CN106404873B - 一种用于检测过氧化氢的电化学生物传感器及制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于检测过氧化氢的电化学生物传感器及制备与应用，制备主要包括：（1）合成二氧化硅‑三维石墨烯复合材料；（2）对合成的二氧化硅‑三维石墨烯复合材料进行氮碳掺杂；（3）对玻碳电极进行预处理；（4）采用滴涂法制备氮碳掺杂的二氧化硅‑三维石墨烯复合材料修饰的玻碳电极；（5）把玻碳电极在氯金酸溶液中采用计时电流法制备金纳米‑氮碳掺杂的二氧化硅‑三维石墨烯玻碳电极；（6）将玻碳电极浸入含有双巯基修饰的G DNA溶液中培育2‑4 h；（7）把复合电极浸入到含有氯高铁血红素溶液中10‑14 h。本发明具有良好的稳定性、重现性、特异性高，灵敏度强；且操作简单方便快速。可以对生物样品、化妆品等样品中过氧化氢含量的检测。

Description

一种用于检测过氧化氢的电化学生物传感器及制备与应用
技术领域
本发明涉及分析化学与电化学传感器分析领域，具体涉及一种基于Au/N-C/SiO2/3D-GONs复合材料的检测过氧化氢的电化学生物传感器以及制备方法与应用。
背景技术
过氧化氢是普遍存在于自然界是的一种成分。例如：在生物体肝脏中生成；存在于污染的大气或者雨水中；酸乳酪等乳制品使用的部分乳酸菌也能生成过氧化氢。在食品工业中，过氧化氢主要用于消毒、杀菌、漂白、脱色等，也用作生产加工助剂。过氧化氢作为一种重要的漂白剂和氧化剂也被广泛应用于染发，烫发类化妆品中，由于其具有很强的氧化性，过量使用会对皮肤，毛发产生很严重的损伤。
目前对过氧化氢检测的研究方法包括高效液相、荧光共振转移等等。虽然这些方法能够准确的检测过氧化氢，但是他们都存在一些缺点比如复杂的设备，复杂的处理过程，昂贵的价格等等。
20世纪90年代末，Sen等首次报道了具有过氧化物酶催化活性的脱氧核酶——G-四联体型脱氧核酶。G-四联体是由大量鸟嘌呤序列的DNA通过Hoogsteen氢键形成的特殊的二级结构，但G-四联体只有在单价阳离子存在下才能稳定形成，其中K+的稳定效果最为显著，并能发挥生物学效应。氯化血红素可作为过氧化物模拟酶，与传统的过氧化氢酶相比，其价格低廉，稳定，可在较宽的酸度和温度范围内使用。当某些G-四联体与氯化血红素作用时，可极大地增强氯化血红素的酶活性，因此，G-四联体在K+及氯化血红素的共同作用下，可形成具有显著过氧化氢酶活性的DNA模拟酶。但是目前的酶生物传感器的电极比表面积过小，导电性不好、信号相应强度过弱、灵敏度过低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测过氧化氢的电化学生物传感器及其制备与应用以解决目前的酶生物传感器的电极比表面积过小，导电性不好、信号相应强度过弱、灵敏度过低等问题。
一种用于检测过氧化氢的电化学生物传感器的制备方法，主要包括以下步骤：
（1）合成二氧化硅-三维石墨烯（SiO2/3D-GONs）复合材料的合成；
（2）对步骤（1）所得二氧化硅-三维石墨烯复合材料进行氮、碳掺杂（N-C/SiO2/3D-GONs）；
（3）对玻碳电极进行预处理；
（4）采用滴涂法制备氮碳掺杂的二氧化硅-三维石墨烯复合材料修饰的玻碳电极；
（5）把步骤（4）中修饰好的玻碳电极在氯金酸溶液中采用计时电流法制备金纳米-氮碳掺杂的二氧化硅-三维石墨烯（Au/N-C/SiO2/3D-GONs）玻碳电极；
（6）将步骤（5）中修饰好的玻碳电极浸入含有双巯基修饰的G DNA溶液中培育2-4h；
（7）把步骤（6）得到的复合电极侵入到含有氯高铁血红素溶液中10-16 h。
其中，G四联体DNA的序列5-(HS)2-CH-(CH2)5-CCCAAATTT-GGGTAGGGCGGGTTGGG-3’；所述二氧化硅和三维石墨烯的质量比为4:7，所述N和C的质量比为2:3。
