CN106442667B - 一种柿单宁@石墨烯@Pt-Pd无酶传感器检测血糖的方法 - Google Patents

一种柿单宁@石墨烯@Pt-Pd无酶传感器检测血糖的方法 Download PDF

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Abstract

一种柿单宁@石墨烯@Pt‑Pd无酶传感器检测血糖的方法，以柿单宁为原料，利用一步还原法制备了柿单宁@石墨烯@Pt‑Pd纳米复合材料。将柿单宁@石墨烯@Pt‑Pd纳米复合材料修饰到金电极表面，利用铂钯合金和石墨烯材料的高催化特性，构建了无酶葡萄糖电化学传感器。结果表明柿单宁@石墨烯@Pt‑Pd无酶血糖传感器的最佳检测电位为‑0.3V，最佳体系pH值为7‑8。在0.01‑0.40 mol/L范围内葡萄糖浓度和相应电流值呈良好的线性关系，最低检测限为1.43 mmol/L。本发明提供了一种高灵敏度、高选择性的快速检测血糖的无酶电化学检测方法。

Description

一种柿单宁@石墨烯@Pt-Pd无酶传感器检测血糖的方法
技术领域
本发明属于生物医学工程领域，具体涉及一种基于纳米复合材料的无酶电化学检测血糖的方法。
背景技术
柿单宁是一种资源丰富、价廉易得的天然高分子，存在于柿果使其呈涩味的酚类物质，主要由儿茶素、儿茶素-3-棓酸、棓儿茶素和棓儿茶素-3-棓酸等四种单体组成，其组成比依次是1:1:2:2，分子量约为15000。柿单宁含有大量邻位酚羟基，能与多种金属离子通过络合反应或静电作用结合，对金属离子具有很强的降价吸附能力。
血液中的葡糖糖（Glucose）简称血糖，是重要的生理参数。葡萄糖电化学传感器主要由修饰电极和变换器组成，其中修饰电极可以选择性地催化葡萄糖在电极表面的氧化反应，变换器则把发生反应的化学信号转换为电信号，并通过仪表显示出来。一般来说，按有无使用葡萄糖氧化酶将葡萄糖电化学传感器分为两类：基于酶的葡萄糖电化学传感器和无酶葡萄糖电化学传感器。基于酶的电化学葡萄糖传感器具有灵敏度高、选择性强和检出限低的优点。然而，酶传感器实际应用过程存在许多不足，如酶容易受到温度、pH、有毒化学物质等影响而失活。公开号为CN103389333A发明专利提供一种基于复合纳米材料修饰电极的新型血糖快速检测装置，新型纳米材料修饰的电极主要是RGO-Au-PTBO/-GOx葡萄糖生物传感器或RGO-TiO2-Pt/-GOx葡萄糖生物传感器或RGO-Au-Pt/-GOx葡萄糖生物传感器。公开号为CN103267786A发明公开了一种微型针式无酶葡萄糖传感器电极及其制备方法，电极是由石墨烯纳米纤维负载的Pt-Pb纳米花组成，可在微型针电极表面构筑无酶葡萄糖传感器。开发高稳定性、高灵敏性、高选择性的无酶葡萄糖电化学传感器具有广泛的应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于无酶葡萄糖电化学传感器高灵敏度、高选择性的快速检测血糖含量的方法，血糖含量最低检测限为1.43mmol/L。以柿单宁为原料，利用一步还原法直接制备柿单宁@石墨烯@Pt-Pd纳米复合材料，而后将该纳米复合材料修饰到金电极表面，利用铂钯合金和石墨烯功能材料的高催化特性，构建一种高灵敏的无酶葡萄糖电化学传感器，为糖尿病中的血糖检测提供高灵敏度、高选择性的快速检测方法。
为了解决这个技术问题，本发明的技术方案如下（未注明的用量和比例以质量计）：
1.石墨烯的处理
按照0.1 mg/mL浓度比例称取氧化石墨烯，将其置于二次蒸馏水中，超声、离心、去上清液，制成0.1 mg/mL氧化石墨烯；取0.1 mg/mL氧化石墨烯溶液，加入抗坏血酸还原氧化石墨烯，超声、静置，得到0.1 mg/mL还原型氧化石墨烯溶液；
2.石墨烯@Pt-Pd复合纳米材料的制备
采用一步还原法制备石墨烯@Pt-Pd复合纳米材料。取10.0 mL 0.1 mg/mL还原型氧化石墨烯溶液，加入2.0 mL 0.01 g/mL HPtCl4 和2.0 mL 0.05g/mL Pd(NO3)2 溶液，超声混匀，搅拌，缓慢地加入抗坏血酸10.0 mg；将搅拌后的溶液离心得黑色沉淀，用水洗涤，干燥，即得石墨烯/Pt-Pd复合纳米材料；
3.柿单宁@石墨烯@Pt-Pd复合纳米材料的制备
