CN108572209A - 电化学生物传感器用电极及其制备方法、电化学生物传感器及其应用 - Google Patents

电化学生物传感器用电极及其制备方法、电化学生物传感器及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及葡萄糖和/或乳酸的浓度检测领域，公开了电化学生物传感器用电极及其制备方法、电化学生物传感器及其应用。电化学生物传感器用电极，包括基底电极，以及形成于基底电极表面的修饰层，所述修饰层为含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的复合层。本发明的电化学生物传感器用电极的制备方法简便。将本发明的电化学生物传感器用电极作为工作电极时，制备得到的电化学生物传感器能够直接用于检测生物活体、离体样品的葡萄糖和/或乳酸的浓度测定与分析，能够实现对葡萄糖和/或乳酸的高选择性、高灵敏度检测，且两组分之间无干扰。

Description

电化学生物传感器用电极及其制备方法、电化学生物传感器 及其应用
技术领域
本发明涉及葡萄糖和/或乳酸的浓度检测领域，具体涉及电化学生物传感器用电极及其制备方法、包括上述电化学生物传感器用电极的电化学生物传感器，以及上述电化学生物传感器在检测生物活体、离体样品的葡萄糖和/或乳酸浓度中的应用。
背景技术
自1962年Clark首次提出“酶电极”概念，生物传感器的研究在随后的半个世纪取得了日新月异的发展。电分析化学对脑神经化学过程的研究有着重要作用，而选择性对电化学方法至关重要。酶对于底物的专一性催化作用为选择性优异的电化学分析方法提供了可能性。
然而生物活体检测环境较为复杂，例如脑内存在很多电化学活性干扰物质，如抗坏血酸，因此，在较低的电位下高选择性地检测葡萄糖和/或乳酸依然是一个巨大的挑战。
在现有的研究中，抗坏血酸氧化酶常常被用来消除在测试过程中抗坏血酸对葡萄糖和/或乳酸的干扰，例如，“Layer-by-Layer Construction of Enzyme Multilayers onan Electrode for the Preparation of Glucose and Lactate Sensors:Eliminationof Ascorbate Interference by Means of an Ascorbate Oxidase Multilayer”(Anzai,J.；Takeshita,H.；Kobayashi,Y.；Osa,T.；Hoshi,T.《Analytical Chemistry》，1998年，70卷,p.811)公开了固定抗坏血氧化酶的方法，将葡萄糖氧化酶，乳酸氧化酶和抗坏血酸氧化酶逐层修饰在铂电极表面，可以有效排除抗坏血酸对于检测葡萄糖和/或乳酸的干扰，从而优化了电化学生物传感器用电极对葡萄糖和/或乳酸检测的选择性。
此外，还有一些方法也被应用于克服抗坏血酸的干扰，“Electrochemicalglucose biosensors”(Wang,J.《Chemical Reviews》，2008年，108卷，p.814)利用电子媒介体方法。“Selectivity enhancement for glutamate with a Nafion/glutamate oxidasebiosensor”(Pan,S.；Arnold,A.《Talanta》，1996年，43卷，p.1157)和“Electrochemicalbehavior and electrocatalytic study of the methylene green coated on modifiedsilica gel”(Pravda,M.；Kauffmann,J.；Michotte,Y.《Electroanalysis》，2000年，12卷，p.913)公开了在电极的修饰层上额外修饰各种膜的方法，前者公开了在基于谷氨酸氧化酶生物传感器上修饰阴离子聚合物膜Nafion有效排除了带负电的干扰物如抗坏血酸和二羟基苯乙酸等的干扰，后者公开了在修饰有葡萄糖氧化酶的铂电极上在苯酚中恒电位下得到一层电聚合的聚苯酚膜，可以有效排除抗坏血酸的干扰，从而达到对葡萄糖的高选择性检测；“Layer-by-layer assembled carbon nanotubes for selective determination ofdopamine in the presence of ascorbic acid”(Zhang,M；Gong,K；Zhang,H；Mao,L.《Biosensors and Bioelectronics》，2005年，20卷，p.1270)公开了将修饰电极材料进行预处理的方法，具体为将硝酸和硫酸混酸处理的碳纳米管与带正电的聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)通过静电作逐层组装在基底电极上，利用碳纳米管对抗坏血酸的催化性质，实现了在抗坏血酸存在下对多巴胺的检测。
但是上述方法均不能利用电极直接进行生物活体、离体样品的葡萄糖和/或乳酸浓度的检测，往往需要通过额外添加抗坏血酸氧化酶、在电极的修饰层上进行额外修饰或增加电极预处理的步骤等来排除抗坏血酸等干扰物质的干扰，方法繁琐，检测成本高。
发明内容
本发明的目的是为了解决由现有电极作为工作电极时，制备得到的电化学生物传感器不能直接进行生物活体、离体样品的葡萄糖和/或乳酸浓度的检测的问题，提供电化学生物传感器用电极及其制备方法、电化学生物传感器及其应用，本发明的电化学生物传感器用电极的制备方法简便。将本发明的电化学生物传感器用电极作为工作电极时，制备得到的电化学生物传感器能够直接用于检测生物活体、离体样品的葡萄糖和/或乳酸的浓度测定与分析，能够实现对葡萄糖和/或乳酸的高选择性、高灵敏度检测，且两组分之间无干扰。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种电化学生物传感器用电极，其中，该电极包括基底电极，以及形成于基底电极表面的修饰层，所述修饰层为含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的复合层。
优选地，以1cm2的基底电极计，所述修饰层中含有5-180μg石墨炔。
优选地，所述石墨炔的平均粒径为5-10μm。
优选地，以1cm2的基底电极计，所述修饰层中含有1-20μg催化剂。
优选地，所述催化剂为亚甲基绿、亚甲基蓝、亮甲酚蓝和甲苯胺蓝中的一种或多种。
优选地，所述脱氢酶为葡萄糖脱氢酶或乳酸脱氢酶。
优选地，以1cm2的基底电极计，所述修饰层中含有5-20U葡萄糖脱氢酶。
优选地，以1cm2的基底电极计，所述修饰层中含有15-30U乳酸脱氢酶。
优选地，所述基底电极为玻碳电极、金电极、铂电极或碳纤维电极。
本发明第二方面提供了上述的电化学生物传感器用电极的制备方法，包括以下步骤：
(1)将石墨炔与催化剂水溶液进行混合、离心、洗涤和第一干燥，得到石墨炔和催化剂的混合物；
(2)将所述混合物与脱氢酶水溶液进行混合，得到含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的分散液；
(3)将所述分散液滴涂到基底电极表面并进行第二干燥，得到电化学生物传感器用电极，其中，所述电极包括形成于基底电极表面的包含石墨炔、催化剂和脱氢酶的修饰层。
本发明第三方面提供了一种电化学生物传感器，该传感器包括上述的电化学生物传感器用电极。
本发明第四方面提供了上述的电化学生物传感器在检测生物活体、离体样品的葡萄糖和/或乳酸浓度中的应用。
本发明通过使用石墨炔可以实现电化学生物传感器用电极对于生物活体、离体样品中的葡萄糖浓度和/或乳酸的基础浓度，以及生理、病理过程中葡萄糖和/或乳酸动态变化的检测。本发明制备的电化学生物传感器用电极能够实现对葡萄糖和/或乳酸的高选择性、高灵敏度检测，且两者之间无干扰。例如，在电位为0.0V，参比电极为Ag/AgCl电极(vs.Ag/AgCl)时，对鼠脑内常见的电化学活性小分子，如抗坏血酸等无响应。微透析活体在线电化学分析方法所记录的电流动态变化是由葡萄糖和/或乳酸的催化氧化引起的，说明本发明建立的生物传感器在应用于活体在线电化学分析方法时具有良好的选择性。
本发明的电化学生物传感器用电极可以为更好地研究生理和病理现象提供可靠的数据。
附图说明
图1是石墨炔的结构图；
图2a是测试例1-1的以2μL/min的流速注入葡萄糖，不同时间下的葡萄糖浓度与电流响应图；
图2b是测试例1-1的葡萄糖浓度与电流响应的线性关系图；
图2c是测试例1-1的以2μL/min的流速注入乳酸钠，不同时间下的乳酸钠浓度与电流响应图；
图2d是测试例1-1的乳酸钠浓度与电流响应的线性关系图；
