CN103454426B - 纳米金/壳聚糖-石墨烯-亚甲蓝修饰的免疫传感器的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及纳米金/壳聚糖-石墨烯-亚甲蓝修饰的免疫传感器的制备方法,属于生物传感器技术领域。本发明第一步为壳聚糖-石墨烯-亚甲蓝纳米复合材料的制备,利用壳聚糖-石墨烯-亚甲蓝复合物有很好的电化学氧化还原特性、好的生物相溶性以及高度化学稳定性,修饰电极可促进电子转移;第二步为电沉积纳米金和滴涂壳聚糖-石墨烯-亚甲蓝纳米复合膜共同修饰电极的免疫传感器制备。具大量氨基的纳米复合膜可通过戊二醛共价交联抗体。纳米金有较高比表面积、良好稳定性、导电性和生物相容性,进而增大传感器的响应电流,且沉积过程简单、省时、可控。本发明的免疫传感器,检测时间较短,灵敏度高,选择性、稳定性好,再生能力好,回收率符合要求。
Description
技术领域
本发明提供一种纳米金/壳聚糖-石墨烯-亚甲蓝修饰的免疫传感器的制备方法,属于生物传感器技术领域。
背景技术
我国是一个农业大国,农业发展对国民经济以及人民生活有着举足轻重的作用,而农药是当前农业生产用于防治病、虫、杂草对农作物危害不可缺少的物质,对促进农业增产有着重要的作用。然而,农药的大量使用,在提高农作物产量的同时,其农药残留超标的负面影响也逐渐显现出来。所谓的农药残留是指农药使用后残存于生物体、农副产品和环境中的微量农药原体、有毒代谢物、降解物和杂质的总称。农药残留对食品安全和人体健康构成严重威胁。此外,我国每年因农药残留超标造成的经济损失高达160亿元。随着我国人民生活水平不断提高,农产品的质量安全问题越来越受到关注,尤其果品、蔬菜中农药残留问题已经成为公众关注的焦点。近几年有机磷农药因其种类多、毒性低、环境中持久性低等优点逐渐代替了有机氯而成为农业生产中使用最广泛的一类农药,目前市场前景最广阔、最具潜力的农药是毒死蜱。毒死蜱是一种高效中毒的广谱杀虫剂兼除草剂,具有内吸性,作用迅速,可以通过食物链的富集作用转移至人体,对人体具有潜在致癌作用,一直是环境和食品中农药残留检测的重要项目。加强对农产品中农药残留的检测对保护生态环境,尤其是保障人类健康有着十分深远的意义,建立一种快速、灵敏、安全可靠的农药残留检测分析方法迫在眉睫。
传统的农药残留检测方法主要有:气相色谱(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、色谱/质谱联用技术(GC/LC-MS)、毛细管电泳法(CE)、荧光分析、酶联免疫法(ELISA)。这些方法虽然灵敏、准确、检出限低,可同时检测多种元素或化合物,是检验检疫部门通用的检测方法,但其分析周期长、设备昂贵,并且对分析人员的技术水平要求很高,不利于现场快速检测。我国农药残留的速测方法是酶抑制试纸法和酶抑制分光光度法(农残快速检测仪),可以实现有机磷农药的现场快速检测,具有较好的实用价值。速测卡是通过肉眼观察卡片的颜色变化,因此一般只能用于严重超标的蔬菜样品进行定性测量。酶抑制分光光度法的原理是基于吸光度的变化进行检测的,但蔬菜水果中大量的色素会影响检测结果的准确度。并且上述方法存在回收率低、错检、漏检比例较高、重复性差、难以满足低残留和定量检测的要求等缺点。免疫传感器是将高灵敏的传感器技术与抗原、抗体特异性反应相结合的一种检测方法。既具备了免疫分析的高选择性又兼有电化学分析的高灵敏性,易于实现检测仪器的便携化、微型化和自动化,因此免疫传感器在农药残留检测领域有不少应用。制备免疫传感器的关键是敏感界面的构建,其直接影响生物分子的固定化、免疫传感器的稳定性、灵敏度和选择性等主要性能。
发明的目的在于提供一种能克服上述缺陷以及操作简单、灵敏度高、选择性好的纳米金/壳聚糖-石墨烯-亚甲蓝修饰的免疫传感器的制备方法。