取10.0 mg石墨烯@Pt-Pd复合纳米材料、20.0 mg柿单宁于10.0 mL蒸馏水中，超声分散，得到1.0 mg/mL的柿单宁@石墨烯@Pt-Pd复合纳米材料的悬浮液；
4.金电极的预处理
金电极在使用前，依次用粒径为1.0μm、0.3μm和0.05μm的Al2O3抛光粉在鹿皮上打磨抛光，经二次蒸馏水冲洗；把电极依次置于蒸馏水、无水乙醇、蒸馏水中超声5min，用蒸馏水水清洗后，晾干，置于0.5 mol/LH2SO4溶液中进行电化学循环伏安扫描活化10圈，最后用蒸馏水水冲洗干净备用；
5.无酶葡萄糖传感器的制备
移取5μL柿单宁@石墨烯@Pt-Pd复合纳米材料悬浮液，滴在已抛光好的金电极表面，于室温下自然晾干，反复滴加3次，得到柿单宁@石墨烯@Pt-Pd复合纳米材料修饰的金电极。
6.葡萄糖的检测
采用三电极体系，以铂电极作为辅助电极，饱和甘汞电极作为参比电极，修饰后的金电极作为工作电极，以pH为7.4、含0.l mol/LKCl的0.1 mol/L PBS作为电解质溶液，利用电化学工作站，采用电流-时间法(i-t)进行葡萄糖的计时响应测量。测量时，连续滴加一定浓度葡萄糖，工作时间为300s，间隔时间为50 s，同时通过磁力搅拌器搅拌溶液。
被检测葡萄糖的浓度为0.1 mol/L，每隔50 s滴加100μL的葡萄糖溶液，所得电流-时间（i-t）曲线，可以看出，50s、100s、150s、200s、250s处有明显的电流变化，且相应时间较短，约为2.5s。
结果表明柿单宁@石墨烯@Pt-Pd无酶血糖传感器的最佳检测电位为-0.3V，最佳体系pH值为7-8。在最佳实验条件下，0.01-0.40 mol/L范围内的葡萄糖浓度和相应电流值呈良好的线性关系，最低检测限为1.43 mmol/L。
抗干扰实验。抗坏血酸对响应电流值的影响为1.66%，L-多巴胺对响应电流的影响为2.25%，尿酸对响应电流值的影响为0.60%，二羟基苯乙酸对响应电流值的影响为2.25%。所加入的干扰物质对构建的无酶血糖传感器的影响较小。实验表明此方法构建的无酶血糖传感器灵敏度高、选择性好，经优化后有望应用于临床实际样本的检测，为糖尿病中的血糖检测提供高灵敏度、高选择性的快速检测方法。
本发明与现有技术相比具有如下优点
1.本专利以柿单宁为原料，利用一步还原法直接制备柿单宁@石墨烯@Pt-Pd纳米复合材料，而后将柿单宁@石墨烯@Pt-Pd复合物修饰到金电极表面，构建无酶葡萄糖电化学传感器。该传感器的原理是利用电极表面的柿单宁@石墨烯@Pt-Pd复合材料的高催化特性，催化葡萄糖分子在电极表面的电化学氧化，而后将电流信号在仪器中显示出来。柿单宁@石墨烯@Pt-Pd复合纳米材料在检测反应过程中主要起到两个方面的的作用：①由于纳米粒子的比表面积大，从而增加了电极面表与葡萄糖的接触面积，更好的催化葡萄糖氧化；②葡萄糖氧化后，Pt-Pd纳米粒子起到快速传递电子的作用，实现化学信号到电信号的转化。
2.柿单宁@石墨烯@Pt-Pd无酶血糖传感器的最佳检测电位为-0.3V，最佳体系pH值为7-8。在最佳实验条件下，0.01-0.40 mol/L范围内的葡萄糖浓度和相应电流值呈良好的线性关系，相关系数为0.9987，最低检测限为1.43 mmol/L。在抗干扰实验中，所加入的干扰物质对构建的无酶血糖传感器的影响较小，尤其是尿酸，对响应电流值的影响仅为0.6%。
附图说明
图1 柿单宁@石墨烯@Pt-Pd无酶血糖传感器的循环伏安表征图
图2 柿单宁@石墨烯@Pt-Pd复合纳米材料用于电化学检测葡萄糖的可行性研究
图3 柿单宁@石墨烯@Pt-Pd无酶血糖传感器检测葡萄糖的工作曲线
图4 柿单宁@石墨烯@Pt-Pd无酶血糖传感器检测葡萄糖的抗干扰实验
具体实施方式
下面结合附图，进一步将本专利进行说明。实施步骤如下：
1.石墨烯的处理
（1）称取5.0 mg氧化石墨烯，将其置于50 mL二次蒸馏水中，利用细胞破碎仪超声2h。
（2）利用超速离心机将超声后的溶液在3000r/min下离心10min，去上清液，得到0.1 mg/ml氧化石墨烯溶液；
（3）取10.0 mL 0.1 mg/ml氧化石墨烯溶液于烧杯中，加入10.0 mg抗坏血酸，还原氧化石墨烯，在25℃下用细胞破碎仪超声2 h，在25℃下静置48 h，得到0.1mg/mL还原型氧化石墨烯溶液。
2.石墨烯@Pt-Pd复合纳米材料的制备
