L)作图(即标准曲线)，显示出良好的线性，如图6所示。根据此标准曲线，可由胆碱酯酶溶液在412nm扫描的UV-vis谱的斜率(κ)精确地得知其浓度，这将用于校准乙酰胆碱酯酶的浓度。

在一个优选的实施方案中，本发明的方法在步骤(b)之前还包括洗涤磁性纳米粒子的步骤。所述洗涤步骤可去除磁性纳米粒子表面上的极性基团从而有利于乙酰胆碱酯酶的固定化，如图7a所示。所述洗涤例如用去离子水或磷酸盐缓冲溶液，优选洗涤1-5次，更优选洗涤4次。在具体实例中，对于固定化前不洗涤的磁性纳米粒子，固定化的乙酰胆碱酯酶的量为仅仅174U每1g磁性纳米粒子(U/g)。在洗涤4次后，固定化的酶量可增加至217U/g。

在一个优选的实施方案中，本发明的方法在步骤(b)中将胆碱酯酶固定在磁性纳米粒子上是在pH 6-8，优选pH 7的条件下进行的。在具体实例中，胆碱酯酶固定化的pH值可影响固定化的酶量。当pH值低于2或超过12时，几乎没有乙酰胆碱酯酶能够固定在磁性纳米粒子上，如图7b所示。最高的固定化值见于7.4至10.4的pH范围。对于优化的系统(洗涤4次的磁性纳米粒子和pH值为7.4的PBS)而言，84％加入的乙酰胆碱酯酶可固定在磁性纳米粒子上。

在一个优选的实施方案中，将乙酰胆碱酯酶直接固定在小于20nm的超顺磁性纳米粒子上，酶固定量高，检测效果好。在一个优选的实施方案中，在将胆碱酯酶固定在磁性纳米粒子上的过程中，加入胆碱酯酶与磁性纳米粒子的比例为20∶1U/g以上时，有利于检测。在一个更优选的实施方案中，加入胆碱酯酶与磁性纳米粒子的比例为20U/g-330U/g，优选125U/g-300U/g，更优选280U/g，从而达到更佳的固定效率。

在一个优选的实施方案中，本发明的方法在步骤(b)中将胆碱酯酶固定在磁性纳米粒子上是通过如下进行的：

(A)将磁性纳米粒子悬浮于去离子水或磷酸盐缓冲溶液中；

(B)将所述胆碱酯酶溶于含有牛血清白蛋白(BSA)的去离子水或磷酸盐缓冲溶液中；和

(C)将磁性纳米粒子溶液与胆碱酯酶溶液接触。

在一个更优选的实施方案中，本发明的方法在步骤(b)中将胆碱酯酶固定在磁性纳米粒子上是通过如下进行的：

(a)将磁性纳米粒子悬浮于去离子水中；

(b)将所述胆碱酯酶溶于含有牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲溶液；和

(c)将磁性纳米粒子溶液与胆碱酯酶溶液接触。

在一个优选的实施方案中，所述磁性纳米粒子溶液的浓度为0.1-10g/L，优选0.5-5g/L，更优选1-3g/L，更优选约2g/L。在一个优选的实施方案中，所述胆碱酯酶溶液的浓度为0.1-5U/ml，优选0.5-2U/ml，更优选1U/ml。

在一个优选的实施方案中，所述牛血清白蛋白在磷酸盐缓冲溶液中的浓度为0.1-5g/L，优选0.5-2g/L，更优选0.8-1.2g/L，更优选1g/L。

在一个优选的实施方案中，本发明的方法在步骤(c)中向所述待测样品中加入0.05-1ml，优选0.1-0.5ml，更优选0.25ml固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子溶液。

在一个优选的实施方案中，本发明的方法在步骤(c)中将待测样品与固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子在0-60℃，优选20-50℃，更优选40℃，温育10分钟-2小时，优选20分钟-1.5小时，更优选30分钟-1小时，更优选40分钟。

在一个优选的实施方案中，本发明的方法在步骤(d)中通过覆有外层的磁体富集磁性纳米粒子。在一个优选的实施方案中，所述磁体的直径为约2-10mm，优选3-8mm，更优选4mm。

在一个优选的实施方案中，所述步骤(d)进行1-10分钟，优选1-5分钟，更优选100秒。在一个优选的实施方案中，本发明的方法在步骤(d)中富集至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，更优选基本上100％的磁性纳米粒子。

在一个优选的实施方案中，本发明的方法在步骤(e)中所述酶活性检测体系具有7-10，优选7-9，更优选大约8的pH值。在一个优选的实施方案中，本发明的方法在步骤(e)中检测所述胆碱酯酶的酶活性是通过pH测定法、电化学法或分光光度法检测的，优选是通过分光光度法检测的。

在一个优选的实施方案中，本发明的方法在步骤(e)中加入5，5′-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)和硫代胆碱(TCh)以通过分光光度法检测所述胆碱酯酶的酶活性。