图3a是测试例2-1的不同时间下注入葡萄糖和干扰物质后电流响应图；
图3b是测试例2-1的本发明的电化学生物传感器用电极作为工作电极时，对于干扰物质的电流响应图；
图3c是测试例2-1的不同时间下注入乳酸和干扰物质后电流响应图；
图3d是测试例2-1的本发明的电化学生物传感器用电极作为工作电极时，对于干扰物质的电流响应图；
图4a是测试例3-1的电化学生物传感器用电极作为工作电极时，对于抗坏血酸干扰物质的电流响应图；
图4b是测试例3-2的电化学生物传感器用电极作为工作电极时，对于抗坏血酸干扰物质的电流响应图；
图5测试例4-1的微透析-在线电化学体系下，本发明的电化学生物传感器用电极作为工作电极时，对葡萄糖和乳酸的电流响应图；
图6是测试例5-1的以2μL/min的流速注入乳酸和葡萄糖，不同时间下的乳酸和葡萄糖浓度与电流响应图。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明第一方面提供了一种电化学生物传感器用电极，其中，该电极包括基底电极，以及形成于基底电极表面的修饰层，所述修饰层为含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的复合层。
在本发明中，以1cm2的基底电极计，所述修饰层中可以含有5-180μg石墨炔。在该范围内的石墨炔，抗干扰效果最佳。在检测葡萄糖和/或乳酸时，具有较好的灵敏度和选择性。在本发明中，所述石墨炔的结构为本领域常规的结构，如图1所示。
在本发明中，所述石墨炔的平均粒径可以为本领域常规的粒径，在优选的情况下，平均粒径为5-10μm。
在本发明中，以1cm2的基底电极计，所述修饰层中可以含有1-20μg催化剂。该范围内的催化剂能够较好地对葡萄糖和/或乳酸进行催化氧化，从而使本发明制备的电化学生物传感器用电极能够实现对葡萄糖和/或乳酸的高选择性、高灵敏度检测。
在本发明中，所述催化剂以能够催化葡萄糖和/或乳酸的催化氧化反应为目的，例如可以为但不限于：亚甲基绿、亚甲基蓝、亮甲酚蓝和甲苯胺蓝中的一种或多种。
在本发明中，所述脱氢酶以能够使葡萄糖或乳酸进行氧化还原反应目的，例如可以为葡萄糖脱氢酶或乳酸脱氢酶。选择脱氢酶时仅选择一种脱氢酶。例如，当待测物(即底物)为葡萄糖时，所述脱氢酶为葡萄糖脱氢酶，制备得到用于检测葡萄糖的电化学生物传感器用电极；当待测物(即底物)为乳酸时，所述脱氢酶为乳酸脱氢酶，制备得到用于检测乳酸的电化学生物传感器用电极。在检测时，可以同时使用用于检测葡萄糖的电化学生物传感器用电极和用于检测乳酸的电化学生物传感器用电极，也可以单独使用，针对检测需要，测量葡萄糖和/或乳酸的浓度。
在本发明中，以1cm2的基底电极计，所述修饰层中可以含有5-20U葡萄糖脱氢酶。小于5U的葡萄糖脱氢酶无法与生物活体、离体样品的中的葡萄糖进行充分的反应，而大于20U的葡萄糖脱氢酶无法有效固定在电极表面。
在本发明中，以1cm2的基底电极计，所述修饰层中可以含有15-30U乳酸脱氢酶。同样，小于15U的乳酸脱氢酶无法与生物活体、离体样品中的乳酸进行充分的反应，而大于30U的乳酸脱氢酶无法有效固定在电极表面。
在本发明中，所述基底电极可以为但不限于：玻碳电极、金电极、铂电极或碳纤维电极。所述基底电极具有化学稳定性高，热胀系数小、硬度高等特点。
本发明第二方面提供了上述的电化学生物传感器用电极的制备方法，包括以下步骤：
(1)将石墨炔与催化剂水溶液进行混合、离心、洗涤和第一干燥，得到石墨炔和催化剂的混合物；
(2)将所述混合物与脱氢酶水溶液进行混合，得到含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的分散液；
(3)将所述分散液滴涂到基底电极表面并进行第二干燥，得到电化学生物传感器用电极，其中，所述电极包括形成于基底电极表面的包含石墨炔、催化剂和脱氢酶的修饰层。
根据本发明的方法，所述石墨炔的平均粒径可以为本领域常规的粒径，在优选的情况下，平均粒径为5-10μm。石墨炔的制备方法可以为本领域常规的方法，例如可以参考“Architecture of graphdiyne nanoscale films”(Li,G.；Li,Y.；Liu,H.；Guo,Y.；Li,Y.；Zhu,D.《Chemical Communications》，2010年,46卷,p.3256)进行制备。
根据本发明的方法，所述催化剂可以为但不限于：亚甲基绿、亚甲基蓝、亮甲酚蓝和甲苯胺蓝中的一种或多种。所述催化剂以能够催化葡萄糖和/或乳酸的催化氧化反应为目的。
根据本发明的方法，所述脱氢酶以能够使葡萄糖或乳酸进行氧化还原反应目的，例如可以为葡萄糖脱氢酶或乳酸脱氢酶。在制备过程中，针对待测物进行选择，例如测定葡萄糖浓度，则选择葡萄糖脱氢酶，制备得到用于检测葡萄糖的电化学生物传感器用电极；例如测定乳酸，则选择乳酸脱氢酶，用于检测乳酸的电化学生物传感器用电极。在具体的检测过程中，可以同时检测葡萄糖和乳酸，也可以仅检测葡萄糖或乳酸。
根据本发明的方法，石墨炔、催化剂和脱氢酶的投料量满足在电化学生物传感器用电极中，以1cm2的基底电极计，所述修饰层中含有5-180μg石墨炔，1-20μg催化剂和5-20U葡萄糖脱氢酶或15-30U乳酸脱氢酶。
根据本发明的方法，所述第一干燥的条件可以包括但不限于：干燥的温度为15-60℃，干燥的时间为10-20min。优选在室温下进行。
根据本发明的方法，在步骤(1)中，所述洗涤的液体可以为二次水、去离子水等，洗涤的目的在于除去未吸附的催化剂。
根据本发明的方法，所述第二干燥的条件可以包括但不限于：干燥的温度为0-4℃，干燥的时间为60-90min。干燥温度超过4℃和低于0℃，对于酶活性都有一定影响。
本发明第三方面提供了一种电化学生物传感器，该传感器包括上述的电化学生物传感器用电极。
具体地，该电化学生物传感器可以包括：上述的电化学生物传感器用电极、对电极、参比电极和电化学工作站，其中，上述的电化学生物传感器用电极作为工作电极。
本发明第四方面提供了上述的电化学生物传感器在检测生物活体、离体样品的葡萄糖和/或乳酸浓度中的应用。
例如，可以用于检测生物活体的脑内、血液、汗液等的葡萄糖和/或乳酸的浓度，还可以用于检测离体样品的葡萄糖和/或乳酸的浓度。其中，生物活体检测是指针对有生命的生物体的在线检测，例如：在线检测生物活体脑内的葡萄糖和/乳酸的浓度。离体样品检测是指针对离开生物体的样品检测，例如针对某容器中的血液(已经离开生物体的血液)进行葡萄糖和/或乳酸的检查。
检测方法例如，对工作电极施加0.0V(vs.Ag/AgCl)的电压，待背景电流稳定后，在大鼠清醒或麻醉状态下对鼠脑内葡萄糖和乳酸的基础浓度进行同时检测。根据葡萄糖、乳酸浓度对应响应电流绘制的拟合曲线，从而计算得到大鼠脑内葡萄糖、乳酸基础浓度。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
所用的葡萄糖脱氢酶(GDH)购于SIGMA-ALDRICH，商品目录号为：19359。
所用乳酸脱氢酶(LDH)购于SIGMA-ALDRICH，商品目录号为：L1254。
所要玻碳电极购自上海辰华(产品编号GC160)，双通道薄层流动电解池(型号CHI130，含参比电极和玻碳工作电极)。
碳纳米管购自深圳市纳米港有限公司，货号为MWNT-10。
石墨烯购自阿拉丁公司，货号为G139798-250mg。
制备例1
制备石墨炔：
参考“Architecture of graphdiyne nanoscale films”(Li,G.；Li,Y.；Liu,H.；Guo,Y.；Li,Y.；Zhu,D.《Chemical Communications》2010年,46卷,p.3256)进行制备。
首先将0.4mL四丁基氟化铵加入15mL含有43.6mg(0.066mmol)六(三甲硅基乙炔基)苯的四氢呋喃溶液中，在8℃下搅拌10分钟，所得溶液用乙酸乙酯萃取，合并有机层，并用20％的食盐水、二次水洗净，用无水Na2SO4干燥，在真空条件下移除溶液，可以得到六炔基苯单体。将9.08mg所得六炔基苯单体溶解于25mL吡啶，在氮气氛围条件下，于铜基底上60℃下交叉偶联反应72小时生长得到石墨炔固体薄膜。将所述生长石墨炔的铜箔用丙酮冲洗，并且在80℃的N,N-二甲基甲酰胺中超声1小时以得到黑色粉末。将所得黑色粉末在100℃下分别依次在4mol/L的NaOH，6mol/L的HCl和4mol/L的NaOH中回流2小时，以除去杂质和残留的铜。所得黑色固体依次用80℃的N,N-二甲基甲酰胺和70℃的乙醇离心洗涤，在真空下干燥，即可得到石墨炔固体粉末。
实施例1
(1)制备石墨炔和催化剂的混合物