进一步的，步骤（4）所述氮碳掺杂的二氧化硅-三维石墨烯复合材料修饰的玻碳电极的制备方法为：取5.0-7.0 mg 氮碳掺杂的二氧化硅-三维石墨烯复合材料粉末先分散于10mL N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液中，超声1-1.5h，然后稀释，再取稀释好的溶液滴加到玻碳电极上，室温干燥6-8h。
进一步的，步骤（5）所述金纳米-氮碳掺杂的二氧化硅-三维石墨烯玻碳电极的制备方法为：把步骤（4）得到的氮碳掺杂的二氧化硅-三维石墨烯玻碳电极在含有10-60 µM的氯金酸溶液中采用计时电流法高电位为1.1 V低电位为-1.0 V沉积金纳米5-20 s。
对玻碳电极进行预处理方法为：将玻碳电极用α-A12O3抛光粉抛光；洗涤，分别在去离子水和乙醇中超声10 min。
进一步的，所述三维石墨烯的合成主要包括：将氧化石墨烯，配置成浓度为1mg·mL-1的氧化石墨烯溶胶，加入不锈钢反应釜内衬中，在180℃的条件下反应12h，反应结束后自然冷却至室温，再经过冷冻干燥。
进一步的，所述二氧化硅-三维石墨烯的合成主要包括：取三维石墨烯加入到乙醇溶液中并超声30-45min，再加入氨丙基三乙氧基硅烷和氨水并磁力搅拌6h，再滴加体积比为19:1的乙醇/正硅酸四乙酯混合溶液，搅拌24h，最后离心、真空干燥。
进一步的，二氧化硅-三维石墨烯复合材料进行氮碳掺杂主要包括：称取一定量的二氧化硅-三维石墨烯复合材料和多巴胺混合于pH=8.5的PBS缓冲溶液中加热到80℃并搅拌12h，然后离心、洗涤、真空干燥，再把获得的固体粉末放入管式炉中，在N2的氛围中以5℃·min-1的升温速率加热到700℃，保持1h。
上述检测过氧化氢电化学生物传感器制备方法得到的检测过氧化氢的电化学生物传感器。
上述检测过氧化氢的电化学生物传感器的应用，用于检测生物样品、化妆品等样品中的过氧化氢的含量。
进一步的，过氧化氢的检测主要包括以下步骤：
（1）用pH=7.4含有0.1M的KCl和0.1M的NaCl的磷酸缓冲溶液配置浓度为不同浓度的过氧化氢溶液；
（2）利用所述电化学生物传感器在不同浓度的过氧化氢溶液中利用循环伏安法进行测试，记录下稳定电流值，并得到线性曲线；
（3）取待检样品溶于pH=7.4含有0.1M的KCl和0.1M的NaCl的磷酸缓冲溶液中；
（4）将所述电化学生物传感器作为工作电极在三电极系统中，用循环伏安法，以20-100 mV s-1的扫描速度进行测试，并得到稳定的电流值，记录下电流值，与标准曲线对照计算出待测溶液的浓度。
本发明的Au/N-C/SiO2/3D-GONs复合材料，既具有氧化石墨烯所有良好的性质，其独特的结构使其具有优异的热学、力学以及化学性质，并且由于是三维结构，不但增大了整个材料的比表面积还为G四联体的修饰引入了更多的活性位点。而且在金纳米、二氧化硅纳米粒子以及氮碳原子的相互协同作用，使整体性能有明显的增强，使导电能力、信号强度和灵敏度均增强。金纳米不但能够提供双巯基修饰的DNA分子修饰的位点，而且也可以增强修饰材料的导电能力。二氧化硅纳米粒子的加入不但可以增加复合材料的比表面积，负载更多的G四联体，而且在很大程度上增强了信号响应强度。由于石墨烯中存在碳碳双键，有较强的π-π*共轭效应，很容易发生团聚，氮原子和碳原子的引入不但可以增强复合材料的导电能力，还可以防止三维氧化石墨烯发生团聚。同时氮碳杂原子的掺杂可以在氧化石墨烯表面形成大量有效的催化活性位点，这些活性位点有利于加快电子的传递速率，促进过氧化氢的分解。层层组装得到的N-C/SiO2/3D-GONs复合材料分散性好，导电性好。将具有过氧化氢酶催化活性的DNA模拟酶通过非共价键吸附（包括静电组装或SH-与金、铂等的相互作用）的方式固定于这种复合材料上制备的生物传感器具有显著增强催化还原过氧化氢的作用。