在一个优选的实施方案中，通过分光光度法测定体系的吸光值变化速度，吸光值变化速度越快指示酶活性越高；反之，吸光值变化速度越慢指示酶活性越低。在一个优选的实施方案中，本发明的方法在所述步骤(e)中测定的酶活性越高指示待测样品中农药的含量越低；反之，所述步骤(e)中测定的酶活性越低指示待测样品中农药的含量越高。

本发明的装置

本发明还提供了用于农药检测的探测器，其包括：电源系统、储存系统、控制系统和测定分析系统。优选地，本发明的探测器是便携式探测器。更优选地，本发明的探测器通过本发明所述的方法来检测样品中农药的含量。

在一个优选的实施方案中，本发明的探测器的所述电源系统为电池(1)，其用于给探测器的其它各系统供电。

在一个优选的实施方案中，本发明的探测器的所述储存系统包括经由按钮(3)控制与比色池(9)相连且用于添加和储存DTNB的容器(5)、经由按钮(4)控制与比色池(9)相连且用于添加和储存ATCh容器(6)、经由按钮(12)控制用于添加和储存固定有乙酰胆碱酯酶的磁性纳米粒子溶液的容器(13)以及用于富集和转移磁性纳米粒子的设置有磁体的磁体装置(14)。

在一个优选的实施方案中，本发明的探测器的所述磁体装置(14)可从探测器中拔出用于磁性纳米粒子的富集和转移并可插入比色池(9)用于光谱测定。

在一个优选的实施方案中，本发明的探测器的所述磁体装置(14)包括外套(14a)和内部磁体(14b)，其中所述内部磁体(14b)可从外套(14a)中移出。在一个更优选的实施方案中，所述外套(14a)是用玻璃或聚四氟乙烯制成的。

在一个优选的实施方案中，本发明的探测器的所述控制系统包括与容器(5)相连用于控制DTNB的加入的按钮(3)、与容器(6)相连用于控制胆碱酯酶的加入的按钮(4)以及控制固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子溶液的释放的按钮(12)。

在一个优选的实施方案中，本发明的探测器的所述测定分析系统包括提供光谱检测所需波长的发光二极管(8)；与所述发光二极管(8)相连控制该发光二极管的芯片(2)；经由按钮(3)控制与容器(5)相连以添加DTNB、经由按钮(4)控制与硫代胆碱容器(6)相连以添加ATCh、且可插入磁体装置(14)从而在其中进行光谱测定的比色池(9)；用于将所采集的光信号转换成电信号的光电转换装置(10)；显示检测结果的液晶屏(7)以及分别与光电转换装置(10)和液晶屏(7)相连用于数据处理的芯片(11)。

在一个优选的实施方案中，本发明的探测器是笔形探测器。

此外，本发明还提供了使用本发明的探测器检测农药的方法，其包括如下步骤：

(a)按下按钮(12)以使固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子的溶液接触待测样品；

(b)利用磁体装置(14)富集样品中的磁性纳米粒子，将磁体装置(14)插入微型比色池(9)后，移出磁体装置(14)的内部磁体(14b)；

(c)按下按钮(3)，将DTNB和磁体装置(14)的外套(14a)上的固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子加入比色池(9)；

(d)接通电源，待液晶屏上读数稳定后按下按钮(4)以将乙酰硫代胆碱加入比色池中；和

(e)通过测定分析系统根据比色池的颜色变化速度在液晶屏(7)上显示出样品中农药的浓度。

在一个优选的实施方案中，其中步骤(a)进行1-5分钟，优选3分钟。

在一个优选的实施方案中，其中步骤(b)中的富集进行10-60秒，优选30秒。

此外，本发明还提供了本发明的探测器用于检测农药的用途。

通过下述实施例进一步描述本发明，所述实施例仅用于说明本发明，而不应视为对本发明的范围的限制。

实施例

试剂和装置

乙酰胆碱酯酶(AChE，EC 3.1.1.7，V-S型，1000单位/mg，来自电鳗)，乙酰硫代胆碱氯化物(ATChCl)和5，5′-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)购自Sigma-Aldrich Co.并直接使用。

西维因(Carbaryl)、草甘膦(glyphosate)和乐果(dimethoate)购自Fluka。马拉氧磷(Malaoxon)和异丙威购自Riedel-de

西维因(carbayl)的贮存溶液在无水乙醇中制备，乐果、马拉氧磷和异丙威的贮存溶液在丙酮中制备。

磷酸盐缓冲盐水(PBS)包含如下组分：137mM NaCl、2.7mM KCl、10mMNa₂HPO₄、2mM KH₂PO₄具有7.4的pH。用PBS制备1U/ml乙酰胆碱酯酶、1mM DTNB和0.05M ATCh。对于乙酰胆碱酯酶溶液，添加1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)来稳定化。

