CN102998348A - 一种脱氢酶型电化学生物传感器制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种电化学生物传感器制备方法,尤其涉及一种脱氢酶型电化学生物传感器的制备方法。本发明通过将传感器制备过程中的电极修饰所需要的全部组分(包括碳纳米材料、电子介体、高分子聚合物、脱氢酶、辅酶和缓冲液)制备成为一种纳米生物复合材料,并将该复合材料通过简单的一步滴涂法修饰到丝网印刷电极表面,制备脱氢酶型电化学生物传感器。本方法简化了脱氢酶型传感器的制备工艺,适用于批量生产,减小了批内、批间差异,提高了检测的灵敏度、准确性和存储稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及一种电化学生物传感器的制备方法,尤其涉及脱氢酶型生物传感器的制备方法。
背景技术
随着社会发展的日新月异和人们生活水平的显著提高,传统的临床检验模式,由于存在:标本从采集到检测前缺乏有效的分析前质量控制,标本检测周期较长,对仪器的依赖程度较高等不足,已然不能满足人们越来越高涨的健康评估需求。随着科技的突飞猛进,POCT(Point of Care Test)产业焕发出了新生的活力。由于具有检测快速、操作简单易学、检测成本低廉的突出优点,POCT在临床检验效能中所占的比重越来越大。近年来,POCT领域中的一个重要分支,电化学生物传感器,作为一种现场定量检测标本的新技术,能够有效地弥补干化学试纸条和金标条只能定性、不能定量的不足,因而受到了国内外科技工作者的广泛关注。
电化学生物传感器的基本原理是将生物识别层修饰到工作电极的表面,通过生物识别层与样本中的底物发生特异性氧化还原反应,从而产生可检测的电化学信号,直接或间接反映待测底物的浓度。
脱氢酶系统是生物体内重要的新陈代谢系统,约有300种脱氢酶参与生命的运作。通过脱氢酶与特异的底物发生氧化还原反应,我们可以定量评估该特异的底物在体内的分布和代谢情况,进而直观地了解生命健康状况。反应模型以如下方程式表示:
比如,基于葡萄糖脱氢酶检测血糖含量,用于诊断糖尿病及评估治疗效果;又如,基于乳酸脱氢酶检测血乳酸含量,用于评估患者缺氧情况,便于医师采取有效地治疗措施。在脱氢酶系统中,氧化还原反应需要氧化型辅酶NAD+或NADP+的参与,生成还原型辅酶NADH或NADPH。研究发现,还原型辅酶NADH或NADPH是电活性物质,在一定的激发电压下,可氧化产生电流,此现象为脱氢酶型电化学生物传感器的研发奠定了理论基础。
然而,电化学生物传感器检测NADH或NADPH,面临着一些难点:(1)在电极表面直接氧化NADH或NADPH的过电位较高,导致电极容易因吸附反应产物而钝化和受到其他电活性物质(比如,抗坏血酸、尿酸、儿茶酚胺、多巴胺以及一些药物分子)的干扰,检测结果的准确性难以保证;(2)制备的传感器检测NADH或NADPH的灵敏度不高,导致传感器对目标物的检测敏感度不够,难以识别低浓度的目标分子;(3)目前,文献中报道的关于脱氢酶型传感器的制备方法往往包括多步修饰(Talanta.2012,99:697-702;Sensors.2010,10:748-764;Analytical Biochemistry.2012,425:36-42),或者是辅酶未预先修饰到电极表面(Electroanalysis.2010,22:1707-1716;Biosensors and Bioelectronics.2012,33:100-105),而是作为试剂与待测标本混合后才用于检测。虽然这些方法能够一定程度上提高传感器的性能,但也导致所制备的生物传感器未能充分体现检测快速,操作简单、现场检测的优点。
碳纳米材料,具有独特的电化学性质和物理性质,比如,高效的电催化活性、高比表面积、宏观量子隧道效应和优良的生物相容性,在电化学传感器领域具有广泛的应用价值。碳纳米材料作为传感器的电极修饰材料,能够明显地提高传感器检测的灵敏度和线性范围,并且极大地降低还原型辅酶NADH或者NADPH在电极表面氧化的过电位,有效地避免了一些电活性物质,比如尿酸、儿茶酚胺、多巴胺的干扰。但是,抗坏血酸的干扰却未能有效消除,使得传感器的准确性和实用性仍然面临巨大挑战(Electroanalysis.2011,23:842-849)。研究发现,一些电子介体,如麦尔多拉蓝、亚甲蓝、亚甲绿等,能特异的与NADH或者NADPH形成复合物,进而实现低电位检测NADH或者NADPH,而不受其他电活性物质的干扰。