将4mg石墨炔粉末(制备例1得到)与2mL的1mmol/L亚甲基绿水溶液混合超声5小时得到分散均匀的分散液。将所得分散液离心(1500rpm，5min)并且用二次水冲洗以除去未吸附的亚甲基绿，从而得到石墨炔和催化剂复合物，室温下干燥20min，得到石墨炔和催化剂固体。将2mg的石墨炔和催化剂固体分散至1mL二次水中，室温下连续超声(超声功率为100W，频率为50Hz)2小时后，得到分散均匀的石墨炔和催化剂(亚甲基绿)混合物(2mg/mL)。
(2)制备含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的分散液
将上述混合物与10mg/mL的葡萄糖脱氢酶水溶液(272U/mL)以体积比1:1进行混合，于旋涡混合仪上振荡5min，得到含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的分散液。
(3)制备电化学生物传感器用电极
取5μL的上述含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的分散液滴涂到玻碳电极上，0℃下干燥90min，即得到电化学生物传感器用电极，其中，所述电极包括形成于基底电极表面的包含石墨炔、催化剂和脱氢酶的修饰层。以1cm2的基底电极计，所述修饰层中含有100μg石墨炔，10μg催化剂和10U葡萄糖脱氢酶。
由于制备过程中使用的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶，该电化学生物传感器用电极可以用于检测生物活体、离体样品的葡萄糖的浓度。
实施例2
(1)制备石墨炔和催化剂的混合物
将2mg石墨炔粉末(制备例1得到)与2mL的0.5mmol/L亚甲基蓝水溶液混合超声5小时得到分散均匀的分散液。将所得分散液离心(1500rpm，5min)并且用二次水冲洗以除去未吸附的亚甲基蓝，从而得到石墨炔和催化剂复合物，60℃下干燥10min，得到石墨炔和催化剂固体。将2mg的石墨炔和催化剂固体分散至1mL二次水中，室温下连续超声(超声功率为100W，频率为50Hz)2小时后，得到分散均匀的石墨炔和催化剂(亚甲基蓝)混合物(2mg/mL)。
(2)制备含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的分散液
将上述混合物与5mg/mL的葡萄糖脱氢酶水溶液(136U/mL)以体积比1:1进行混合，于旋涡混合仪上振荡5min，得到含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的分散液。
(3)制备电化学生物传感器用电极
取5μL的上述含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的分散液滴涂到玻碳电极上，2℃下干燥70min，即得到电化学生物传感器用电极，其中，所述电极包括形成于基底电极表面的包含石墨炔、催化剂和脱氢酶的修饰层。以1cm2的基底电极计，所述修饰层中含有5μg石墨炔，1μg催化剂和5U葡萄糖脱氢酶。
由于制备过程中使用的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶，该电化学生物传感器用电极可以用于检测生物活体、离体样品的葡萄糖的浓度。
实施例3
(1)制备石墨炔和催化剂的混合物
将8mg石墨炔粉末(制备例1得到)与2mL的4mmol/L亚甲基绿水溶液混合超声5小时得到分散均匀的分散液。将所得分散液离心(1500rpm，5min)并且用二次水冲洗以除去未吸附的亚甲基绿，从而得到石墨炔和催化剂复合物，15℃下干燥20min，得到石墨炔和催化剂固体。将2mg的石墨炔和催化剂固体分散至1mL二次水中，室温下连续超声(超声功率为100W，频率为50Hz)2小时后，得到分散均匀的石墨炔和催化剂(亚甲基绿)混合物(2mg/mL)。
(2)制备含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的分散液
将上述混合物与20mg/mL的葡萄糖脱氢酶水溶液(540U/mL)以体积比1:1进行混合，于旋涡混合仪上振荡5min，得到含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的分散液。
(3)制备电化学生物传感器用电极
取5μL的上述含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的分散液滴涂到玻碳电极上，4℃下干燥60min，即得到电化学生物传感器用电极，其中，所述电极包括形成于基底电极表面的包含石墨炔、催化剂和脱氢酶的修饰层。以1cm2的基底电极计，所述修饰层中含有180μg石墨炔，20μg催化剂和20U葡萄糖脱氢酶。
由于制备过程中使用的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶，该电化学生物传感器用电极可以用于检测生物活体、离体样品的葡萄糖的浓度。
实施例4
(1)制备石墨炔和催化剂的混合物
将4mg石墨炔粉末(制备例1得到)与2mL的1mmol/L亚甲基绿水溶液混合超声5小时得到分散均匀的分散液。将所得分散液离心(1500rpm，5min)并且用二次水冲洗以除去未吸附的亚甲基绿，从而得到石墨炔和催化剂复合物，室温下干燥20min，得到石墨炔和催化剂固体。将2mg的石墨炔和催化剂固体分散至1mL二次水中，室温下连续超声(超声功率为100W，频率为50Hz)2小时后，得到分散均匀的石墨炔和催化剂(亚甲基绿)混合物(2mg/mL)。
(2)制备含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的分散液
将上述混合物与10mg/mL的乳酸脱氢酶水溶液(272U/mL)以体积比1:1进行混合，于旋涡混合仪上振荡5min，得到含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的分散液。
(3)制备电化学生物传感器用电极
取5μL的上述含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的分散液滴涂到玻碳电极上，0℃下干燥90min，即得到电化学生物传感器用电极，其中，所述电极包括形成于基底电极表面的包含石墨炔、催化剂和脱氢酶的修饰层。以1cm2的基底电极计，所述修饰层中含有100μg石墨炔，10μg催化剂和25U乳酸脱氢酶。
由于制备过程中使用的脱氢酶为乳酸脱氢酶，该电化学生物传感器用电极可以用于检测生物活体、离体样品的乳酸的浓度。
实施例5
(1)制备石墨炔和催化剂的混合物
将2mg石墨炔粉末(制备例1得到)与2mL的0.5mmol/L亚甲基蓝水溶液混合超声5小时得到分散均匀的分散液。将所得分散液离心(1500rpm，5min)并且用二次水冲洗以除去未吸附的亚甲基蓝，从而得到石墨炔和催化剂复合物，60℃下干燥10min，得到石墨炔和催化剂固体。将2mg的石墨炔和催化剂固体分散至1mL二次水中，室温下连续超声(超声功率为100W，频率为50Hz)2小时后，得到分散均匀的石墨炔和催化剂(亚甲基蓝)混合物(2mg/mL)。
(2)制备含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的分散液
将上述混合物与7.5mg/mL的乳酸脱氢酶水溶液(210U/mL)以体积比1:1进行混合，于旋涡混合仪上振荡5min，得到含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的分散液。
(3)制备电化学生物传感器用电极
取5μL的上述含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的分散液滴涂到玻碳电极上，2℃下干燥70min，即得到电化学生物传感器用电极，其中，所述电极包括形成于基底电极表面的包含石墨炔、催化剂和脱氢酶的修饰层。以1cm2的基底电极计，所述修饰层中含有5μg石墨炔，1μg催化剂和15U乳酸脱氢酶。
由于制备过程中使用的脱氢酶为乳酸脱氢酶，该电化学生物传感器用电极可以用于检测生物活体、离体样品的乳酸的浓度。
实施例6
(1)制备石墨炔和催化剂的混合物
将8mg石墨炔粉末(制备例1得到)与2mL的8mmol/L亚甲基绿水溶液混合超声5小时得到分散均匀的分散液。将所得分散液离心(1500rpm，5min)并且用二次水冲洗以除去未吸附的亚甲基绿，从而得到石墨炔和催化剂复合物，15℃下干燥20min，得到石墨炔和催化剂固体。将2mg的石墨炔和催化剂固体分散至1mL二次水中，室温下连续超声(超声功率为100W，频率为50Hz)2小时后，得到分散均匀的石墨炔和催化剂(亚甲基绿)混合物(2mg/mL)。