其它所有化学物为分析试剂且购自Aladdin(Shanghai Jingchun Co.，Ltd.)。

分光光度测量以来自Shanghai Spectrum Instrument Co.，Ltd.的756PCUV-vis分光光度计进行。

实施例1：制备磁性纳米粒子(MNPs)

本实施例提供了制备磁性纳米粒子的实施方案，即，经由共-沉淀途径合成磁性纳米粒子，如下述方法所述：

1)将0.98g(4mM)FeCl₃·6H₂O、0.556g(2mM)FeSO₄·7H₂O和1.152g(6mM)柠檬酸溶于75ml去离子(DI)水，并加载于250ml三颈瓶中。

2)将上述溶液在不同温度的水浴中加热(0、20、40、60、80和100℃)，真空脱气0.5h，然后输入氩气(Ar)。

3)将4g(0.1M)NaOH溶于25ml去离子水中并施加超声以除去可溶O₂。

4)将NaOH溶液在水浴中保持0.5h，然后快速注入三颈瓶(含Fe盐)中。

5)将反应保持1h，然后自然加热/冷却至RT。

6)用磁体收集获得的磁性纳米粒子，并用去离子水洗涤几次，直到上层溶液变为褐色。将磁性纳米粒子溶液的浓度调节至1.93g/L。

7)通过进一步离心上层溶液获得磁性纳米粒子粉末。

实施例2：将乙酰胆碱酯酶固定于磁性纳米粒子

本实施例提供了将乙酰胆碱酯酶固定于磁性纳米粒子的实施方案。

将2ml的实施例1中第6)步中的磁性纳米粒子溶液(1.93g/L)添加于5ml的离心管中，并通过在14000RPM离心30min获得磁性纳米粒子粉末。将获得的磁性纳米粒子粉末用DI水洗涤，并再-离心几次。将含有1mg/ml BSA的乙酰胆碱酯酶溶液(1U/ml)的1ml溶液添加入管中，并在4℃储存20h。固定有乙酰胆碱酯酶的磁性纳米粒子通过磁体分离获得，并用4ml PBS洗涤一次(one time)以去除吸收在磁性纳米粒子的表面上的游离的乙酰胆碱酯酶。将固定有乙酰胆碱酯酶的磁性纳米粒子重分散于2ml PBS中并在使用前储存在4℃。固定在磁性纳米粒子上的乙酰胆碱酯酶的量通过UV-vis分光光度计分析。

实施例3：加入的胆碱酯酶与磁性纳米粒子的比例对于酶固定量的影响

本实施例研究了胆碱酯酶固定过程中胆碱酯酶与磁性纳米粒子的比例对于酶固定量的影响。

图13显示了在一定量的磁性纳米粒子溶液中，固定时乙酰胆碱酯酶加入量与实际固定量之间的关系(n＝3)。如图13所示，能够实现的酶固定量范围为0～330U/g粒子。当酶的加入量为0.2ml(1U/mL)，固定后磁性纳米粒子上酶的固定量只有20.1U/g，固定效率为35.8％(固定量/实际加入量)；随着酶加入量的增大，固定量和固定效率均迅速升高，当酶的加入量为1ml时，固定量可以达到283.5U/g，固定效率接近100％；进一步提高酶的加入量虽然在一定程度上可以提高酶的固定量，但是固定效率迅速下降(固定时会有大量的酶被浪费掉)，考虑到酶的成本远高于磁性纳米粒子，经过优化后，在酶固定时，乙酰胆碱酯酶与磁性纳米粒子的加入比例约为250～310∶1U/g，更优选280∶1U/g。

实施例4：固定化时的pH值对酶固定量的影响

本实施例研究了固定化时的pH值对酶固定量的影响。

图14显示了乙酰胆碱酯酶固定量与pH值的关系(n＝3)。如图14所示，酶的固定量在pH＝7的PBS缓冲溶液中达到最大值，缓冲溶液的pH值过高(例如pH＞8)或者过低(例如pH＜6)均不利于乙酰胆碱酯酶在磁性纳米粒子表面的固定。

实施例5：聚合物辅助固定对酶固定量的影响

本实施例研究了聚合物辅助固定对酶固定量的影响。

图16显示了固定时聚合物的添加与乙酰胆碱酯酶固定量的关系(n＝3)。如图16所示，选取了5种常用于固定乙酰胆碱酯酶的聚合物(分别为戊二醛、明胶、壳聚糖、聚乙二醇和PDDA(聚(二烯丙基二甲基氯化铵))，文献里通常是将乙酰胆碱酯酶与聚合物溶液混合后滴涂到电极表面，然后晾干，用于电化学方法测量酶的活性，然而实际酶的固定量在文章里很少有报道，此外这些聚合物在水中均有一定的溶解度，因此在电化学法测量时可能会用部分固定在电极表面的酶又重新溶解，从而影响到测量的准确度。