在本发明中，电极表面的金纳米和双巯基修饰的G四联体DNA通过Au-S化学键结合可以有效的固定G四联体DNA分子信标，由于DNA的末端引入了两个巯基，可以增强金纳米对双巯基修饰的DNA的吸附力，使DNA更牢固的吸附在电极表面。由于K+、Na+等阳离子的存在可以促进某些DNA聚合形成G四联体，所以在配置缓冲溶液时加入了0.1M的KCl和0.1M的NaCl。另一方面氯化血红素能够嵌入到G四联体结构中从而和G四联体DNA分子结合形成一种对过氧化氢具有催化活性的类过氧化氢酶。由于酶本身的高效性，再加上电化学方法本身的快速灵敏的特点，所构建的电化学生物传感器能够快速对不同浓度的过氧化氢产生反应。在存在过氧化氢时，由于氯化血红素和G四联体结合生成的类过氧化氢酶对过氧化氢具有很好的催化作用，类过氧化氢酶就会催化过氧化氢分解。过氧化氢失去电子，传递到电极表面，从而产生电流。通过电流的大小来实现对过氧化氢的定量检测。同时由于Au/N-C/SiO2/3D-GONs复合材料的存在，加快了电子从过氧化氢到电极的传递速率，从而增大了反应产生的电流，从而提高了传感器的灵敏度。
与现有技术相比，本发明制备的检测过氧化氢的电化学生物传感器具有如下优点：1）具有良好的稳定性、重现性、对过氧化氢具有很高的特异性，不易受到检测样品中其他物质的干扰；2）利用酶的高效以及Au/N-C/SiO2/3D-GONs复合材料促进电子的传导作用，极大地增加了传感器的灵敏度；3）操作简单方便，能够快速准确检测样品中过氧化氢的含量。本发明的电化学生物传感器可以实现对生物样品、化妆品等样品中过氧化氢含量的检测。
附图说明
图1为本发明的玻碳电极在不同阶段的在5 mM铁氰化钾/亚铁氰化钾中的循环伏安图，其中a为玻碳电极；b为Au/N-C/SiO2/3D-GONs复合材料修饰玻碳电极；c为H2O2生物传感器；
图2为发明的生物传感器在不同阶段的电化学阻抗，其中a为玻碳电极；b为Au/N-C/SiO2/3D-GONs复合材料修饰玻碳电极；c为H2O2生物传感器，插图为模拟电路图；
图3为H2O2生物传感器在氯化血红素中浸泡不同时间，传感器的响应效果， (a)4h；(b)8h；(c)12h；(d)16h；(e)20h；(f)24h；
图4为传感器在不同H2O2浓度下的响应， (a)5mM；(b)10mM；(c)15mM；(d)20mM；(e)30mM；(f)40mM；(g)50mM；
图5为标准曲线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1
一种检测过氧化氢的电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）玻碳电极预处理：玻碳电极经0.05μm的α-A12O3抛光粉抛光后，用去离子水冲洗干净，并分别在去离子水和乙醇中超声10 min。采用三电极系统检测，工作电极为玻碳电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极，在0.5 M硫酸中，设置电压为-0.2～1.6V，对玻碳电极进行循环伏安扫描，检测完毕后，用去离子水冲洗电极，吹干电极表面，备用。
（2）Au/N-C/SiO2/3D-GONs修饰玻碳电极的制备：
a.三维石墨烯的合成：将氧化石墨烯，配置成浓度为1mg·mL-1一定体积的氧化石墨烯溶胶待用，取50mL氧化石墨烯凝溶胶加入到100mL的不锈钢反应釜内衬中，在180℃的条件下反应12h，反应结束后自然冷却至室温，再经过冷冻干燥即得到三维氧化石墨烯（3D-GONs）。
b.二氧化硅-三维石墨烯的合成：取50mL 3D-GONs加入到100mL的乙醇溶液中并超声30min，再加入2mL氨丙基三乙氧基硅烷（APTS）和1mL氨水并磁力搅拌6h，再滴加把20mL乙醇/正硅酸四乙酯（体积比为19:1）混合溶液，搅拌24h。然后经过离心、真空干燥获得SiO2/3D-GONs固粉末。