(2)制备含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的分散液
将上述混合物与15mg/mL的乳酸脱氢酶水溶液(420U/mL)以体积比1:1进行混合，于旋涡混合仪上振荡5min，得到含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的分散液。
(3)制备电化学生物传感器用电极
取5μL的上述含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的分散液滴涂到玻碳电极上，4℃下干燥60min，即得到电化学生物传感器用电极，其中，所述电极包括形成于基底电极表面的包含石墨炔、催化剂和脱氢酶的修饰层。以1cm2的基底电极计，所述修饰层中含有180μg石墨炔，20μg催化剂和30U乳酸脱氢酶。
由于制备过程中使用的脱氢酶为乳酸脱氢酶，该电化学生物传感器用电极可以用于检测生物活体、离体样品的乳酸的浓度。
对比例1
(1)制备含有催化剂和脱氢酶的分散液
将2mL的1mmol/L亚甲基绿水溶液与10mg/mL的葡萄糖脱氢酶水溶液(272U/mL)以体积比1:1进行混合，于旋涡混合仪上振荡5min，得到含有催化剂(亚甲基绿)和脱氢酶的分散液。
(2)制备电化学生物传感器用电极
取5μL的上述含有催化剂和脱氢酶的分散液滴涂到玻碳电极上，0℃下干燥90min，即得到电化学生物传感器用电极，其中，所述电极包括形成于基底电极表面的包含催化剂和脱氢酶的修饰层。以1cm2的基底电极计，所述修饰层中含有10μg催化剂和10U葡萄糖脱氢酶。
由于制备过程中使用的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶，该电化学生物传感器用电极可以用于检测生物活体、离体样品的葡萄糖的浓度。
对比例2
将4mg碳纳米管与2mL的1mmol/L亚甲基绿水溶液混合超声5小时得到分散均匀的分散液。将所得分散液离心(1500rpm，5min)并且用二次水冲洗以除去未吸附的亚甲基绿，从而得到碳纳米管和催化剂复合物，室温下干燥20min，得到碳纳米管和催化剂固体。将2mg的碳纳米管和催化剂固体分散至1mL二次水中，室温下连续超声(超声功率为100W，频率为50Hz)2小时后，得到分散均匀的碳纳米管和催化剂(亚甲基绿)混合物(2mg/mL)。
(2)制备含有碳纳米管、催化剂和脱氢酶的分散液
将上述混合物与10mg/mL的葡萄糖脱氢酶水溶液(272U/mL)以体积比1:1进行混合，于旋涡混合仪上振荡5min，得到含有碳纳米管、催化剂和脱氢酶的分散液。
(3)制备电化学生物传感器用电极
取5μL的上述含有碳纳米管、催化剂和脱氢酶的分散液滴涂到玻碳电极上，0℃下干燥90min，即得到电化学生物传感器用电极，其中，所述电极包括形成于基底电极表面的包含碳纳米管、催化剂和脱氢酶的修饰层。以1cm2的基底电极计，所述修饰层中含有100μg碳纳米管，10μg催化剂和10U葡萄糖脱氢酶。
由于制备过程中使用的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶，该电化学生物传感器用电极可以用于检测生物活体、离体样品的葡萄糖的浓度。
对比例3
将4mg石墨烯与2mL的1mmol/L亚甲基绿水溶液混合超声5小时得到分散均匀的分散液。将所得分散液离心(1500rpm，5min)并且用二次水冲洗以除去未吸附的亚甲基绿，从而得到石墨烯和催化剂复合物，室温下干燥20min，得到石墨烯和催化剂固体。将2mg的石墨烯和催化剂固体分散至1mL二次水中，室温下连续超声(超声功率为100W，频率为50Hz)2小时后，得到分散均匀的石墨烯和催化剂(亚甲基绿)混合物(2mg/mL)。
(2)制备含有石墨烯、催化剂和脱氢酶的分散液
将上述混合物与10mg/mL的葡萄糖脱氢酶水溶液(272U/mL)以体积比1:1进行混合，于旋涡混合仪上振荡5min，得到含有石墨烯、催化剂和脱氢酶的分散液。
(3)制备电化学生物传感器用电极
取5μL的上述含有石墨烯、催化剂和脱氢酶的分散液滴涂到玻碳电极上，0℃下干燥90min，即得到电化学生物传感器用电极，其中，所述电极包括形成于基底电极表面的包含石墨烯、催化剂和脱氢酶的修饰层。以1cm2的基底电极计，所述修饰层中含有100μg石墨烯，10μg催化剂和10U葡萄糖脱氢酶。
由于制备过程中使用的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶，该电化学生物传感器用电极可以用于检测生物活体、离体样品的葡萄糖的浓度。
对比例4
(1)制备含有石墨炔和脱氢酶的分散液
将4mg石墨炔粉末(制备例1得到)与10mg/mL的葡萄糖脱氢酶水溶液(272U/mL)以体积比1:1进行混合，于旋涡混合仪上振荡5min，得到含有石墨炔和脱氢酶的分散液。
(2)制备电化学生物传感器用电极
取5μL的上述含有石墨炔和脱氢酶的分散液滴涂到玻碳电极上，0℃下干燥90min，即得到电化学生物传感器用电极，其中，所述电极包括形成于基底电极表面的包含石墨炔和脱氢酶的修饰层。以1cm2的基底电极计，所述修饰层中含有100μg石墨炔和10U葡萄糖脱氢酶。
由于制备过程中使用的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶，该电化学生物传感器用电极可以用于检测生物活体、离体样品的葡萄糖的浓度。
对比例5
(1)制备石墨炔和催化剂的混合物
将4mg石墨炔粉末(制备例1得到)与2mL的1mmol/L亚甲基绿水溶液混合超声5小时得到分散均匀的分散液。将所得分散液离心(1500rpm，5min)并且用二次水冲洗以除去未吸附的亚甲基绿，从而得到石墨炔和催化剂复合物，室温下干燥20min，得到石墨炔和催化剂固体。将2mg的石墨炔和催化剂固体分散至1mL二次水中，室温下连续超声(超声功率为100W，频率为50Hz)2小时后，得到分散均匀的石墨炔和催化剂(亚甲基绿)混合物(2mg/mL)。
(2)制备电化学生物传感器用电极
取5μL的上述石墨炔和催化剂混合物滴涂到玻碳电极上，0℃下干燥90min，即得到电化学生物传感器用电极，其中，所述电极包括形成于基底电极表面的包含石墨炔和催化剂的修饰层。以1cm2的基底电极计，所述修饰层中含有100μg石墨炔和10μg催化剂。
对比例6
(1)制备石墨炔和催化剂的混合物
将1mg石墨炔粉末(制备例1得到)与2mL的1mmol/L亚甲基绿水溶液混合超声5小时得到分散均匀的分散液。将所得分散液离心(1500rpm，5min)并且用二次水冲洗以除去未吸附的亚甲基绿，从而得到石墨炔和催化剂复合物，室温下干燥20min，得到石墨炔和催化剂固体。将2mg的石墨炔和催化剂固体分散至1mL二次水中，室温下连续超声(超声功率为100W，频率为50Hz)2小时后，得到分散均匀的石墨炔和催化剂(亚甲基绿)混合物(2mg/mL)。
(2)制备含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的分散液
将上述混合物与10mg/mL的葡萄糖脱氢酶水溶液(272U/mL)以体积比1:1进行混合，于旋涡混合仪上振荡5min，得到含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的分散液。
(3)制备电化学生物传感器用电极
取5μL的上述含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的分散液滴涂到玻碳电极上，0℃下干燥90min，即得到电化学生物传感器用电极，其中，所述电极包括形成于基底电极表面的包含石墨炔、催化剂和葡萄糖脱氢酶的修饰层。以1cm2的基底电极计，所述修饰层中含有2μg石墨炔，10μg催化剂和10U葡萄糖脱氢酶。
由于制备过程中使用的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶，该电化学生物传感器用电极可以用于检测生物活体、离体样品的葡萄糖的浓度。
对比例7
(1)制备石墨炔和催化剂的混合物
将10mg石墨炔粉末(制备例1得到)与2mL的1mmol/L亚甲基绿水溶液混合超声5小时得到分散均匀的分散液。将所得分散液离心(1500rpm，5min)并且用二次水冲洗以除去未吸附的亚甲基绿，从而得到石墨炔和催化剂复合物，室温下干燥20min，得到石墨炔和催化剂固体。将2mg的石墨炔和催化剂固体分散至1mL二次水中，室温下连续超声(超声功率为100W，频率为50Hz)2小时后，得到分散均匀的石墨炔和催化剂(亚甲基绿)混合物(2mg/mL)。