基于文献报道，我们将1wt.％PDDA、1wt.％聚乙二醇、1wt.％壳聚糖，1wt.％明胶，5wt.％戊二醛分别与400μL 9.225g/L的磁性纳米粒子水溶液混合，超声20min后离心分离，得到表面经由聚合物修饰后的磁性纳米粒子，然后加入1ml的1U/mL乙酰胆碱酯酶，并在2～8℃反应20小时进行酶固定，离心去除未被固定到磁性纳米粒子表面的游离态的乙酰胆碱酯酶后，再加入4ml的PBS溶液(pH＝7.4)洗涤，离心，最后乙酰胆碱酯酶固定后的磁性纳米粒子保存在2ml去离子水中，保存温度为2～8℃。

图16给出了通过上述五种聚合物辅助后乙酰胆碱酯酶的固定量，可见经由聚合物表面修饰后，乙酰胆碱酯酶的固定量显著下降，最高固定量也仅有66.8U/g(PDDA)，远低于加入聚合物修饰前的固定量，此外，我们还发现由于PDDA具有与乙酰胆碱酯酶底物，即，乙酰胆碱(ACh)相似的季铵盐结构(与乙酰胆碱酯酶的催化活性中心相互作用)，PDDA的引入会引起酶活性的下降，如图17所示。

实施例6：溶剂体系对酶固定量的影响

本实施例研究了溶剂体系对酶固定量的影响。

在此研究中，发现磁性纳米粒子与乙酰胆碱酯酶的溶剂种类也可以影响到乙酰胆碱酯酶的固定量。由于磁性纳米粒子的溶液事实上属于一种胶体，电解质(例如PBS)的引入会引起磁性纳米粒子的聚沉，而聚沉作用会减小磁性纳米粒子与乙酰胆碱酯酶的接触面积，因此会降低磁性纳米粒子表面酶的固定量。这里我们分别考察了四种溶剂体系：

1.磁性纳米粒子溶于去离子水中-乙酰胆碱酯酶溶于去离子水中；

2.磁性纳米粒子溶于去离子水中-乙酰胆碱酯酶溶于磷酸盐缓冲溶液中；

3.磁性纳米粒子溶于磷酸盐缓冲溶液中-乙酰胆碱酯酶溶于去离子水中；

4.磁性纳米粒子溶于磷酸盐缓冲溶液中-乙酰胆碱酯酶溶于磷酸盐缓冲溶液中。

上述四种乙酰胆碱酯酶溶液中均含有1g/L BSA(牛血清蛋白)作为乙酰胆碱酯酶的稳定剂。

图18显示了溶剂体系对乙酰胆碱酯酶固定量的影响(n＝3)。如图18所示，乙酰胆碱酯酶的磷酸盐缓冲溶液有助于乙酰胆碱酯酶在磁性纳米粒子表面的固定(样品2和4)，而由于PBS对磁性纳米粒子的聚沉作用，样品4的固定量只有样品2的50％左右。

本实施例还考察了BSA的加入对乙酰胆碱酯酶固定量的影响，试验结果如图19所示，在利用乙酰胆碱酯酶的去离子水(DI water)溶液进行酶的固定，如果乙酰胆碱酯酶中不含BSA，那么无论磁性纳米粒子溶解于去离子水还是PBS中，乙酰胆碱酯酶均无法固定到磁性纳米粒子表面，这说明BSA的引入不仅仅可以起到稳定乙酰胆碱酯酶的作用，而且可以促进乙酰胆碱酯酶在磁性纳米粒子表面的固定。

实施例7：固定化的乙酰胆碱酯酶和DTNB的稳定性

通过每天测量乙酰胆碱酯酶的活性来分析固定化的乙酰胆碱酯酶的稳定性。在室温贮存的固定化的乙酰胆碱酯酶的稳定性可与在4℃储存的游离的乙酰胆碱酯酶相比或高于后者，如图9所示。与在室温储存15天的游离的乙酰胆碱酯酶的稳定性相比，磁性纳米粒子可增强固定化的乙酰胆碱酯酶的稳定性。埃尔曼试剂DTNB当暴露于太阳时也经受光解，如图10所示。但幸运地是，当其储存在暗处时，即使在高温(中午室外约40℃)也未发现DTNB的分解。固定化的乙酰胆碱酯酶和DTNB的良好稳定性提供了设计长寿命的农药传感器的机会。

实施例8：乙酰胆碱酯酶的UV-vis光谱测量

在通常的测量中，将4ml PBS、1ml DTNB(1mM)和125μl固定有乙酰胆碱酯酶的磁性纳米粒子溶液的溶液在25ml塑料瓶中混合，然后将3μlATCh加入瓶中，摇匀，并转移到比色池中，超声处理除去比色板池中的气泡后，将反应溶液立即(从ATCh的加入开始计时，时间小于50秒)转移到分光光度计中。