c.对 SiO2/3D-GONs复合材料进行N、C掺杂：称取一定量的SiO2/3D-GONs复合材料和多巴胺混合于80mL PBS（pH=8.5）缓冲溶液中加热到80℃并搅拌12h，然后离心、洗涤、真空干燥。再把获得的固体粉末放入管式炉中，在N2的氛围中加热到700℃（升温速率为5℃·min-1）保持1h。
d.采用计时电流法制备Au/N-C/SiO2/3D-GONs修饰玻碳电极：取5.0mg N-C/SiO2/3D-GONs粉末先分散于10ml N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液中，超声1h，取一定体积上述溶液稀释到一定浓度待用，取稀释好的溶液滴加到玻碳电极上，室温干燥6-8h。即得到上述复合材料修饰的玻碳电极；再利用修饰好的玻碳电极在60 µM的氯金酸溶液中采用计时电流法高电位为1.1 V低电位为-1.0 V沉积金纳米5 s。
（3）把步骤（2）得到的Au/N-C/SiO2/3D-GONs复合材料修饰的玻碳电极侵入到含有20µL 10 µM的G四联体DNA溶液中2 h。
（4）把步骤（3）得到的复合电极浸入到含有氯高铁血红素溶液中10 h。
其中，G DNA的序列为5’-(HS)2-CH-(CH2)5-CCCAAATTT-GGGTAGGGCGGGTTGGG-3’。
上述传感器用于检测化妆品中的过氧化氢的步骤主要包括：
（1）用pH=7.4含有0.1M的KCl和0.1M的NaCl的磷酸缓冲溶液配置浓度为0.05 mM、0.1 mM、0.15 mM、0.2 mM、0.25 mM、0.3 mM、0.35 mM、0.4 mM、0.45 mM、0.5 mM的过氧化氢溶液；
（2）用上述修饰的电极在不同浓度的过氧化氢中采用扫描速度为20 mV s-1，利用循环伏安法进行测试记录下电流值；
（3）根据得到的数据作出标准曲线；
（4）把待测化妆品溶解到pH=7.4含有0.1M的KCl和0.1M的NaCl的磷酸缓冲溶液中；
（5）把上述修饰好的电极侵入到50 µL pH=7.4含有0.1M的KCl的磷酸缓冲溶液含有过氧化氢的待测溶液中采用扫描速度为20 mV s-1，利用循环伏安法进行测试。
实施例2
一种检测过氧化氢的电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）玻碳电极预处理：玻碳电极经0.05μm的α-A12O3抛光粉抛光后，用去离子水冲洗干净，并分别在去离子水和乙醇中超声10 min。采用三电极系统检测，工作电极为玻碳电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极，在0.5 M硫酸中，设置电压为-0.2～1.6V，对玻碳电极进行循环伏安扫描，检测完毕后，用去离子水冲洗电极，吹干电极表面，备用。
（2）Au/N-C/SiO2/3D-GONs修饰玻碳电极的制备：
a.三维石墨烯的合成：将氧化石墨烯，配置成浓度为1mg·mL-1一定体积的氧化石墨烯溶胶待用，取50mL氧化石墨烯凝溶胶加入到100mL的不锈钢反应釜内衬中，在180℃的条件下反应12h，反应结束后自然冷却至室温，再经过冷冻干燥即得到三维氧化石墨烯（3D-GONs）。
b.二氧化硅-三维石墨烯的合成：取50mL 3D-GONs加入到100mL的乙醇溶液中并超声45min，再加入2mL氨丙基三乙氧基硅烷（APTS）和1mL氨水并磁力搅拌6h，再滴加把20mL乙醇/正硅酸四乙酯（体积比为19:1）混合溶液，搅拌24h。然后经过离心、真空干燥获得SiO2/3D-GONs固体粉末。
c.对 SiO2/3D-GONs复合材料进行N、C掺杂：称取一定量的SiO2/3D-GONs复合材料和多巴胺混合于80mL PBS（pH=8.5）缓冲溶液中加热到80℃并搅拌12h，然后离心、洗涤、真空干燥。再把获得的固体粉末放入管式炉中，在N2的氛围中加热到700℃（升温速率为5℃·min-1）保持1h。