(2)制备含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的分散液
将上述混合物与10mg/mL的葡萄糖脱氢酶水溶液(272U/mL)以体积比1:1进行混合，于旋涡混合仪上振荡5min，得到含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的分散液。
(3)制备电化学生物传感器用电极
取5μL的上述含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的分散液滴涂到玻碳电极上，0℃下干燥90min，即得到电化学生物传感器用电极，其中，所述电极包括形成于基底电极表面的包含石墨炔、催化剂和葡萄糖脱氢酶的修饰层。以1cm2的基底电极计，所述修饰层中含有200μg石墨炔，10μg催化剂和10U葡萄糖脱氢酶。
由于制备过程中使用的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶，该电化学生物传感器用电极可以用于检测生物活体、离体样品的葡萄糖的浓度。
对比例8
(1)将2mL的1mmol/L亚甲基绿水溶液与10mg/mL的乳酸脱氢酶水溶液(272U/mL)以体积比1:1进行混合，于旋涡混合仪上振荡5min，得到含有催化剂(亚甲基绿)和脱氢酶的分散液。
(3)制备电化学生物传感器用电极
取5μL的上述含有催化剂和脱氢酶的分散液滴涂到玻碳电极上，0℃下干燥90min，即得到电化学生物传感器用电极，其中，所述电极包括形成于基底电极表面的包含催化剂和乳酸脱氢酶的修饰层。以1cm2的基底电极计，所述修饰层中含有10μg催化剂和25U乳酸脱氢酶。
由于制备过程中使用的脱氢酶为乳酸脱氢酶，该电化学生物传感器用电极可以用于检测生物活体、离体样品的乳酸的浓度。
对比例9
(1)制备碳纳米管和催化剂的混合物
将4mg碳纳米管与2mL的1mmol/L亚甲基绿水溶液混合超声5小时得到分散均匀的分散液。将所得分散液离心(1500rpm，5min)并且用二次水冲洗以除去未吸附的亚甲基绿，从而得到碳纳米管和催化剂复合物，室温下干燥20min，得到碳纳米管和催化剂固体。将2mg的碳纳米管和催化剂固体分散至1mL二次水中，室温下连续超声(超声功率为100W，频率为50Hz)2小时后，得到分散均匀的碳纳米管和催化剂(亚甲基绿)混合物(2mg/mL)。
(2)制备含有碳纳米管、催化剂和脱氢酶的分散液
将上述混合物与10mg/mL的乳酸脱氢酶水溶液(272U/mL)以体积比1:1进行混合，于旋涡混合仪上振荡5min，得到含有碳纳米管、催化剂和脱氢酶的分散液。
(3)制备电化学生物传感器用电极
取5μL的上述含有碳纳米管、催化剂和脱氢酶的分散液滴涂到玻碳电极上，0℃下干燥90min，即得到电化学生物传感器用电极，其中，所述电极包括形成于基底电极表面的包含碳纳米管、催化剂和乳酸脱氢酶的修饰层。以1cm2的基底电极计，所述修饰层中含有100μg碳纳米管，10μg催化剂和25U乳酸脱氢酶。
由于制备过程中使用的脱氢酶为乳酸脱氢酶，该电化学生物传感器用电极可以用于检测生物活体、离体样品的乳酸的浓度。
对比例10
(1)制备石墨烯和催化剂的混合物
将4mg石墨烯与2mL的1mmol/L亚甲基绿水溶液混合超声5小时得到分散均匀的分散液。将所得分散液离心(1500rpm，5min)并且用二次水冲洗以除去未吸附的亚甲基绿，从而得到石墨烯和催化剂复合物，室温下干燥20min，得到石墨烯和催化剂固体。将2mg的石墨烯和催化剂固体分散至1mL二次水中，室温下连续超声(超声功率为100W，频率为50Hz)2小时后，得到分散均匀的石墨烯和催化剂(亚甲基绿)混合物(2mg/mL)。
(2)制备含有石墨烯、催化剂和脱氢酶的分散液
将上述混合物与10mg/mL的乳酸脱氢酶水溶液(272U/mL)以体积比1:1进行混合，于旋涡混合仪上振荡5min，得到含有石墨烯、催化剂和脱氢酶的分散液。
(3)制备电化学生物传感器用电极
取5μL的上述含有石墨烯、催化剂和脱氢酶的分散液滴涂到玻碳电极上，0℃下干燥90min，即得到电化学生物传感器用电极，其中，所述电极包括形成于基底电极表面的包含石墨烯、催化剂和乳酸脱氢酶的修饰层。以1cm2的基底电极计，所述修饰层中含有100μg石墨烯，10μg催化剂和25U乳酸脱氢酶。
由于制备过程中使用的脱氢酶为乳酸脱氢酶，该电化学生物传感器用电极可以用于检测生物活体、离体样品的乳酸的浓度。
对比例11
(1)制备石墨炔和脱氢酶的混合物
将4mg石墨炔粉末(制备例1得到)与10mg/mL的乳酸脱氢酶水溶液(272U/mL)以体积比1:1进行混合，于旋涡混合仪上振荡5min，得到含有石墨炔和脱氢酶的分散液。
(2)制备电化学生物传感器用电极
取5μL的上述含有石墨炔和脱氢酶的分散液滴涂到玻碳电极上，0℃下干燥90min，即得到电化学生物传感器用电极，其中，所述电极包括形成于基底电极表面的包含碳纳米管和乳酸脱氢酶的修饰层。以1cm2的基底电极计，所述修饰层中含有100μg石墨炔和25U乳酸脱氢酶。
由于制备过程中使用的脱氢酶为乳酸脱氢酶，该电化学生物传感器用电极可以用于检测生物活体、离体样品的乳酸的浓度。
对比例12
(1)制备石墨炔和催化剂的混合物
将4mg石墨炔粉末(制备例1得到)与2mL的1mmol/L亚甲基绿水溶液混合超声5小时得到分散均匀的分散液。将所得分散液离心(1500rpm，5min)并且用二次水冲洗以除去未吸附的亚甲基绿，从而得到石墨炔和催化剂复合物，室温下干燥20min，得到石墨炔和催化剂固体。将2mg的石墨炔和催化剂固体分散至1mL二次水中，室温下连续超声(超声功率为100W，频率为50Hz)2小时后，得到分散均匀的石墨炔和催化剂(亚甲基绿)混合物(2mg/mL)。
(2)制备电化学生物传感器用电极
取5μL的上述石墨炔和催化剂混合物滴涂到玻碳电极上，0℃下干燥90min，即得到电化学生物传感器用电极，其中，所述电极包括形成于基底电极表面的包含石墨炔和催化剂的修饰层。以1cm2的基底电极计，所述修饰层中含有100μg石墨炔和10μg催化剂。
对比例13
(1)制备石墨炔和催化剂的混合物
将1mg石墨炔粉末(制备例1得到)与2mL的1mmol/L亚甲基绿水溶液混合超声5小时得到分散均匀的分散液。将所得分散液离心(1500rpm，5min)并且用二次水冲洗以除去未吸附的亚甲基绿，从而得到石墨炔和催化剂复合物，室温下干燥20min，得到石墨炔和催化剂固体。将2mg的石墨炔和催化剂固体分散至1mL二次水中，室温下连续超声(超声功率为100W，频率为50Hz)2小时后，得到分散均匀的石墨炔和催化剂(亚甲基绿)混合物(2mg/mL)。
(2)制备含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的分散液
将上述混合物与10mg/mL的乳酸脱氢酶水溶液(272U/mL)以体积比1:1进行混合，于旋涡混合仪上振荡5min，得到含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的分散液。
(3)制备电化学生物传感器用电极
取5μL的上述含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的分散液滴涂到玻碳电极上，0℃下干燥90min，即得到电化学生物传感器用电极，其中，所述电极包括形成于基底电极表面的包含石墨炔、催化剂和乳酸脱氢酶的修饰层。以1cm2的基底电极计，所述修饰层中含有2μg石墨炔，10μg催化剂和25U乳酸脱氢酶。
由于制备过程中使用的脱氢酶为乳酸脱氢酶，该电化学生物传感器用电极可以用于检测生物活体、离体样品的乳酸的浓度。
对比例14
(1)制备石墨炔和催化剂的混合物
将10mg石墨炔粉末(制备例1得到)与2mL的1mmol/L亚甲基绿水溶液混合超声5小时得到分散均匀的分散液。将所得分散液离心(1500rpm，5min)并且用二次水冲洗以除去未吸附的亚甲基绿，从而得到石墨炔和催化剂复合物，室温下干燥20min，得到石墨炔和催化剂固体。将2mg的石墨炔和催化剂固体分散至1mL二次水中，室温下连续超声(超声功率为100W，频率为50Hz)2小时后，得到分散均匀的石墨炔和催化剂(亚甲基绿)混合物(2mg/mL)。
(2)制备含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的分散液
将上述混合物与10mg/mL的乳酸脱氢酶水溶液(272U/mL)以体积比1:1进行混合，于旋涡混合仪上振荡5min，得到含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的分散液。
(3)制备电化学生物传感器用电极