实施例9：农药对乙酰胆碱酯酶的抑制

本实施例提供了农药对乙酰胆碱酯酶的抑制曲线，详细说明了得到该曲线以及不同浓度下的固定化酶的归一化活性％的实验过程。

1.制作农药对乙酰胆碱酯酶的抑制曲线。

取0.25ml浓度为1.93g/L载有乙酰胆碱酯酶的磁性纳米粒子溶液(固定量为283U/g)加入到1ml浓度不同的异丙威(甲基乙基苯酚甲基氨基甲酸酯，属于氨基甲酸酯的一种)水溶液中，酶抑制反应时间为40min(刚开始实验参数未进行优化，因此适当延长酶抑制反应时间以确保反应达到平衡，后期酶抑制反应的时间可以被控制在10min以内，见图25)，然后利用内部装有微型磁体的石英管利用磁场将农药中的乙酰胆碱酯酶酶进行富集，如图24所示，在60秒内农药溶液中的乙酰胆碱酯酶酶(信号源)就基本可以被富集，表现为溶液的颜色由土黄色变为无色(低浓度的磁性纳米粒子水溶液呈土黄色)。然后将石英管中的磁体移走，固定有乙酰胆碱酯酶的磁性纳米粒子就留在了石英管表面，而由于磁性纳米粒子是水溶性的，因此只要将石英管插入到DTNB的溶液中，表面的磁性纳米粒子就可以很容易的被重新分散到溶液中，以便于进行光谱检测表面固定乙酰胆碱酯酶的活性。

2.不同浓度下的固定化酶的归一化活性％通过如下获得：为了在直观上直接反应出农药对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用，我们将在不含农药时检测出来的乙酰胆碱酯酶活性定义为100％，其它各点按照农药浓度为0时的乙酰胆碱酯酶活性进行归一化，从而得到图12。

实施例10：抑制实验的参数优化

为了进一步缩短酶抑制反应的时间以达到快速检测的目的，在本实施例中对农药对酶抑制的实验参数进行了优化，研究发现在一定量农药浓度下乙酰胆碱酯酶的抑制反应速度与酶抑制反应的温度密切相关，适当升高酶抑制反应的温度，可以使酶的抑制反应在10分钟之内即可达到平衡(在40℃，如图25所示)。在40℃时，对于浓度为200μg/L的异丙威只需要3分钟左右即可达到平衡时抑制率的50％。通过磁性纳米粒子对乙酰胆碱酯的富集，我们显著的提高检测信号的强度，这使得我们有可能在酶抑制反应在尚未到达平衡时即可进行检测，最终实现农药残留量的快速检测。同时研究还发现如果酶抑制反应的温度超过60℃，则乙酰胆碱酯酶的构型会发生改变，对底物的催化活性完全丧失，因此对于酶抑制反应的温度应该在0～60℃。

在图25中异丙威浓度为200μg/L，乙酰胆碱酯酶的浓度为0.2U/ml。

实施例11：通过固定有乙酰胆碱酯酶的磁性纳米粒子进行农药检测

本实施例提供了通过固定有乙酰胆碱酯酶的磁性纳米粒子进行农药检测的实施方案。

将0.25ml固定有乙酰胆碱酯酶的磁性纳米粒子溶液添加到含有农药的样品溶液中，并温育40min。然后通过用玻璃管覆盖的小磁体收集固定有乙酰胆碱酯酶的磁性纳米粒子。在100s中，可以收集几乎所有固定有乙酰胆碱酯酶的磁性纳米粒子。在除去玻璃管中的磁体后，可将固定有乙酰胆碱酯酶的磁性纳米粒子再分散于含有4ml PBS(pH＝7.4)和1ml DTNB的溶液中。在添加ATCh之后，通过UV-vis分光光度计在412nm附近检测吸光度变化的速度。

实施例12：检测时的pH值对乙酰胆碱酯酶活性的影响

本实施例研究了检测时的pH值对乙酰胆碱酯酶活性的影响。

图15显示检测时的pH值对乙酰胆碱酯酶(游离态，未固定在磁性纳米粒子表面)活性的影响：(图15a)412nm处紫外-可见光分光光谱——斜率的变化反应了酶活性的变化；(图15b)根据pH值从2到10酶活性最高的点(pH＝9时)进行归一化后的结果，其中当pH＝11，检测时发现即使没有酶的加入，DTNB也会在强碱性环境下快速的自行分解，因此表观总的表观活性增强，但如果扣除高pH值的影响，实际上酶的活性较pH＝10时有所下降。

图8(b)显示添加125μl的乙酰胆碱酯酶(1U/ml)溶液的检测系统的pH值对乙酰胆碱酯酶活性的影响。结果显示随着pH值的增加，UV-vis谱的斜率(κ)增加，如图8(b)所示。较大的κ值可增加信噪比，也缩短检测时间。然而，当pH值超过8时，农药倾向于水解。为了避免农药的水解，在本发明中我们在检测中选择pH值为8。