其技术方案为:纳米金/壳聚糖-石墨烯-亚甲蓝修饰的免疫传感器的制备方法,其特征在于:电流型免疫传感器的组装过程为电沉积纳米金(GNPs),滴涂壳聚糖-石墨烯-亚甲蓝纳米复合物,利用戊二醛共价交联毒死蜱单克隆抗体(anti-chlorpyrifos),自组装BSA封闭。
所述的纳米金/壳聚糖-石墨烯-亚甲蓝修饰的免疫传感器的制备方法,其特征在于:玻碳电极(d=3mm)的清洗,免疫传感器敏感界面的构建及过程表征(电沉积纳米金,制备壳聚糖-石墨烯-亚甲蓝纳米复合材料,利用石墨烯-亚甲蓝的协同作用及纳米金共同修饰电极),免疫传感器工作曲线的建立,免疫传感器性能的检测,免疫传感器对实际样品的检测。
所述的纳米金/壳聚糖-石墨烯-亚甲蓝修饰的免疫传感器的制备方法,其特征在于:实验条件的优化,主要包括石墨烯-亚甲蓝的浓度比例、抗体浓度、测试底液的pH、孵育温度以及孵育时间;所制备的电流型免疫传感器的工作曲线为:%ΔI = 0.006 + 15.676 LgC (ng/mL) (R2=0.9902,1-500 ng/mL);免疫传感器性能检测包括重现性、稳定性、特异性、再生性以及免疫传感器对蔬菜样品加标回收率的测定。
其制备原理为:免疫生物传感器以免疫生物分子作为识别元件,通过固定化技术将免疫蛋白结合到感受器表面,发生免疫识别反应后,生成的免疫复合物与产生的物理或化学信号相关联,由换能器将其转化为与待测物质浓度(或活度)有关的可定量或者可处理的物理化学信号,再通过二次仪表放大并且输出信号,从而实现对待测物质的检测。本发明采用电沉积纳米金、滴涂壳聚糖-石墨烯-亚甲蓝纳米复合物对玻碳电极进行修饰。电沉积纳米金具有较高的比表面积、良好的稳定性和导电性,可以增大电极表面电子的转移和生物相容性,进而增大免疫传感器的响应电流,并且沉积过程简单、省时、可控。与碳纳米管相比,石墨烯同样是一种理想的电化学和生物传感材料,它拥有碳纳米管的环境友好、生物兼容性以及活性基团均匀分布等优点,同时,由于含有大量的羧基、羟基等官能团。壳聚糖(CS)属于多糖类,它具有优异的成膜性、吸附性、透气性和渗透性,其丰富的氨基、多孔性结构使它被广泛用于生物分子的固定和修饰电极的制备。采用壳聚糖对石墨烯进行溶解,可增加石墨烯的溶解性能,且成膜后具有很好的吸附性、稳定性和良好的生物相容性。亚甲蓝单体在液相中具有良好的电化学性能,可作为氧化还原指示剂,但其在磷酸盐缓冲液等电解质溶液中易发生聚合。单纯的壳聚糖-石墨烯固定在电极上,循环伏安测试没有明显对称的氧化还原峰。壳聚糖-石墨烯-亚甲蓝复合物有很好的电化学氧化还原特性、好的生物相溶性以及高度的化学稳定性。具有大量氨基的纳米复合膜不仅可以与纳米金通过金氨键固定在电极上,而且可以通过戊二醛共价交联毒死蜱单克隆抗体。采用本发明制成的非标记电流型免疫传感器可以在蔬果采收、上市前,进行农药残留的快速测定,直接对农药残留量是否超标进行检测,避免因食用含有残留农药的蔬果而引起中毒,为农产品安全生产与消费提供残留检测的技术支撑。
为达到以上目的,采取以下技术方案实现:纳米金/壳聚糖-石墨烯-亚甲蓝修饰的免疫传感器的制备方法,其特征在于:(1) 电流型免疫传感器制备前裸玻碳电极的清洗、活化和性能测试,如果测试循环伏安曲线中的峰电位差在120mV以下,氧化峰和还原峰对称,则所述玻碳电极可使用,否则要重新返回清洗步骤中,直到符合要求。(2) 清洗好的裸玻碳电极电沉积纳米金后表面滴涂分散均匀的壳聚糖-石墨烯-亚甲蓝复合液,再经戊二醛共价交联毒死蜱单克隆抗体,最后用牛血清白蛋白(BSA)封闭非特异性结合位点。电流型免疫传感器制备结束后,放入冰箱里4℃保存备用。
为达到以上目的,采取以下技术方案实现:纳米金/壳聚糖-石墨烯-亚甲蓝修饰的免疫传感器的制备方法,其特征在于:(1) 将上述制备好的电流型免疫传感器在工作底液中以不同的扫速做循环伏安方法扫描,可以得到峰值和扫速的关系,得到是受扩散控制的。(2) 配置一系列的毒死蜱标准液,进行循环伏安扫描,得到抑制率,进一步得出上述制备的电流型免疫传感器的工作曲线、检测范围和检测限;(3) 配置一系列经常混合使用的农药溶液,以检测所制备电流型免疫传感器的选择性; 通过循环伏安扫描多段验证上述免疫传感器的稳定性,通过解离和再次免疫检测其再生性能;(5) 对实际果蔬样品进行分析得出该免疫传感器的回收率。
