CN108303456B - 一种果蔬农药残留快速检测方法 - Google Patents

Abstract

一种果蔬农药残留快速检测方法，包括如下步骤：S1、合成原位包覆有乙酰胆碱酯酶的配位聚合物纳米材料；S2、在一丝网印刷电极表面滴加聚酰胺‑胺型树枝状高分子溶液；S3、将步骤S1获得的纳米材料共价修饰到步骤S2电极上；S4、将步骤S3制备的丝网印刷电极与便携式电化学工作站相连，检测农药加入前、后乙酰胆碱电流信号的变化，完成定量检测；S5、将农产品用步骤S4的方式检测，以获得农产品此时的电流信号，再根据步骤S4所知农药浓度与电流信号关系以及国标中对农药的限量，可判断出预处理后的农产品农药残留是否超标。优点是：成本低，整个过程无需依赖大型仪器以及专业的操作人员，广泛用于资源匮乏的农村以及发展中国家的现场定量检测。

Description

一种果蔬农药残留快速检测方法

技术领域

本发明涉及农产品中农药残留检测技术领域，具体地说一种果蔬农药残留快速检测方法。

背景技术

随着人们生活水平的提高和生活方式的改变，水果和蔬菜在人们食物构成中的比重越来越大，与人类的健康也愈加紧密。我国是农药大国，当前果蔬生产中农药残留的问题相当严重。从常见的农药污染品种来看，主要包括有机磷、氨基甲酸酯、有机氯和菊酯类等杀虫剂。其中70％为有机磷杀虫剂，而70％的有机磷杀虫剂中又都为高毒、剧毒、高残留农药。人体食用了这些残留有农药的水果和蔬菜后，对身体健康有很大的危害，严重者会导致患癌、甚至死亡。因此，各国对农药的施用都进行了严格的管理，并对食品中农药残留容许量作了规定。如日本对农药实行登记制度，一旦确认某种农药对人畜有害，政府便限制或禁止销售和使用。近年来我国也一直在紧抓农药残留检测工作和农药残留标准制定工作，据有关部门介绍我国已基本实现农药残留标准全覆盖。

农药残留常见的检测方法主要有色谱检测法、免疫试纸条法和农残速测卡法。其中色谱检测法尽管灵敏度高、准确度高，但需要大型昂贵的仪器、专业的操作人员以及复杂的样品前处理过程，检测时间长；免疫试纸条法检测过程虽简单，但抗体昂贵、且一次只能测单种农药；而基于酶抑制率法的农残速测卡尽管操作简便、成本低廉，但准确性不高、不能定量。因此，发展一种现场、简单、快速、廉价、高灵敏的果蔬农药残留定量检测方法具有重要的现实意义。

发明内容

为了解决上述技术缺陷，本发明提供操作简单、对检测人员无专业性要求、检测灵敏度高，且成本低廉的一种果蔬农药残留快速检测方法。

一种果蔬农药残留快速检测方法，包括如下步骤：

S1、室温下，通过金属离子与有机配体作用，合成原位包覆有乙酰胆碱酯酶的配位聚合物纳米材料；

优选地，所述步骤S1中，金属离子为Cu²⁺、Zn²⁺、AuCl₄ ^-、PtCl₆ ^2-中的一种，有机配体为2,4-二巯基-5,6-二氨基嘧啶、2,5-二氨基-1,4-苯二硫醇二盐酸盐以及2,5-二巯基对苯二甲酸中的一种；

S2、在一丝网印刷电极表面采用滴涂法滴加聚酰胺-胺型树枝状高分子溶液，使其在电极表面形成膜；

优选地，所述步骤S2中，聚酰胺-胺型树枝状高分子溶液浓度和体积分别为1％和5μL；

S3、通过戊二醛或EDC/NHS偶联的方式，将步骤S1获得的纳米材料共价修饰到步骤S2的电极上；

步骤S3中，EDC/NHS指N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳化二亚胺盐酸盐/N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠盐；

步骤S3中，戊二醛浓度为2％；

S4、将步骤S3制备的丝网印刷电极与便携式电化学工作站相连，通过方波阳极溶出伏安法检测农药加入前、后乙酰胆碱电流信号的变化，根据农药浓度与电流信号变化值之间的关系完成定量检测，以了解农药浓度与电流信号的关系；

步骤S4中，便携式电化学工作站反应体系中，所用底物为乙酰胆碱，且其浓度为1mM；

步骤S4中，农药加入10min后再进行乙酰胆碱电流信号检测；

步骤S4中，农药为有机磷或氨基甲酸酯类中的一种或多种；

优选地，步骤S4中，方波阳极溶出伏安法具体参数设置为电位扫描范围-0.85–0V，阶跃电位1mV，振幅0.1V，频率25Hz。

S5、将欲检测的农产品按照国标要求在检测前进行预处理后，用步骤S4的方式，检测经过预处理后的农产品，以获得预处理农产品此时的电流信号，再根据步骤S4所知农药浓度与电流信号关系以及国标中对农药的限量，可判断出预处理后的农产品农药残留是否超标。