取5μL的上述含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的分散液滴涂到玻碳电极上，0℃下干燥90min，即得到电化学生物传感器用电极，其中，所述电极包括形成于基底电极表面的包含石墨炔、催化剂和乳酸脱氢酶的修饰层。以1cm2的基底电极计，所述修饰层中含有200μg石墨炔，10μg催化剂和25U乳酸脱氢酶。
由于制备过程中使用的脱氢酶为乳酸脱氢酶，该电化学生物传感器用电极可以用于检测生物活体、离体样品的乳酸的浓度。
测试例1-1
(1)测试电化学生物传感器用电极作为工作电极时，对不同葡萄糖浓度的线性关系：
利用薄层流动电解池在流动体系，将实施例1制备得到的电化学生物传感器电极作为工作电极，置于电解池中并以Pt为对电极，Ag/AgCl为参比电极构成三电极体系，连接电化学工作站(上海辰华电化学工作站，型号CHI1030)。如图2a所示，以2μL/min的流速向电解池中注入电解液(此处采用人工脑脊液，其组成为NaCl(126mM)，KCl(2.4mM)，KH2PO4(0.5mM)，MgCl2(0.85mM)，NaHCO3(27.5mM)，Na2SO4(0.5mM)，CaCl2(1.1mM)，用于模拟脑脊液环境)然后对工作电极施加0.0V的电压，待背景电流稳定后，以2μL/min的流速向电解池中分别注入不同浓度的葡萄糖溶液共6次，待每次加入葡萄糖的响应电流达到平衡后，注入人工脑脊液使电流回归背景电流后再次注入另一浓度的葡萄糖。葡萄糖的浓度按照100μmol/L、200μmol/L、300μmol/L、500μmol/L、1000μmol/L以及2000μmol/L的梯度变化，同时实时检测上述过程中的电极电流，根据电极电流绘制拟合曲线，从而得到对应的浓度，结果如图2b所示，通过图2b能够看出，本发明的电化学生物传感器用电极作为工作电极，获得的响应电流能够随葡萄糖浓度上升呈梯度增长，说明该电极在对葡萄糖在100～2000μmol/L的范围内具有较好的响应。根据葡萄糖浓度和对应的响应电流绘制拟合曲线，得到对应的浓度，说明该电极对葡萄糖的浓度具有良好的线性响应关系，因此可以通过后校准准确得到透析液中葡萄糖的浓度变化。
(2)测试电化学生物传感器用电极作为工作电极时，对不同乳酸浓度的线性关系：
利用薄层流动电解池在流动体系，将实施例1制备得到的电化学生物传感器电极作为工作电极，置于电解池中并以Pt为对电极，Ag/AgCl为参比电极构成三电极体系，连接电化学工作站(上海辰华电化学工作站，型号CHI1030)。如图2c所示，以2μL/min的流速向电解池中注入电解液(此处采用人工脑脊液，其组成为NaCl(126mM)，KCl(2.4mM)，KH2PO4(0.5mM)，MgCl2(0.85mM)，NaHCO3(27.5mM)，Na2SO4(0.5mM)，CaCl2(1.1mM)，用于模拟脑脊液环境)然后对工作电极施加0.0V的电压，待背景电流稳定后，以2μL/min的流速向电解池中分别注入不同浓度的乳酸钠溶液共4次，待每次加入乳酸钠的响应电流达到平衡后，注入人工脑脊液使电流回归背景电流后再次注入另一浓度的乳酸钠。乳酸钠的浓度按照50μmol/L、150μmol/L、250μmol/L以及500μmol/L的梯度变化，同时实时检测上述过程中的电极电流，根据电极电流绘制拟合曲线，从而得到对应的浓度，结果如图2d所示，通过图2d能够看出，本发明的电化学生物传感器用电极作为工作电极，获得的响应电流能够随乳酸浓度上升呈梯度增长，说明该电极在对乳酸在100～2000μmol/L的范围内具有较好的响应。根据乳酸浓度和对应的响应电流绘制拟合曲线，得到对应的浓度，说明该电极对乳酸的浓度具有良好的线性响应关系，因此可以通过后校准准确得到透析液中乳酸的浓度变化。
测试例1-2
按照测试例1-1的方法，不同的是，采用实施例2和实施例5制备得到的电化学生物传感器用电极，结果与图2b和2d类似。
测试例1-3
按照测试例1-1的方法，不同的是，采用实施例3和实施例6制备得到的电化学生物传感器用电极，结果与图2b类似和2d类似。
测试对比例1-1
按照测试例1-1的方法，不同的是，采用对比例1制备得到的电化学生物传感器用电极，结果显示，从而无法进行对葡萄糖和/或乳酸的检测。结果表明仅用催化剂亚甲基绿与脱氢酶的复合物修饰电极时，复合物无法固定于电极表面，因此无法将化学信号转化为电信号。
测试对比例1-2
按照测试例1-1的方法，不同的是，采用对比例2和对比例9制备得到的电化学生物传感器用电极，对葡萄糖和/或乳酸有良好的线性响应，但是抗坏血酸等小分子物质对该电极有很大的干扰信号，所以无法准确检测葡萄糖和/或乳酸的浓度。
测试对比例1-3
按照测试例1-1的方法，不同的是，采用对比例3和对比例10制备得到的电化学生物传感器用电极，对葡萄糖和/或乳酸有良好的线性响应，但是抗坏血酸等小分子物质对该电极有很大的干扰信号，所以无法准确检测葡萄糖和/或乳酸的浓度。
测试对比例1-4
按照测试例1-1的方法，不同的是，采用对比例4和对比例11制备得到的电化学生物传感器用电极，没有化学信号转化为电信号，无法进行对葡萄糖和/或乳酸的检测。结果表明仅用石墨炔与脱氢酶的复合物修饰电极与电化学工作站连接，由于没有催化剂的存在，催化反应无法进行，因此在工作电压为0V时对葡萄糖和/或乳酸均没有响应。
测试对比例1-5
按照测试例1-1的方法，不同的是，采用对比例5和对比例12制备得到的电化学生物传感器用电极，无法进行对葡萄糖和/或乳酸的检测。结果表明仅用石墨炔与催化剂亚甲基绿的复合物修饰电极连接电化学工作站，由于没有葡萄糖脱氢酶或乳酸脱氢酶的存在，葡萄糖或乳酸无法转化为有电化学性质的产物，因此在工作电压为0V时无法检测到葡萄糖和/或乳酸的信号。
测试对比例1-6
按照测试例1-1的方法，不同的是，采用对比例6和对比例13制备得到的电化学生物传感器用电极，信号值不稳定。结果表明2μg的石墨炔用量，无法将足量的催化剂亚甲基绿和脱氢酶固定于电极，无法将检测体系中的葡萄糖和/或乳酸完全转化为具有电化学性质的产物，当被检测物葡萄糖和/或乳酸浓度较高时，检测信号不在线性范围内，无法准确计算被测物浓度，并且石墨炔用量很少时，无法将基底电极完全覆盖，抗坏血酸等小分子物质在该电极上会产生干扰信号，因此检测到的葡萄糖和/或乳酸的信号值无法准确测定。
测试对比例1-7
按照测试例1-1的方法，不同的是，采用对比例7制备得到的电化学生物传感器用电极，信号值不稳定且响应范围变小。结果表明当石墨炔层过厚时，修饰的复合物层导电性下降，当被检测物葡萄糖和/或乳酸浓度较低时，无法得到检测信号或检测信号噪音过大，无法准确计算被测物浓度，因此检测到的葡萄糖和/或乳酸的信号值无法准确测定。
测试例2-1
(1)测试电化学生物传感器用电极对葡萄糖的选择性：
对比检测脑内常见的电化学活性干扰物质在电极上的响应。利用电化学安培法测定电流过程，在三电极体系中，其中实施例1制备得到的电化学生物传感器电极为工作电极，参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为Pt电极，连接电化学工作站，在流动体系下，对工作电极施加0.0V的电压，待背景电流稳定后，如图3a所示，向电解液中加入浓度为500μmol/L的葡萄糖，电流显著升高，而后依次加入20μmol/L的抗坏血酸(AA)溶液、20μmol/L的多巴胺(DA)溶液、50μmol/L的尿酸(UA)溶液、50μmol/L的五羟色胺(5-HT)溶液、50μmol/L二羟基苯乙酸(DOPAC)溶液，结果如图3b所示，通过图3b能够看出，采用本发明的电化学生物传感器用电极对于干扰物质(例如抗坏血酸、多巴胺、五羟色胺、二羟基苯乙酸和尿酸)均没有产生明显的电流响应，说明该电极对葡萄糖具有优异的选择性。
(2)测试电化学生物传感器用电极对乳酸的选择性：
对比检测脑内常见的电化学活性干扰物质在电极上的响应。利用电化学安培法测定电流过程，在三电极体系中，其中实施例4制备得到的电化学生物传感器电极为工作电极，参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为Pt电极，连接电化学工作站，在流动体系下，对工作电极施加0.0V的电压，待背景电流稳定后，如图3c所示，向电解液中加入浓度为500μmol/L的乳酸，电流显著升高，而后依次加入20μmol/L的抗坏血酸(AA)溶液、20μmol/L的多巴胺(DA)溶液、50μmol/L的尿酸(UA)溶液、50μmol/L的五羟色胺(5-HT)溶液、50μmol/L二羟基苯乙酸(DOPAC)溶液，结果如图3d所示，通过图3d能够看出，采用本发明的电化学生物传感器用电极对于干扰物质(例如抗坏血酸、多巴胺、五羟色胺、二羟基苯乙酸和尿酸)均没有产生明显的电流响应，说明该电极对乳酸具有优异的选择性。