实施例13：检测时加入的乙酰胆碱酯酶体积对响应时间的影响

本实施例研究了检测时加入的乙酰胆碱酯酶体积对响应时间的影响。

在实际的应用中，需要农药传感器不仅具有高灵敏度和长稳定性，而且具有快速响应。为了获得快速检测，研究了检测时加入的乙酰胆碱酯酶体积对酶活性的影响。图8(a)显示在PBS(pH＝7.4)中加入的1U/ml乙酰胆碱酯酶的体积对酶活性的影响。如图8(a)所示，当乙酰胆碱酯酶的体积为仅25μL时，在乙酰胆碱酯酶催化下的水解在ATCh加入后7分钟开始。随着加入的乙酰胆碱酯酶的增加，初始反应时间减少，且当乙酰胆碱酯酶的体积达到125μL时，在ATCh加入后立即开始水解。乙酰胆碱酯酶量的进一步增加并不缩短反应时间，而加入的乙酰胆碱酯酶越多，需要消耗更多的ATCh以确保ATCh的水解速率是由乙酰胆碱酯酶浓度决定的。考虑到成本问题，在每个测定中采用125μl的乙酰胆碱酯酶(1U/ml)溶液或等同的125mU乙酰胆碱酯酶。

实施例14：农药检测的实验结果

本实施例提供了通过固定有乙酰胆碱酯酶的磁性纳米粒子进行农药检测的实验结果。

已通过本发明的方法检测了五种农药，其中三种(西维因、异丙威和马拉氧磷)可抑制乙酰胆碱酯酶的活性，如图11所示。在本发明中，我们进一步分析了抑制作用相对于西维因的浓度。结果显示固定有乙酰胆碱酯酶的磁性纳米粒子的抑制与西维因的浓度在50(或甚至更低)至200μg/L的范围内呈现良好的线性，如图12所示。根据美国环境保护局，西维因的最大残留限为100μg/L，因此可使用本发明的方法容易地实现农药检测。

实施例15：用于农药检测的便携式笔形探测器

本实施例提供了用于农药检测的便携式笔形探测器，其包括如下元件：

电池(1)，其用于向芯片(2)和(11)提供电源；

芯片(2)，其与发光二极管(8)相连并对其进行控制，以提供光谱检测需要的光源；

按钮(3)，其与容器(5)相连，用于控制DTNB的加入；

按钮(4)，其与容器(6)相连，用于控制ATCh的加入；

容器(5)，其经由按钮(3)控制与比色池(9)相连，用于添加和储存DTNB；

容器(6)，其经由按钮(4)控制与比色池(9)相连，用于添加和储存ATCh；

液晶屏(7)，其与数据处理芯片(11)相连，用于显示检测结果；

发光二极管(8)，其为发光元件，通过芯片(2)控制用于提供光谱检测所需的波长(390～430nm，412nm为最佳)；

比色池(9)，其用于插入磁体装置(14)和添加DTNB和ATCh，从而在其中进行光谱测定；

光电转换装置(10)，其与芯片(11)相连，用于将所采集的光信号转换成电信号；

芯片(11)，其分别与光电转换器(10)和液晶屏(7)相连，用于数据处理和传输；

按钮(12)，其与容器(13)相连，用于控制固定有乙酰胆碱酯酶的磁性纳米粒子溶液的释放；

容器(13)，其经由按钮(12)控制用于添加和储存固定有乙酰胆碱酯酶的磁性纳米粒子溶液；

磁体装置(14)，其包括用玻璃或聚四氟乙烯制成的外套(14a)和内部磁体(14b)，所述磁体装置(14)可从探测器中拔出用于磁性纳米粒子的富集和转移并可插入比色池(9)用于光谱测定。

实施例16：使用实施例15的探测器检测农药

本实施例说明了使用实施例15的探测器检测农药的操作过程。

按下按钮12，将固定有乙酰胆碱酯酶磁性纳米粒子溶液滴到待测蔬菜的表面，面积约为0.5cm²，3分钟后利用磁体14(外面套有玻璃或者聚四氟乙烯)将液滴里的磁性纳米粒子富集，富集时间约为30s，然后将磁体14插入微型比色池9中，移走14内部的永磁体后按下按钮3，对其表面进行冲刷，并且将DTNB和乙酰胆碱酯酶-磁性纳米粒子转移到比色池9中。接通电源，带液晶屏上读数稳定后按下按钮4，向比色池中加入ATCh，芯片11根据比色池的颜色变化速度，1min后直接在液晶屏7上显示出蔬菜表面农药的浓度(μg/m²)。

本发明提出了涉及固定有乙酰胆碱酯酶的磁性纳米粒子的新型农药检测方法及检测装置。这些水溶性磁性纳米粒子在检测中充当乙酰胆碱酯酶载体，其可通过磁体容易地收集或通过水去除。在磁性纳米粒子上固定的乙酰胆碱酯酶的高稳定性和良好响应为设计高灵敏度和快速响应的农药传感器奠定了坚实的基础。