d.采用计时电流法制备Au/N-C/SiO2/3D-GONs修饰玻碳电极：取7.0mg N-C/SiO2/3D-GONs粉末先分散于10ml N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液中，超声1.5h，取一定体积上述溶液稀释到一定浓度待用，取稀释好的溶液滴加到玻碳电极上，室温干燥8h。即得到上述复合材料修饰的玻碳电极；再利用修饰好的玻碳电极在10 µM的氯金酸溶液中采用计时电流法高电位为1.1 V低电位为-1.0 V沉积金纳米20 s。
（3）把步骤（2）得到的Au/N-C/SiO2/3D-GONs复合材料修饰的玻碳电极侵入到含有20µL 10 µM的G四联体DNA溶液中2-4 h。
（4）把步骤（3）得到的复合电极浸入到含有氯高铁血红素溶液中16 h。
其中，G DNA的序列为5’-(HS)2-CH-(CH2)5-CCCAAATTT-GGGTAGGGCGGGTTGGG-3’。
上述传感器用于检测化妆品中的过氧化氢的步骤主要包括：
（1）用pH=7.4含有0.1M的KCl和0.1M的NaCl的磷酸缓冲溶液配置浓度为0.05 mM、0.1 mM、0.15 mM、0.2 mM、0.25 mM、0.3 mM、0.35 mM、0.4 mM、0.45 mM、0.5 mM的过氧化氢溶液；
（2）用上述修饰的电极在不同浓度的过氧化氢中采用扫描速度为20 mV s-1，利用循环伏安法进行测试记录下电流值；
（3）根据得到的数据作出标准曲线；
（4）把待测化妆品溶解到pH=7.4含有0.1M的KCl和0.1M的NaCl的磷酸缓冲溶液中；
（5）把上述修饰好的电极侵入到50 µL pH=7.4含有0.1M的KCl的磷酸缓冲溶液含有过氧化氢的待测溶液中采用扫描速度为20 mV s-1，利用循环伏安法进行测试。
将实施例1和实施例2的玻碳电极在不同阶段的在5 mM铁氰化钾/亚铁氰化钾中的循环伏安图如图1所示。从图1可以得知电极性能的变化，与裸玻碳电极相比, Au/N-C/SiO2/3D-GONs/GCE修饰后的电极电流得到很大提高。
将实施例1和实施例2的生物传感器在不同阶段的电化学阻抗如图2所示，从图2中可以得出，当把复合材料Au/N-C/SiO2/3D-GONs修饰到玻碳电极上后，电极的阻抗变小了，说明该复合材料增强了电极的导电性能。再把G四联体修饰到电极上后发现阻抗变大了，这是因为G四联体不导电，阻碍了电子的传递，所以阻抗增大。
将实施例1和实施例2的生物传感器在不同阶段的电化学阻抗如图3所示，比较浸泡时间对催化还原H2O2的影响，浸泡时间太短，Au-S键不饱和；时间过长Au-S键饱和，但未与Au成键的-S-DNA会与-Au-S-DNA发生交互，增大空间位阻，影响G四联体复合物与H2O2相互作用。从图中可以发现当浸泡时间为16h时，催化H2O2分解效果最好。
将实施例1和实施例2的生物传感器对不同浓度H2O2进行检测，其结果如图4所示，随着H2O2浓度的增大，H2O2的还原电流逐渐减小。如图5所示，在10-3~1.5×10-1mol/L的浓度范围内，还原峰电流与H2O2浓度呈良好的线性关系，线性方程为y=-17.30211x+0.70337(R2=0.99017)，检测下限为3.8×10-5mol/L。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于检测过氧化氢的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
(1)合成二氧化硅-三维石墨烯复合材料；
(2)对步骤(1)所得二氧化硅-三维石墨烯复合材料进行氮碳掺杂；
(3)对玻碳电极进行预处理；
(4)采用滴涂法制备氮碳掺杂的二氧化硅-三维石墨烯复合材料修饰的玻碳电极；