（1）取10.0mL石墨烯溶液，加入2.0 mL 0.01g/mL HPtCl4 和2.0 mL 0.05g/mL Pd(NO3)2 溶液，用细胞破碎仪超声混匀30 min；
（2）超声均匀后，利用磁力搅拌机搅拌20 h，并缓慢地加入抗坏血酸10.0mg；
（3）将搅拌后的溶液在10000r/min下离心15min，去除上层溶液。余下的黑色沉淀用二次蒸馏水洗涤后，5000 r/min下离心5 min，反复操作3次。收集黑色沉淀在60℃烘箱内干燥12 h，即为石墨烯@Pt-Pd复合纳米材料。
3.柿单宁@石墨烯@Pt-Pd复合纳米材料的制备
取10.0 mg石墨烯/Pt-Pd复合纳米材料、20.0 mg柿单宁于10.0 mL 二次蒸馏水中，超声分散90 min，形成1.0 mg/ml的柿单宁@石墨烯@Pt-Pd复合纳米材料的悬浮液；
4.金电极的预处理
（1）金电极在使用前，首先依次用粒径为 1.0μm、0.3μm和0.05μm的Al2O3抛光粉在鹿皮上打磨抛光，经二次蒸馏水反复冲洗；
（2）把电极依次置于蒸馏水、无水乙醇、蒸馏水中超声5min，用蒸馏水水清洗后，在空气中晾干，置于0.5mol/L H2SO4溶液中，进行电化学循环伏安扫描活化10圈，然后将电极置于铁氰化钾/亚铁氰化钾溶液中分别进行循环伏安扫描和交流阻抗扫描；最后用蒸馏水水冲洗干净备用。
5.无酶葡萄糖传感器的制备
移取5μL柿单宁@石墨烯@Pt-Pd复合纳米材料的悬浮液，滴在已预处理好的金电极表面，于室温下自然晾干，反复滴加3次，得到柿单宁@石墨烯@Pt-Pd复合纳米材料修饰的金电极。
6.无酶葡萄糖传感器的表征
采用循环伏安法方法对构建的无酶葡萄糖传感器的电化学行为表征与分析。图1是柿单宁@石墨烯@Pt-Pd无酶血糖传感器的表征图。
7.葡萄糖的检测
采用三电极体系，以铂电极作为辅助电极，饱和甘汞电极作为参比电极，柿单宁@石墨烯@Pt-Pd复合纳米材料修饰的金电极作为工作电极，以pH为7.4、含0.l mol/L KCl的0.1 mol/L PBS作为电解质溶液，利用电化学工作站(CHI660D)，采用电流-时间法(i-t)进行葡萄糖的计时响应测量。每隔50 s滴加100 μL浓度为0.1 mol/L的葡萄糖溶液，所得电流-时间（i-t）曲线，如图2所示。从图2中可以看出，50s、100s、150s、200s、250s处有明显的电流变化，且相应时间较短，约为2.5s。证明葡萄糖在柿单宁@石墨烯@Pt-Pd复合纳米材料修饰的金电极表面发生了氧化还原反应，产生了较稳定的电流值。
柿单宁@石墨烯@Pt-Pd复合纳米材料在检测反应过程中主要起到两个方面的作用：①由于纳米粒子的比表面积大，从而增加了电极表面与葡萄糖的接触面积，更好的催化葡萄糖氧化；②葡萄糖氧化后，Pt-Pd纳米粒子起到快速传递电子的作用，实现化学信号到电信号的转化。
7.检测条件的优化
在其它检测条件不变的情况下，在不同的初始电位下测量相同浓度的葡萄糖溶液，以确定最佳检测电位；在初始电位和葡萄糖浓度不变的情况下，在PBS溶液中加入适量的酸或碱，改变体系的pH值，测量相应电流值，确定最佳体系pH。结果表明：柿单宁@石墨烯@Pt-Pd无酶血糖传感器的最佳检测电位为-0.3V，最佳体系pH值为7-8。
8.工作曲线的绘制
在最优实验条件下，分别对不同浓度的葡萄糖进行检测，获得工作曲线，见图3，计算出最低检测限。在最佳实验条件下，0.01-0.40 mol/L范围内的葡萄糖浓度和相应电流值呈良好的线性关系，工作曲线为y=1.3046x-0.00186，y为传感器响应电流值，x为葡萄糖浓度，相关系数为0.9987，最低检测限为1.43 mmol/L。
9. 抗干扰实验
以抗坏血酸(AA)、多巴胺(DA)、尿酸(UA)、二羟苯乙酸(DOPAC)等为干扰物质，将其添加到葡萄糖溶液中，按照最佳条件进行电化学检测，并计算干扰物质对葡萄糖响应电流值的影响，如图4所示。。结果表明，在抗干扰实验中，抗坏血酸对响应电流值的影响为1.66%，L-多巴胺对响应电流值的影响为2.25%，尿酸对响应电流值的影响为0.60%，二羟基苯乙酸对响应电流值的影响为2.25%。所加入的干扰物质对构建的无酶血糖传感器的影响较小，尤其是尿酸，对电流的干扰仅为0.60%。
实验表明此方法构建的无酶血糖传感器灵敏度高、选择性好，经优化后有望应用于临床实际样本的检测，为糖尿病中的血糖检测提供高灵敏度、高选择性的快速检测方法。