尽管已参照本发明的确定优选实例表示和描述了本发明，但本领域内的普通技术人员将理解的是，可在不背离由所附项书限定的本发明宗旨和范围的前提下对本发明进行各种形式和细节上的修改。

Claims (48)

1.一种检测农药的方法，包括如下步骤：

(a)提供待测样品；

(b)制备磁性纳米粒子，使胆碱酯酶与所述磁性纳米粒子接触，从而得到固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子；

(c)向步骤(a)的所述待测样品中加入步骤(b)中得到的固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子，并温育；

(d)用磁场富集磁性纳米粒子；和

(e)去除磁场，将富集的磁性纳米粒子分散在酶活性检测体系中，检测所述胆碱酯酶的酶活性，并通过酶活性来确定待测样品中农药的存在或其含量。

2.权利要求1的方法，其中所述农药为化学合成农药。

3.权利要求1的方法，其中所述农药选自下组：有机磷类农药、氨基甲酸酯类农药、有机氮类农药、拟除虫菊酯类农药、有机氯类农药和有机氟类农药。

4.权利要求3的方法，其中所述有机磷类农药选自下组：磷酸酯、一硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸酯、磷酰胺、硫代磷酰胺、焦磷酸酯。

5.权利要求3的方法，其中所述有机磷类农药选自：草甘膦、乐果和马拉氧磷。

6.权利要求3的方法，其中所述氨基甲酸酯类农药选自下组：N-甲基氨基甲酸酯类和二甲基氨基甲酸酯。

7.权利要求3的方法，其中所述氨基甲酸酯类农药选自西维因和异丙威。

8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述磁性纳米粒子是通过选自下组的方法制备的：湿化学法、化学气相法和物理方法。

9.权利要求8的方法，其中所述湿化学法选自沉淀法、溶胶-凝胶法、微乳液及反相微乳液法、水热法和多元醇还原法；所述化学气相法选自化学气相沉积法、化学气相凝聚法和等离子蒸发法；所述物理方法选自蒸发冷凝法和磁控溅射方法。

10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述磁性纳米粒子是合金、铁氧体和金属间化合物的磁性纳米粒子。

11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述磁性纳米粒子是含铁、钴、镍及其合金的磁性纳米粒子，优选为Fe₃O₄的纳米粒子。

12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述磁性纳米粒子的表面含有极性基团，优选柠檬酸根或羟基。

13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述胆碱酯酶选自下组：乙酰胆碱酯酶、丙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶。

14.权利要求13的方法，其中所述乙酰胆碱酯酶从选自下组的来源获得：微生物、植物和动物，优选电鳗或电鳐。

15.权利要求1-14中任一项的方法，其中在步骤(b)之前还包括校准磁性纳米粒子的步骤，优选通过标准曲线进行。

16.权利要求1-15中任一项的方法，其中在步骤(b)之前还包括校准胆碱酯酶浓度的步骤，优选通过标准曲线进行。

17.权利要求1-16中任一项的方法，其中在步骤(b)之前还包括洗涤磁性纳米粒子的步骤，优选用去离子水洗涤1-5次，更优选洗涤4次。

18.权利要求1-17中任一项的方法，其中在步骤(b)中将胆碱酯酶固定在磁性纳米粒子上是通过选自下组的方法进行的：吸附法、化学交联法、共价键合法、物理包埋法、电化学聚合法和分子自组装。

19.权利要求1-18中任一项的方法，其中在步骤(b)中将胆碱酯酶固定在磁性纳米粒子上是在pH 6-8，优选pH 7的条件下进行的。

20.权利要求1-19中任一项的方法，其中在步骤(b)中将胆碱酯酶固定在磁性纳米粒子上的过程中，加入胆碱酯酶与磁性纳米粒子的比例为20～330∶1U/g，优选125～320∶1U/g，更优选250～310∶1U/g，更优选280∶1U/g。

21.权利要求1-20中任一项的方法，其中在步骤(b)中将胆碱酯酶固定在磁性纳米粒子上是通过如下进行的：

(A)将磁性纳米粒子悬浮于去离子水或磷酸盐缓冲溶液中；

(B)将所述胆碱酯酶溶于含有牛血清白蛋白(BSA)的去离子水或磷酸盐缓冲溶液中；和

(C)将磁性纳米粒子溶液与胆碱酯酶溶液接触。

22.权利要求1-21中任一项的方法，其中在步骤(b)中将胆碱酯酶固定在磁性纳米粒子上是通过如下进行的：

(a)将磁性纳米粒子悬浮于去离子水中；

(b)将所述胆碱酯酶溶于含有牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲溶液；和

(c)将磁性纳米粒子溶液与胆碱酯酶溶液接触。

23.权利要求21-22中任一项的方法，其中磁性纳米粒子溶液的浓度为0.1-10g/L，优选0.5-5g/L，更优选1-3g/L，更优选约2g/L。

24.权利要求21-22中任一项的方法，其中胆碱酯酶溶液的浓度为0.1-10U/ml，优选0.5-2U/ml，更优选1U/ml。

25.权利要求21-22中任一项的方法，其中牛血清白蛋白在磷酸盐缓冲溶液中的浓度为0.1-5g/L，优选0.5-2g/L，更优选0.8-1.2g/L，更优选1g/L。