然而,这些电子介体为水溶性分子,常规包埋的方法不能有效地使其固定在电极的表面而不发生丢失,导致电化学信号很不稳定。文献已经报道通过电聚合的方法能高效地固定电子介体(Talanta.2000,51:187-195;Journal of Solid State Electrochemistry.2008,12:175-180),但电聚合的方法增加电子介体消耗,增加传感器的制备步骤,增大传感器的批内、批间差异。此外,利用碳纳米材料或阴离子型聚合物直接吸附电子介体也有文献报道。例如,Zhu等将N,N-二甲基甲酰胺分散的羧基化碳纳米管修饰到玻碳电极表面,然后将其浸入麦尔多拉蓝溶液中,吸附一段时间,得到了碳纳米管/麦尔多拉蓝修饰电极,该传感器对还原型辅酶NADH表现出高的灵敏度和宽的线性范围(Biosensors and Bioelectronics.2007,22:2768-2773);zheng等将碳纳米管/纳米金/Nafion-117复合膜修饰的丝网印刷电极浸入麦尔多拉蓝溶液中一段时间,得到了碳纳米管/纳米金/麦尔多拉蓝/Nafion-117复合膜修饰电极,并用该复合膜电极成功制备乙醇脱氢酶型传感器,得到的电极表现出优良的稳定性和准确性(ForensicScience International.2011,207:177-182),但这两种方法同样表现出电极修饰步骤较多,无法对传感器进行快速批量生产的不足。
发明内容
本发明的目的是提供一种可用于批量生产脱氢酶型电化学生物传感器的快速制备方法。
本发明是通过以下技术方案来实现的:
(1)将碳纳米材料超声分散于高分子聚合物中,得到均匀分散的碳纳米材料悬液后,加入电子介体,混匀后过夜,再加入脱氢酶、辅酶和缓冲液,再次混匀,即得到修饰电极所需的纳米生物复合材料;
(2)将制备的纳米生物复合材料滴涂到丝网印刷电极的工作电极表面,4摄氏度避光晾干,即得脱氢酶型电化学生物传感器。
所述碳纳米材料包括单壁碳纳米管、多壁碳纳米管、有序介孔碳或石墨烯中的一种或几种。
所述电子介体包括麦尔多拉蓝、亚甲蓝、新亚甲蓝或亚甲绿中的一种或几种。
所述高分子聚合物为壳聚糖。
所述脱氢酶包括葡萄糖脱氢酶、乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、a-羟丁酸脱氢酶或异柠檬酸脱氢酶中的一种。
所述辅酶包括氧化型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)或氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADP+)的一种或两种。
所述纳米生物复合材料的pH值为6.0~6.5。
所述缓冲液包括醋酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中的一种或几种。
所述丝网印刷电极为2电极体系或3电极体系中的一种。
本发明中,制备纳米生物复合材料所使用的材料均行使着不同的作用和功能:高分子聚合物作为碳纳米材料的分散剂和脱氢酶的固定剂;碳纳米材料作为信号放大材料和电子介体的固定载体;电子介体作为还原型辅酶NADH的高效识别分子来实现低电位检测;缓冲液作为稳定剂来稳定酶、辅酶和电子介体的活性。本发明通过科学、合理地制备纳米生物复合材料,用于一步滴涂的方法构建脱氢酶型电化学生物传感器,从而简化脱氢酶型生物传感器的制备工艺,提高存储稳定性和检测准确性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明,应该理解的是,以下实施例仅用于例证的目的,绝不限制本发明的保护范围。
本发明以乙醇脱氢酶型生物传感器为例,详细介绍脱氢酶型生物传感器的制备方法。
按以下成分和用量配置纳米生物复合材料,并用于制备乙醇脱氢酶型生物传感器:
石墨化介孔碳(Sigma) 2mg/ml,
麦尔多拉蓝(Sigma) 0.1mM,
壳聚糖(Sangon) 0.5wt.%,
乙醇脱氢酶(Sigma) 4mg/ml,
辅酶NAD+(BBI) 4mM,
Tris-HCl缓冲液(Beyotime) 50~200mM;
纳米生物复合物制备步骤及乙醇传感器的制备如下:
1)在搅拌状态下,将500mg壳聚糖溶于50ml 50mM的HCl溶液中,得壳聚糖/HCl溶液;
2)用1M Tris调节步骤1)中的壳聚糖/盐酸溶液的PH到6.0~6.5,得壳聚糖/Tris-HCl溶液,此时Tris-HCl的浓度为50~100mM;
3)将4mg有序介孔碳加入1ml步骤2)得到的壳聚糖/Tris-HCl溶液中,超声分散20分钟,得壳聚糖/Tris-HCl/有序介孔碳纳米复合材料;