本发明提供一种果蔬农药残留快速检测方法，其优点是：

(1)金属有机配位聚合物原位包裹乙酰胆碱酯酶进行信号放大，利用聚酰胺-胺型树枝状高分子优良的成膜能力、导电能力以及方波阳极溶出伏安法的富集优势，基于丝网印刷电极和便携式电化学工作站构建以实现果蔬农药残留现场、简单、快速、高灵敏的定量检测平台，其检测限可低至10^-12M；其中配位聚合物优良的原位包裹能力和疏松多孔性，不仅能有效提高酶的固定量，而且可以很好地保持酶的活性、保证酶催化反应的顺利进行；

(2)再者，聚酰胺-胺型树枝状高分子的使用，由于其特性，不仅提高了金属有机配位聚合物中电子的传递能力，而且还能有效提高其在电极表面的附着性，从而保证乙酰胆碱酯酶的有效固定，提高检测稳定性；

(3)此外，本发明中的丝网印刷电极，成本低、即用即抛、操作简便、测试性能非常稳定，和便携式电化学工作站一起非常适合基层现场使用。同时整个过程无需依赖大型仪器以及专业的操作人员，可广泛用于资源匮乏的农村以及发展中国家的现场定量检测。

附图说明

图1为裸丝网印刷电极与实施例一中步骤S2获得修饰电极的阻抗图；

图2为实施例一中步骤S1获得物质上清液的UV-vis表征图。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案进行详细的说明，但是本发明的范围不受这些实施例的限制。

实施例一

本实施例中，以Cu²⁺与2,4-二巯基-5,6-二氨基嘧啶原位包裹乙酰胆碱酯酶检测甲基对硫磷(或甲基对硫磷与毒死蜱的混合物)为例进行说明：

S1、将0.5mg乙酰胆碱酯酶加入500μL 0.5mg/mL 2,4-二巯基-5,6-二氨基嘧啶溶液(V_乙醇：V_水为3:2)中，超声溶解后，加入10μL0.1M CuSO₄溶液，用枪混匀，室温静置10min。然后用0.01M PBS(pH 7.0)缓冲液离心处理3次，最后将产物重悬到100μL 0.01M PBS(pH7.0)中备用；

S2、在一丝网印刷电极表面滴加5μL 1％聚酰胺-胺型树枝状高分子溶液，35℃烘烤处理30min，使其在丝网印刷电极表面形成膜；

S3、将步骤S2获得的电极在浓度为2％的戊二醛溶液中浸泡30min；然后将5μL步骤S1获得的产物滴加到电极表面4℃孵育30min；最终用0.01M PBS(pH 7.0)冲洗，4℃保存备用；

S4、将步骤S3制备的丝网印刷电极与便携式电化学工作站相连，浸入装有1mM乙酰胆碱和200μL PBS(0.002M,0.1M NaCl,pH 7.0)溶液的电解池中；将1.0×10^-11M，1.0×10^{- 10}M，1.0×10^-9M，1.0×10^-8M，1.0×10^-7M五个浓度的甲基对硫磷(或甲基对硫磷与毒死蜱的混合物)标准品分别加入其中，且每加入一种浓度标准品，在10min后采用方波阳极溶出伏安法检测电流信号变化，以分别测出每个浓度标准品所对应的乙酰胆碱电流信号。根据甲基对硫磷(或甲基对硫磷与毒死蜱的混合物)浓度与电流信号变化值之间的关系进行农药的定量检测。该方法对甲基对硫磷的检测线性范围为1.0×10^-11～1.0×10^-7M(r²＝0.993)；

其中，方波阳极溶出伏安法具体参数设置为：电位扫描范围-0.85–0V，阶跃电位1mV，振幅0.1V，频率25Hz。

S5、将从菜市场购买的苹果取果皮后按照国标要求在检测前进行预处理；用步骤S4的方式对预处理后的苹果果皮样品液进行检测。

直接检测时，该样品对乙酰胆碱酯酶催化乙酰胆碱没有明显抑制作用，表明该样品中几乎不含该类农药残留。而以苹果果皮处理后得到的样品液为基质，进行加标回收实验，结果如附表1所示。所配制的4个模拟样本经测试后，其回收率均在80.1％～100.5％之间，表明该方法可用于果蔬农药残留的实际样检测。

表1实施例一步骤S5中加标回收实验结果

将裸丝网印刷电极与实施例一中步骤S2获得的修饰电极均进行电化学阻抗实验，实验结果如图1所示，丝网印刷电极表面修饰聚酰胺-胺型树枝状高分子后，其阻抗值明显降低，表明此时的电极导电能力优良；

同时，将实施例一中步骤S1获得物质的上清液通过紫外可见分光光度计进行检测：其UV-vis表征图如图2(其中，a是0.5mg乙酰胆碱酯酶溶于510μL水中稀释5倍后测试所得；b是Cu²⁺与2,4-二巯基-5,6-二氨基嘧啶原位包裹乙酰胆碱酯酶后第一次离心获得的上清液稀释5倍后测试所得)所示，据图2可知，配位聚合物对酶具有优良的包裹能力。