本发明采用电沉积纳米金、滴涂壳聚糖-石墨烯-亚甲蓝纳米复合物进行电极表面的修饰,与传统的自组装纳米金胶的方法相比增大了其稳定性、固定量,形成的金氨体系具有较高的稳定性和高度有序性,增大了传感器的电流响应。壳聚糖-石墨烯-亚甲蓝纳米复合物膜能够促进电化学反应中电子的传递,提高电极上的响应电流,增大电极固定生物分子的比表面积,改善电极表面的微环境,因而可以作为载体材料,用以制备响应信号强和灵敏度高的免疫传感器。且具有大量氨基的纳米复合膜可通过戊二醛共价交联抗体,提高免疫传感器表面抗体的有效固定量,从而增大检测精度。
所述纳米金/壳聚糖-石墨烯-亚甲蓝修饰的免疫传感器的制备工艺如下:(1) 将预处理好的玻碳电极浸入5mL 0.3mM的氯金酸溶液(含有0.1M氯化钾)中,在-0.2V的电压下应用恒电位法电沉积200s。电沉积结束后用PH=7.5的PBS缓冲液冲洗电极表面,氮气吹干;(2) 电极表面晾干后,取7μL壳聚糖-石墨烯-亚甲蓝纳米复合液滴涂在电极表面,常温下静置2h,然后用PH=7.5的PBS缓冲液冲洗,氮气吹干;(3) 将上述经纳米材料修饰好的电极浸入5%的戊二醛溶液中,30min后取出,冲洗吹干;(4) 将电极沉浸在毒死蜱单克隆抗体溶液中,4°C条件下浸泡8-12h,取出后用PBS缓冲液冲洗表面,晾干待用;(4) 最后将上述制备好的电极浸于0.5%的BSA溶液中,室温下静置2h,以封闭非特异性结合位点,取出置于室温下晾干,免疫传感器制作完成,保存在4°C条件下备用。
附图说明
图1 免疫传感器的工作曲线图。
图2 电沉积纳米金的扫描电镜图。
图3 壳聚糖-石墨烯-亚甲蓝的扫描电镜图。
图4免疫传感器修饰过程的循环伏安图。
具体实施方式
实施例:(1) 壳聚糖-石墨烯-亚甲蓝纳米复合膜的制备:将壳聚糖(CS)溶于1.0%的醋酸溶液中,配制成0.5% CS溶液,室温下磁力搅拌至壳聚糖完全溶解,然后用NaOH将混合液的pH值调到5.0。称取10mg石墨烯加入到10mL 0.5% CS溶液中,超声分散8h得到分散均匀的壳聚糖-石墨烯纳米复合液。称取一定量的亚甲蓝粉末溶于乙醇溶液中,配制成1mg/mL的亚甲蓝溶液。再将壳聚糖-石墨烯纳米复合液与亚甲蓝溶液以不同的比例混合,超声至分散均匀、稳定。(2) 玻碳电极的清洗:玻碳电极修饰前,首先浸入热的“piranha”溶液 (H2SO4:30% H2O2 = 3:1)中浸泡15min,用水清洗干净,接下来用0.3μm、30nm的Al2O3浆在麂皮上抛光至镜面,抛光后用去离子水洗去除表面污物,再移入超声水浴中清洗,每次5min,重复二次,然后依次用6mol/L的HNO3、无水乙醇和去离子水超声清洗,氮气环境下干燥。(3) 玻碳电极的活化:彻底清洗后,电极在0.5mol/L H2SO4溶液中用循环伏安法活化,扫描范围1.0V~-1.0V,反复扫描直至达到稳定的循环伏安图为止。(4) 预处理好的玻碳电极的测试:在含有1×10-3 mol/L K3Fe(CN)6的0.20 mol/L KNO3溶液中跑循环伏安曲线,以测试所述玻碳电极的性能,扫描速度50mV/S,扫描范围为-0.1V~0.6V;当所述循环伏安曲线中的峰电位差在80mV以下,并尽可能接近64mV,所述玻碳电极可使用,否则要重新返回步骤(2)中,处理所述玻碳电极,直到符合要求。(5) 将预处理好的玻碳电极浸入5mL 0.3mM的氯金酸溶液(含有0.1M氯化钾)中,在-0.2V的电压下应用恒电位法电沉积200s。电沉积结束后用PH=7.5的PBS缓冲液冲洗电极表面,氮气吹干。