Claims (1)

1.一种柿单宁@石墨烯@Pt-Pd无酶传感器检测血糖的方法，包括如下步骤：
步骤一：石墨烯的处理
按照0.1 mg/mL浓度比例称取氧化石墨烯，将其置于二次蒸馏水中，超声、离心、去上清液，制成0.1 mg/mL氧化石墨烯；取0.1 mg/mL氧化石墨烯溶液，加入抗坏血酸还原氧化石墨烯，超声、静置，得到0.1 mg/mL还原型氧化石墨烯溶液；
步骤二：石墨烯@Pt-Pd复合纳米材料的制备
取10.0 mL 0.1 mg/mL还原型氧化石墨烯溶液，加入2.0 mL 0.01 g/mL HPtCl4和2.0mL 0.05g/mL Pd(NO3)2 溶液，超声混匀，搅拌，缓慢地加入抗坏血酸10.0 mg；将搅拌后的溶液离心得黑色沉淀，用水洗涤，干燥，即得石墨烯@Pt-Pd复合纳米材料；
步骤三：柿单宁@石墨烯@Pt-Pd复合纳米材料的制备
取10.0 mg石墨烯@Pt-Pd复合纳米材料、20.0 mg柿单宁于10mL蒸馏水中，超声分散，得到1.0 mg/mL的柿单宁@石墨烯@Pt-Pd复合纳米材料的悬浮液；
步骤四：金电极的预处理
金电极在使用前，依次用粒径为1.0μm、0.3μm和0.05μm的Al2O3抛光粉在鹿皮上打磨抛光，经二次蒸馏水冲洗；把电极依次置于蒸馏水、无水乙醇、蒸馏水中超声5min，用蒸馏水清洗后，晾干，置于0.5mol/L H2SO4溶液中进行电化学循环伏安扫描活化10圈，最后用蒸馏水冲洗干净备用；
步骤五：无酶葡萄糖传感器的制备
移取5μL柿单宁@石墨烯@Pt-Pd复合纳米材料的悬浮液，滴在已预处理好的金电极表面，晾干，反复滴加3次，得到柿单宁@石墨烯@Pt-Pd复合纳米材料修饰的金电极；
步骤六：葡萄糖的检测
采用三电极体系，以铂电极作为辅助电极，饱和甘汞电极作为参比电极，修饰后的金电极作为工作电极，以pH为7.4、含0.l mol/LKCl的0.1mol/L PBS作为电解质溶液，利用电化学工作站，采用电流-时间法进行葡萄糖的计时响应测量；通过电流-时间曲线计算得到待测血液中葡萄糖的浓度。
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