4)将10μl 20mM的麦尔多拉蓝水溶液加入步骤3)得到的纳米复合材料中,混匀后,4摄氏度过夜,得壳聚糖/Tris-HCl/有序介孔碳/亚甲蓝纳米复合材料;
5)将50μl 16mg/ml乙醇脱氢酶/Tris-HCl溶液(100mM,pH 6.0)和50μl 16mM辅酶NAD+/Tris溶液(用1M Tris调节辅酶NAD+水溶液的PH值到6.0)加入100μl步骤4)得到的纳米复合材料中混匀,得到修饰电极所需的纳米生物复合材料;
6)将5μl步骤5)中制备好的纳米生物复合材料滴涂到3电极丝网印刷电极的工作电极(直径3mm,面积0.071cm2,Deltabiotech,上海)表面,4摄氏度晾干,避光保存。
7)在30摄氏度的恒温条件下,10μl不同浓度的乙醇/Tris-HCl溶液(0.1M,pH 8.0)、0.5mM抗坏血酸/Tris-HCl溶液(0.1M,pH 8.0)和0.5mM尿酸/Tris-HCl溶液(0.1M,pH8.0)滴加到丝网印刷电极的表面,用工作电位为-0.15V的计时电流法进行检测,在30秒处读取数据。
结果显示,本传感器检测乙醇浓度的线性范围为0.5-15mM;0.5mM抗坏血酸和0.5mM尿酸对乙醇信号的干扰均小于2%;传感器的批内、批间差异均小于5%(批内差异是通过平行制备10个电极对5mM乙醇的检测进行评价;批间差异是通过制备5批纳米生物复合材料并制备传感器对5mM乙醇的检测进行评价),所制备的传感器保存40天后,对5mM乙醇的响应信号为新制备的传感器响应信号的91%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,对本发明而言仅仅是说明性的,而不是限制性的。本专业技术人员理解,在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变,修改,甚至等效,但都落入本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种脱氢酶型电化学生物传感器制备方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)将碳纳米材料超声分散于高分子聚合物中,得到均匀分散的碳纳米材料悬液后,加入电子介体,混匀后过夜,再加入脱氢酶、辅酶和缓冲液,再次混匀,即得到修饰电极所需的纳米生物复合材料;
(2)将制备的纳米生物复合材料滴涂到丝网印刷电极的工作电极表面,4摄氏度避光晾干,即得脱氢酶型电化学生物传感器。
2.根据权利要求1所述的脱氢酶型电化学生物传感器制备方法,其特征在于:所述碳纳米材料包括单壁碳纳米管、多壁碳纳米管、有序介孔碳或石墨烯中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的脱氢酶型电化学生物传感器制备方法,其特征在于:所述电子介体包括麦尔多拉蓝、亚甲蓝、新亚甲蓝或亚甲绿中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的脱氢酶型电化学生物传感器制备方法,其特征在于:所述高分子聚合物为壳聚糖。
5.根据权利要求1所述的脱氢酶型电化学生物传感器制备方法,其特征在于:所述脱氢酶包括葡萄糖脱氢酶、乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、a-羟丁酸脱氢酶或异柠檬酸脱氢酶中的一种。
6.根据权利要求1所述的脱氢酶型电化学生物传感器制备方法,其特征在于:所述辅酶包括氧化型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)或氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADP+)的一种或两种。
7.根据权利要求1所述的脱氢酶型电化学生物传感器制备方法,其特征在于:所述纳米生物复合材料的pH值为6.0~6.5。
8.根据权利要求1所述的脱氢酶型电化学生物传感器制备方法,其特征在于:所述缓冲液包括醋酸-醋酸钠缓冲液、Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中的一种或几种。
9.根据权利要求1所述的脱氢酶型电化学生物传感器制备方法,其特征在于:所述丝网印刷电极为2电极体系或3电极体系中的一种。
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