(5)把步骤(4)中修饰好的玻碳电极在氯金酸溶液中采用计时电流法制备金纳米-氮碳掺杂的二氧化硅-三维石墨烯玻碳电极；
(6)将步骤(5)中修饰好的玻碳电极浸入含有双巯基修饰的G DNA溶液中培育2-4h；
(7)把步骤(6)得到的复合电极浸入到含有氯高铁血红素溶液中10-16h；
所述G DNA的序列为5’-(HS)2-CH-(CH2)5-CCCAAATTT-GGGTAGGGCGGGTTGGG-3’；所述二氧化硅和所述三维石墨烯的质量比为4:7，所述氮和碳的质量比为2:3。
2.根据权利要求1所述用于检测过氧化氢的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述氮碳掺杂的二氧化硅-三维石墨烯复合材料修饰的玻碳电极的制备方法为：取5.0-7.0mg氮碳掺杂的二氧化硅-三维石墨烯复合材料粉末先分散于10mL N-甲基吡咯烷酮溶液中，超声1-1.5h，然后稀释，再取稀释好的溶液滴加到玻碳电极上，室温干燥6-8h。
3.根据权利要求1所述检测过氧化氢电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述金纳米-氮碳掺杂的二氧化硅-三维石墨烯玻碳电极的制备方法为：把步骤(4)得到的氮碳掺杂的二氧化硅-三维石墨烯玻碳电极在含有10-60μM的氯金酸溶液中采用计时电流法高电位为1.1V低电位为-1.0V沉积金纳米5-20s。
4.根据权利要求1所述检测过氧化氢电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述三维石墨烯的合成主要包括：将氧化石墨烯，配置成浓度为1mg·mL-1的氧化石墨烯溶胶，加入不锈钢反应釜内衬中，在180℃的条件下反应12h，反应结束后自然冷却至室温，再经过冷冻干燥。
5.根据权利要求1所述检测过氧化氢电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述二氧化硅-三维石墨烯的合成主要包括：取三维石墨烯加入到乙醇溶液中并超声30-45min，再加入氨丙基三乙氧基硅烷和氨水并磁力搅拌6h，再滴加体积比为19:1的乙醇/正硅酸四乙酯混合溶液，搅拌24h，最后离心、真空干燥。
6.根据权利要求1所述检测过氧化氢电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，对所述二氧化硅-三维石墨烯复合材料进行氮碳掺杂主要包括：称取二氧化硅-三维石墨烯复合材料和多巴胺混合于pH＝8.5的PBS缓冲溶液中加热到80℃并搅拌12h，然后离心、洗涤、真空干燥，再把获得的固体粉末放入管式炉中，在N2的氛围中以5℃·min-1的升温速率加热到700℃，保持1h。
7.权利要求1-6任一项所述检测过氧化氢电化学生物传感器的制备方法得到的检测过氧化氢的电化学生物传感器。
8.根据权利要求7所述检测过氧化氢的电化学生物传感器的应用，其特征在于，用于检测生物样品、化妆品中的过氧化氢的含量。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，过氧化氢的检测主要包括以下步骤：
(1)用pH＝7.4含有0.1M的KCl和0.1M的NaCl的磷酸缓冲溶液配置浓度为不同浓度的过氧化氢溶液；
(2)利用所述电化学生物传感器在不同浓度的过氧化氢溶液中利用循环伏安法进行测试，记录下稳定电流值，并得到线性曲线；
(3)取待检样品溶于pH＝7.4含有0.1M的KCl和0.1M的NaCl的磷酸缓冲溶液中；
(4)将所述电化学生物传感器作为工作电极在三电极系统中，用循环伏安法，以20-100mV s-1的扫描速度进行测试，并得到稳定的电流值，记录下电流值，与标准曲线对照计算出待测溶液的浓度。
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