实施例二

本实施例中，以PtCl₆ ^2-与2,5-二巯基对苯二甲酸原位包裹乙酰胆碱酯酶检测呋喃丹(或甲基对硫磷与呋喃丹的混合物)为例进行说明：

S1、将1.0mg乙酰胆碱酯酶加入2.0mL 1.0mg/mL 2,5-二巯基对苯二甲酸溶液(V_乙醇：V_水为3:2)中，超声溶解后，加入350μL 38.6mM H₂PtCl₆溶液，搅拌3h，用0.01M PBS(pH7.0)缓冲液离心处理3次，最后将产物重悬到100μL 0.01M PBS(pH 7.0)中备用；

S2、在一丝网印刷电极表面滴加5μL 1％聚酰胺-胺型树枝状高分子溶液，35℃烘烤处理30min，使其在丝网印刷电极表面形成膜；

S3、将步骤S2获得的电极在15mg EDC与11mg NHS的混合溶液中浸泡1h；然后将5μL步骤S1获得的产物滴加到电极表面4℃孵育30min；最终用0.01M PBS(pH 7.0)冲洗，4℃保存备用；

S4、将步骤S3制备的丝网印刷电极与便携式电化学工作站相连，浸入装有1mM乙酰胆碱和200μL PBS(0.002M,0.1M NaCl,pH 7.0)溶液的电解池中；将1.0×10^-11M，1.0×10^{- 10}M，1.0×10^-9M，1.0×10^-8M，1.0×10^-7M，1.0×10^-6M六个浓度的呋喃丹标准品分别加入其中，且每加入一种浓度标准品，在10min后采用方波阳极溶出伏安法检测电流信号变化，以分别测出每个浓度标准品所对应的乙酰胆碱电流信号。根据呋喃丹浓度与电流信号变化值之间的关系进行农药的定量检测。该方法对呋喃丹的检测线性范围为1.0×10^-11～1.0×10^-6M(r²＝0.991)；

其中，方波阳极溶出伏安法具体参数设置为：电位扫描范围-0.85–0V，阶跃电位1mV，振幅0.1V，频率25Hz。

S5、为了形成对比，本实施例采用了两组样品进行步骤S4测试。

第一组为某菜市场购买的小白菜样品，此为阴性样品；第二组为从某政府部门购买的小白菜样品，此为阳性样品。将两组样品按照国标要求在检测前进行预处理后，用步骤S4的方式对预处理后的样品液进行检测。直接检测时，第一组样品对乙酰胆碱酯酶催化乙酰胆碱没有明显抑制作用，表明该白菜样品中几乎不含该类农药残留。以该样品处理后得到的样品液为基质，往其中分别加1.0×10^-9和1.0×10^-7M呋喃丹标品进行回收实验，回收率分别为98.5％和110.5％。

直接检测第二组样品，其样品处理液对乙酰胆碱酯酶催化乙酰胆碱有明显抑制作用。根据该样品加入前后电流信号变化值以及步骤S4获得的电流信号与农药浓度关系，得知该样品中呋喃丹浓度为8.68×10^-7M，相当于0.192ppm。此浓度明显高于GB/T 5009.199-2003对蔬菜中呋喃丹的限量(0.05ppm)，表明该样品中农药残留超标。

本文件中，未详细说明的方法、设备等均为常规方法、设备，在此不做赘述。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种果蔬农药残留快速检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1、室温下，通过Cu²⁺、Zn²⁺、AuCl₄ ^-、PtCl₆ ^2-中的一种金属离子与2,4-二巯基-5,6-二氨基嘧啶、2,5-二氨基-1,4-苯二硫醇二盐酸盐以及2,5-二巯基对苯二甲酸中的一种有机配体作用，合成原位包覆有乙酰胆碱酯酶的配位聚合物纳米材料；

S2、在一丝网印刷电极表面采用滴涂法滴加聚酰胺-胺型树枝状高分子溶液，使其在电极表面形成膜；

S3、通过戊二醛或EDC/NHS偶联的方式，将步骤S1获得的纳米材料共价修饰到步骤S2的电极上；

S4、将步骤S3制备的丝网印刷电极与便携式电化学工作站相连，通过方波阳极溶出伏安法检测农药加入前、后乙酰胆碱电流信号的变化，根据农药浓度与电流信号变化值之间的关系完成定量检测，以了解农药浓度与电流信号的关系；

S5、将欲检测的农产品按照国标要求在检测前进行预处理后，用步骤S4的方式，检测经过预处理后的农产品，以获得预处理农产品此时的电流信号，再根据步骤S4所知农药浓度与电流信号关系以及国标中对农药的限量，可判断出预处理后的农产品农药残留是否超标。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤S2中，聚酰胺-胺型树枝状高分子溶液浓度和体积分别为1％和5μL。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤S3中，戊二醛浓度为2％。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤S4中，便携式电化学工作站反应体系中，所用底物为乙酰胆碱，且其浓度为1mM。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤S4中，农药加入10min后再进行乙酰胆碱电流信号检测。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤S4中，方波阳极溶出伏安法具体参数设置为电位扫描范围-0.85–0V，阶跃电位1mV，振幅0.1V，频率25Hz。

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