测试例2-2
按照测试例2-1的方法，不同的是，采用实施例2和实施例5制备得到的电化学生物传感器用电极，结果与图3b和图3d类似。
测试例2-3
按照测试例2-1的方法，不同的是，采用实施例3和实施例6制备得到的电化学生物传感器用电极，结果与图3b和图3d类似。
测试对比例2-1
按照测试例2-1的方法，不同的是，采用对比例1和对比例8制备得到的电化学生物传感器用电极，结果表明仅用催化剂亚甲基绿与脱氢酶的复合物修饰电极时，复合物无法固定于电极表面，因此无法将化学信号转化为电信号。
测试对比例2-2
按照测试例2-1的方法，不同的是，采用对比例2和对比例9制备得到的电化学生物传感器用电极，对于抗坏血酸有明显的响应，对于多巴胺、五羟色胺、二羟基苯乙酸和尿酸也有响应，但是没有抗坏血酸的响应电流大。
测试对比例2-3
按照测试例2-1的方法，不同的是，采用对比例3和对比例10制备得到的电化学生物传感器用电极，对于抗坏血酸有明显的响应，对于多巴胺、五羟色胺、二羟基苯乙酸和尿酸也有响应，但是没有抗坏血酸的响应电流大。
测试对比例2-4
按照测试例2-1的方法，不同的是，采用对比例4和对比例11制备得到的电化学生物传感器用电极，没有化学信号转化为电信号。结果表明仅用石墨炔与脱氢酶的复合物修饰电极与电化学工作站连接，由于没有催化剂的存在，催化反应无法进行，在工作电压为0V时对葡萄糖和/或乳酸均没有响应，因此没有化学信号转化为电信号。
测试对比例2-5
按照测试例2-1的方法，不同的是，采用对比例5和对比例12制备得到的电化学生物传感器用电极，没有化学信号转化为电信号。结果表明仅用石墨炔与催化剂亚甲基绿的复合物修饰电极连接电化学工作站，由于没有葡萄糖脱氢酶或乳酸脱氢酶的存在，葡萄糖和/或乳酸无法转化为有电化学性质的产物，无法进行催化反应，因此在工作电压为0V时无法检测到葡萄糖和/或乳酸的信号，无法检测。
测试对比例2-6
按照测试例2-1的方法，不同的是，采用对比例6和对比例13制备得到的电化学生物传感器用电极，检测到的葡萄糖和/或乳酸的信号值无法准确测定。结果表明当石墨炔用量很少时，无法将足量的催化剂亚甲基绿和脱氢酶固定于电极，无法将检测体系中的葡萄糖和/或乳酸完全转化为具有电化学性质的产物，当被检测物葡萄糖和/或乳酸浓度较高时，检测信号不在线性范围内，无法准确计算被测物浓度，并且石墨炔用量很少时，无法将基底电极完全覆盖，抗坏血酸等小分子物质在该电极上会产生干扰信号，因此检测到的葡萄糖和/或乳酸的信号值无法准确测定。
测试对比例2-7
按照测试例2-1的方法，不同的是，采用对比例7和对比例14制备得到的电化学生物传感器用电极，检测到的葡萄糖和/或乳酸的信号值无法准确测定。结果表明当石墨炔层过厚时，修饰的复合物层导电性下降，当被检测物葡萄糖和/或乳酸浓度较低时，无法得到检测信号或检测信号噪音过大，无法准确计算被测物浓度，因此检测到的葡萄糖和/或乳酸的信号值无法准确测定。
测试例3-1
利用薄层流动电解池在流动体系，分别将实施例1和实施例4(修饰层含有石墨炔/亚甲基绿/脱氢酶)，以及对比例2和对比例9(修饰层含有碳纳米管/亚甲基绿/脱氢酶)制备得到的电化学生物传感器电极作为工作电极，置于电解池中并以Pt为对电极，Ag/AgCl为参比电极构成三电极体系，连接电化学工作站(上海辰华电化学工作站，型号CHI1030)。以2μL/min的流速向电解池中注入电解液(此处采用人工脑脊液，其组成为NaCl(126mM)，KCl(2.4mM)，KH2PO4(0.5mM)，MgCl2(0.85mM)，NaHCO3(27.5mM)，Na2SO4(0.5mM)，CaCl2(1.1mM)，用于模拟脑脊液环境)然后对工作电极施加0.0V的电压，待背景电流稳定后，以2μL/min的流速向电解池中分别注入不同浓度的抗坏血酸溶液共4次，待每次加入抗坏血酸的响应电流达到平衡后，注入人工脑脊液使电流回归背景电流后再次注入另一浓度的抗坏血酸。抗坏血酸的浓度依次为10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L以及40μmol/L，同时实时检测上述过程中的电极电流，结果如图4a所示，从图4a能够明显看出，采用本发明的电极作为工作电极时，10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L以及40μmol/L不同浓度的抗坏血酸均无响应，说明无干扰，而采用石墨烯电极，均有明显的响应，说明产生了较大干扰。
测试例3-2
利用薄层流动电解池在流动体系，分别将实施例1和实施例4(修饰层含有石墨炔/亚甲基绿/脱氢酶)，以及对比例3和对比例10(修饰层含有石墨烯/亚甲基绿/脱氢酶)制备得到的电化学生物传感器电极作为工作电极，置于电解池中并以Pt为对电极，Ag/AgCl为参比电极构成三电极体系，连接电化学工作站(上海辰华电化学工作站，型号CHI1030)。如图4b所示，以2μL/min的流速向电解池中注入电解液(此处采用人工脑脊液，其组成为NaCl(126mM)，KCl(2.4mM)，KH2PO4(0.5mM)，MgCl2(0.85mM)，NaHCO3(27.5mM)，Na2SO4(0.5mM)，CaCl2(1.1mM)，用于模拟脑脊液环境)然后对工作电极施加0.0V的电压，待背景电流稳定后，以2μL/min的流速向电解池中分别注入不同浓度的抗坏血酸溶液共4次，待每次加入抗坏血酸的响应电流达到平衡后，注入人工脑脊液使电流回归背景电流后再次注入另一浓度的抗坏血酸。抗坏血酸的浓度依次为10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L以及40μmol/L，同时实时检测上述过程中的电极电流，结果如图4b所示，从图4b能够看出，采用本发明的电极作为工作电极时，10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L以及40μmol/L不同浓度的抗坏血酸均无响应，说明无干扰，而采用石墨烯或碳纳米管的电极，均有明显的响应，说明产生了较大干扰。
测试例4-1
电化学生物传感器用电极用于检测生物活体的葡萄糖和/或乳酸浓度：
将实施例1和实施例4制备的电化学生物传感器用电极作为工作电极，与电化学工作站(上海辰华电化学工作站，CHI1030)连接，对工作电极施加0.0V(vs.Ag/AgCl)的电压，待背景电流稳定后，在大鼠清醒或麻醉状态下对鼠脑内葡萄糖和乳酸的基础浓度进行同时检测。根据葡萄糖、乳酸浓度对应响应电流绘制的拟合曲线，计算出大鼠脑内葡萄糖、乳酸基础浓度分别为0.39±0.03mM和0.95±0.05mM。在给大鼠吸入含有高二氧化碳含量(5％)的空气后，对鼠脑内葡萄糖、乳酸的浓度进行检测，可以看到葡萄糖浓度下降43.7±4.0％，乳酸浓度升高235±46.6％，如图5所示，通过图5能够看出本发明制备的电化学生物传感器用电极能够实现在活体脑内对葡萄糖和乳酸基础浓度和变化浓度的同时检测，并且在吸入含有高浓度的二氧化碳的空气后，葡萄糖电流响应降低，乳酸电流响应升高，根据浓度和对应的响应电流绘制拟合曲线，得到葡萄糖浓度降低，乳酸浓度升高的结果，说明两者之间无干扰。
测试例4-2
按照测试例4-1的方法，不同的是，采用实施例2和实施例5制备的电化学生物传感器用电极，结果与图5相似。
测试例4-3
按照测试例4-1的方法，不同的是，采用实施例3和实施例6制备的电化学生物传感器用电极，结果与图5相似。
测试对比例4-1
按照测试例4-1的方法，不同的是，采用测试例1和测试例8制备的电化学生物传感器用电极，结果表明仅用催化剂亚甲基绿与脱氢酶的复合物修饰电极时，复合物无法固定于电极表面，因此无法将化学信号转化为电信号，因此无法检测生物活体的葡萄糖和/或乳酸的浓度。
测试对比例4-2
按照测试例4-1的方法，不同的是，采用测试例2和测试例9制备的电化学生物传感器用电极，结果表明该电极可以得到响应，但是由于使用该电极测试时，抗坏血酸等小分子物质对检测葡萄糖和/或乳酸的响应信号有明显干扰，因此无法准确检测生物活体的葡萄糖和/或乳酸的浓度。
测试对比例4-3
按照测试例4-1的方法，不同的是，采用测试例3和测试例10制备的电化学生物传感器用电极，结果为表明该电极可以得到响应，但是由于使用该电极测试时，抗坏血酸等小分子物质对检测葡萄糖和/或乳酸的响应信号有明显干扰，因此无法准确检测生物活体的葡萄糖和/或乳酸的浓度。
测试对比例4-4
按照测试例4-1的方法，不同的是，采用测试例4和测试例11制备的电化学生物传感器用电极，结果为没有化学信号转化为电信号，无法进行对葡萄糖和/或乳酸的检测。结果表明仅用石墨炔与脱氢酶的复合物修饰电极与电化学工作站连接，由于没有催化剂的存在，催化反应无法进行，因此无法检测生物活体的葡萄糖和/或乳酸的浓度。