(6) 电极表面晾干后,取7μL分散均匀的壳聚糖-石墨烯-亚甲蓝纳米复合液滴涂在电极表面,常温下静置2h,然后用PH=7.5的PBS缓冲液冲洗,氮气吹干。(7) 将上述经纳米材料修饰好的电极浸入5%的戊二醛溶液中,30min后取出,冲洗吹干。(8) 将上述电极沉浸在毒死蜱单克隆抗体溶液中,4°C条件下浸泡8-12h,取出后用PBS缓冲液冲洗表面,晾干待用。(9) 最后将上述制备好的电极浸入0.5%的BSA溶液中室温下静置2h,以封闭电极上非特异性结合位点,取出置于室温下晾干,免疫传感器制作完成,保存在4°C条件下备用。(10) 从壳聚糖-石墨烯与亚甲蓝的浓度比例、抗体浓度、测试底液pH、孵育温度和孵育时间五方面对所制备的免疫传感器的实验条件进行优化,壳聚糖-石墨烯与亚甲蓝的浓度比例为0.5:1-3:1,抗体浓度的范围为1ng/mL-100μg/mL,pH的范围为5.0-8.5,孵育温度的范围为4-50°C,孵育时间的范围为5-50min。(11) 配置1-500 ng/mL的毒死蜱标准溶液,将上述制备好的免疫传感器分别浸入不同浓度的毒死蜱标准溶液,在常温下孵育35min,检测免疫反应前后电流变化得到其工作曲线。(12) 将免疫传感器在久效磷、西维因、克百威、3-羟基克百威等干扰物存在的情况下对200ng/mL的毒死蜱进行测试,以检测其选择性;选5根于相同条件下制备好的免疫传感器检测其重现性;连续7天依次检测相同浓度的毒死蜱溶液以检测其稳定性;将免疫后的传感器用甘氨酸-HCl缓冲液(pH2.8)解离毒死蜱农药5min后再次免疫,检测其再生能力。(13) 把蔬菜彻底清洗干净并用去离子水清洗3次,喷洒上一定浓度的农药,放置24h后,用10mL丙酮/ 0.1M pH7.5 磷酸盐缓冲溶液(1/9,v/v)做溶剂超声处理20min,然后再离心10min (10000 rpm),得到的上清液用来检测实际样品的回收率,其回收率可以达到86.0%-105.1%。
此种电流型免疫传感器检测毒死蜱农药残留的检测方法操作工艺简单,检测时间较短,检测农药浓度范围广,灵敏度高,稳定性好,再生能力高以及对实际样品分析有较好的回收率和重现性,符合我国农药残留快速检测技术发展和国际化要求。
Claims (1)
1.纳米金/壳聚糖-石墨烯-亚甲蓝修饰的免疫传感器的制备方法,其特征在于:壳聚糖-石墨烯-亚甲蓝纳米复合物的制备,制备步骤为:
将壳聚糖溶于1.0%的醋酸溶液中,配制成0.5%壳聚糖溶液,室温下磁力搅拌至壳聚糖完全溶解,然后用NaOH将混合液的pH值调到5.0,称取10mg石墨烯加入到10mL 0.5%壳聚糖溶液中,超声分散8h得到分散均匀的壳聚糖-石墨烯纳米复合液,称取一定量的亚甲蓝粉末溶于乙醇溶液中,配制成1mg/mL 的亚甲蓝溶液,再将壳聚糖-石墨烯纳米复合液与亚甲蓝溶液以不同的比例混合,超声至分散均匀、稳定,经实验验证,石墨烯与亚甲蓝比例为2:1时,电流响应最强,且修饰电极表面信号最稳定;
将预处理好的玻碳电极浸入含有0.1M氯化钾5mL 0.3mM的氯金酸溶液中,在-0.2V的 电压下应用恒电位法电沉积200s,电沉积结束后用pH=7.5的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面,氮气吹干;电极表面晾干后,取7μL壳聚糖-石墨烯-亚甲蓝纳米复合液滴涂在电极表面,常温下静置2h,然后用pH=7.5的磷酸盐缓冲液冲洗,氮气吹干;将上述经纳米材料修饰好的电极浸入5%的戊二醛溶液中,30min后取出,冲洗吹干;将电极沉浸在毒死蜱单克隆抗体溶液中,4℃条件下浸泡8-12h,取出后用磷酸盐缓冲液冲洗表面,晾干待用;最后将上述制备好的电极浸于0.5%的牛血清蛋白溶液中,室温下静置2h,以封闭非特异性结合位点,取出置于室温下晾干,免疫传感器制作完成,保存在4℃条件下备用。
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