26.权利要求1-25中任一项的方法，其中在步骤(c)中向所述待测样品中加入0.05-1ml，优选0.1-0.5ml，更优选0.25ml固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子溶液。

27.权利要求1-26中任一项的方法，其中在步骤(c)中将待测样品与固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子在0-60℃，优选20-50℃，更优选40℃，温育2分钟-2小时，优选20分钟-1小时，更优选40分钟。

28.权利要求1-27中任一项的方法，其中在步骤(d)中通过覆有外层的磁体富集磁性纳米粒子。

29.权利要求28的方法，其中所述磁体的直径为约2-10mm，优选3-8mm，更优选4mm。

30.权利要求1-29中任一项的方法，其中所述步骤(d)进行1-10分钟，优选1-5分钟，更优选100秒。

31.权利要求1-30中任一项的方法，其中在步骤(d)中富集至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，更优选基本上100％的磁性纳米粒子。

32.权利要求1-31中任一项的方法，其中在步骤(e)中所述酶活性检测体系具有2-11，优选6-10，更优选7-9的pH值。

33.权利要求1-32中任一项的方法，其中在步骤(e)中检测所述胆碱酯酶的酶活性是通过pH测定法、电化学法或分光光度法检测的，优选是通过分光光度法检测的。

34.权利要求33的方法，其中在步骤(e)中加入5，5′-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)和硫代胆碱(TCh)以通过分光光度法检测所述胆碱酯酶的酶活性。

35.权利要求34的方法，其中通过分光光度法测定体系的吸光值变化速度，吸光值变化速度越快指示酶活性越高；反之，吸光值变化速度越慢指示酶活性越低。

36.权利要求1-35中任一项的方法，其中在所述步骤(e)中测定的酶活性越高指示待测样品中农药的含量越低；反之，所述步骤(e)中测定的酶活性越低指示待测样品中农药的含量越高。

37.一种用于农药检测的便携式探测器，其包括：电源系统、储存系统、控制系统和测定分析系统。

38.权利要求37的探测器，其中所述电源系统为电池(1)，其用于给探测器的其它各系统供电。

39.权利要求37-38中任一项的探测器，其中所述储存系统包括DTNB容器(5)、硫代胆碱容器(6)、磁性纳米粒子溶液容器(13)以及用于富集和转移磁性纳米粒子的设置有磁体的磁体装置(14)。

40.权利要求39的探测器，其中所述磁体装置(14)包括外套(14a)和内部磁体(14b)，其中所述内部磁体(14b)可从外套(14a)中移出。

41.权利要求40的探测器，其中所述外套(14a)是用玻璃或聚四氟乙烯制成的。

42.权利要求37-41中任一项的探测器，其中所述控制系统包括与DTNB容器(5)相连用于控制DTNB的加入的按钮(3)、与硫代胆碱容器(6)相连用于控制胆碱酯酶的加入的按钮(4)以及控制固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子溶液的释放的按钮(12)。

43.权利要求37-42中任一项的探测器，其中所述测定分析系统包括提供光谱检测所需波长的发光二极管(8)；与所述发光二极管(8)相连控制该发光二极管的芯片(2)；经按钮(3)与DTNB容器(5)相连的、经按钮(4)与硫代胆碱容器(6)相连的、且可插入磁体装置(14)的比色池(9)；用于将所采集的光信号转换成电信号的光电转换装置(10)；显示检测结果的液晶屏(7)以及分别与光电转换装置(10)和液晶屏(7)相连的数据处理芯片(11)。

44.权利要求37-43中任一项的探测器，所述探测器是笔形探测器。

45.使用权利要求37-44中任一项的探测器检测农药的方法，其包括如下步骤：

(a)按下按钮(12)以使固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子的溶液接触待测样品；

(b)利用磁体装置(14)富集样品中的磁性纳米粒子，将磁体装置(14)插入微型比色池(9)后，移出磁体装置(14)的内部磁体(14b)；

(c)按下按钮(3)，将DTNB和磁体装置(14)的外套(14a)上的固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子加入比色池(9)；

(d)接通电源，待液晶屏上读数稳定后按下按钮(4)以将乙酰硫代胆碱加入比色池中；和

(e)通过测定分析系统根据比色池的颜色变化速度在液晶屏(7)上显示出样品中农药的浓度。

46.权利要求45的方法，其中步骤(a)进行1-5分钟，优选3分钟。

47.权利要求45的方法，其中步骤(b)中的富集进行10-60秒，优选30秒。

48.权利要求37-44中任一项的探测器用于检测农药的用途。

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