测试对比例4-5
按照测试例4-1的方法，不同的是，采用测试例5和测试例12制备的电化学生物传感器用电极，无法检测。结果表明仅用石墨炔与催化剂亚甲基绿的复合物修饰电极连接电化学工作站，由于没有脱氢酶的存在，葡萄糖和/或乳酸无法转化为有电化学性质的产物，无法进行催化反应，因此在工作电压为0V时无法检测到葡萄糖和/或乳酸的信号，无法检测。
测试对比例4-6
按照测试例4-1的方法，不同的是，采用测试例6和测试例13制备的电化学生物传感器用电极，检测到的葡萄糖和/或乳酸的信号值无法准确测定。结果表明当石墨炔用量很少时，无法将足量的催化剂亚甲基绿和脱氢酶固定于电极，无法将检测体系中的葡萄糖和/或乳酸完全转化为具有电化学性质的产物，因此检测到的葡萄糖和/或乳酸的信号值无法准确测定。
测试对比例4-7
按照测试例4-1的方法，不同的是，采用测试例7和测试例14制备的电化学生物传感器用电极，检测到的葡萄糖和/或乳酸的信号值无法准确测定。结果表明当石墨炔层过厚时，修饰的复合物层导电性下降，因此检测到的葡萄糖和/或乳酸的信号值无法准确测定。
测试例5-1
测试本发明的电化学生物传感器用电极作为工作电极时，对于葡萄糖与乳酸可以同时检测且互不干扰：
利用双通道薄层流动电解池在流动体系(上海辰华，型号CHI130)，将实施例1和4制备得到的电化学生物传感器电极作为工作电极，置于电解池中并以Pt为对电极，Ag/AgCl为参比电极构成三电极体系，连接电化学工作站(上海辰华电化学工作站，型号CHI1030)。如图6所示，以2μL/min的流速向电解池中注入电解液(此处采用人工脑脊液，其组成为NaCl(126mM)，KCl(2.4mM)，KH2PO4(0.5mM)，MgCl2(0.85mM)，NaHCO3(27.5mM)，Na2SO4(0.5mM)，CaCl2(1.1mM)，用于模拟脑脊液环境)然后对工作电极施加0.0V的电压，待背景电流稳定后，以2μL/min的流速向电解池中分别注入不同浓度的乳酸钠溶液共4次，待每次加入乳酸的响应电流达到平衡后，注入人工脑脊液使电流回归背景电流后再次注入另一浓度的乳酸钠。乳酸钠的浓度按照200μmol/L、500μmol/L、1000μmol/L以及5000μmol/L的梯度变化，同时实时检测上述过程中的电极电流。随后以2μL/min的流速向电解池中分别注入不同浓度的葡萄糖溶液共4次，待每次加入葡萄糖的响应电流达到平衡后，注入人工脑脊液使电流回归背景电流后再次注入另一浓度的葡萄糖。葡萄糖的浓度按照100μmol/L、200μmol/L、500μmol/L以及1000μmol/L的梯度变化，同时实时检测上述过程中的电极电流，结果如图6所示，通过图6能够看出，本发明制备的电化学生物传感器用电极能够实现对葡萄糖和/或乳酸的高选择性、高灵敏度检测，且两者之间无干扰。
综上所述，实施例1-3为本发明的用于检测葡萄糖浓度的电化学生物传感器，实施例4-6为本发明的用于检测乳酸浓度的电化学生物传感器，对比例1-7为未采用本发明方法制备的用于检测葡萄糖浓度的电化学生物传感器，对比例8-14为未采用本发明方法制备的用于检测乳酸浓度的电化学生物传感器，其中，对比例1和8为未使用石墨炔的方法，对比例2和9为将石墨炔替换为碳纳米管的方法，对比例3和10为将石墨炔替换为石墨烯的方法，对比例4和11为不用催化剂的方法，对比例5和12为不用脱氢酶的方法，对比例6、7、13和14为石墨炔的用量不在本发明的范围内的方法。
进一步地，通过测试例1-1至1-3能够看出，采用本发明的电化学生物传感器用电极作为工作电极时，获得的响应电流能够随葡萄糖和/或乳酸浓度上升呈梯度增长，对于葡萄糖和/或乳酸具有较好的响应，根据葡萄糖和/或乳酸对应的响应电流绘制拟合曲线，得到对应的葡萄糖和/或乳酸的浓度，说明该电极对葡萄糖和/或乳酸的浓度具有良好的线性响应关系，因此可以通过后校准准确得到透析液中葡萄糖的浓度变化。而通过测试对比例1-1至1-7能够看出，未采用本发明的方法制得的电化学生物传感器用电极，存在无法将化学信号转化为电信号、信号值不稳定，或者对葡萄糖和/或乳酸有良好的线性响应，但是抗坏血酸等小分子物质对该电极有很大的干扰信号的问题。
通过测试例2-1至2-3能够看出，采用本发明的电化学生物传感器用电极作为工作电极时，对于干扰物质(例如抗坏血酸、多巴胺、五羟色胺、二羟基苯乙酸和尿酸)均没有产生明显的电流响应，说明该电极对葡萄糖和/或乳酸具有优异的选择性。而通过测试对比例2-1至2-7能够看出，未采用本发明的方法制得的电化学生物传感器用电极，依然存在无法将化学信号转化为电信号、信号值不稳定，或者受到抗坏血酸、多巴胺、五羟色胺、二羟基苯乙酸和尿酸的干扰，尤其是受到抗坏血酸的干扰的问题。
通过测试例3-1和3-2能够看出，采用本发明的电化学生物传感器用电极作为工作电极时，10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L以及40μmol/L不同浓度的抗坏血酸均无响应，说明无干扰，而采用碳纳米管或石墨烯替代本申请的石墨炔制备的生物传感器电极连接电化学工作站，均有明显的响应，说明产生了较大干扰。
通过测试例4-1至4-3能够看出，本发明的电化学生物传感器用电极作为工作电极时，可以用于检测生物活体的葡萄糖和/或乳酸浓度，而且葡萄糖与乳酸之间无干扰。而通过测试对比例4-1至4-7能够看出，未采用本发明的方法制得的电化学生物传感器用电极，存在无法检测或检测值不准确的问题。
通过测试例5-1能够看出，本发明制备的电化学生物传感器用电极能够实现对葡萄糖和/或乳酸的高选择性、高灵敏度检测，且两者之间无干扰。
以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种电化学生物传感器用电极，其特征在于，该电极包括基底电极，以及形成于基底电极表面的修饰层，所述修饰层为含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的复合层。
2.根据权利要求1所述的电化学生物传感器用电极，其中，以1cm2的基底电极计，所述修饰层中含有5-180μg石墨炔；
优选地，所述石墨炔的平均粒径为5-10μm。
3.根据权利要求1所述的电化学生物传感器用电极，其中，以1cm2的基底电极计，所述修饰层中含有1-20μg催化剂；
优选地，所述催化剂为亚甲基绿、亚甲基蓝、亮甲酚蓝和甲苯胺蓝中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的电化学生物传感器用电极，其中，所述脱氢酶为葡萄糖脱氢酶或乳酸脱氢酶；
优选地，以1cm2的基底电极计，所述修饰层中含有5-20U葡萄糖脱氢酶；
优选地，以1cm2的基底电极计，所述修饰层中含有15-30U乳酸脱氢酶。
5.根据权利要求1所述的电化学生物传感器用电极，其中，所述基底电极为玻碳电极、金电极、铂电极或碳纤维电极。
6.权利要求1-5中任意一项所述的电化学生物传感器用电极的制备方法，包括以下步骤：
(1)将石墨炔与催化剂水溶液进行混合、离心、洗涤和第一干燥，得到石墨炔和催化剂的混合物；
(2)将所述混合物与脱氢酶水溶液进行混合，得到含有石墨炔、催化剂和脱氢酶的分散液；
(3)将所述分散液滴涂到基底电极表面并进行第二干燥，得到电化学生物传感器用电极，
其中，所述电极包括形成于基底电极表面的包含石墨炔、催化剂和脱氢酶的修饰层。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述石墨炔的平均粒径为5-10μm；
优选地，所述催化剂为亚甲基绿、亚甲基蓝、亮甲酚蓝和甲苯胺蓝中的一种或多种；
优选地，所述脱氢酶为葡萄糖脱氢酶或乳酸脱氢酶；
优选地，所述基底电极为玻碳电极、金电极、铂电极或碳纤维电极；
优选地，石墨炔、催化剂和脱氢酶的投料量满足在电化学生物传感器用电极中，以1cm2的基底电极计，所述修饰层中含有5-180μg石墨炔，1-20μg催化剂和5-20U葡萄糖脱氢酶或15-30U乳酸脱氢酶。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述第一干燥的条件包括：干燥的温度为15-60℃，干燥的时间为10-20min；
所述第二干燥的条件包括：干燥的温度为0-4℃，干燥的时间为60-90min。
9.一种电化学生物传感器，该传感器包括权利要求1-5中任意一项所述的电化学生物传感器用电极。
10.权利要求9所述的电化学生物传感器在检测生物活体、离体样品的葡萄糖和/或乳酸浓度中的应用。
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