CN102778571B - 一种离子液体-石墨烯纳米复合物、其制备方法及电化学免疫检测方法 - Google Patents

一种离子液体-石墨烯纳米复合物、其制备方法及电化学免疫检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及电化学免疫检测领域,特别涉及一种离子液体-石墨烯纳米复合物、其制备方法及电化学免疫检测方法。该检测方法采用双抗体夹心法,使固载在电极表面的脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子抗体(anti-APE1)与样品溶液中的脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子(APE1)发生免疫反应,再和室温离子液体-石墨烯纳米复合物与碱性磷酸酯酶(ALP)及二茂铁(Fc)标记的anti-APE1共耦合物结合。基于ALP-Fc-anti-APE与室温离子液体-石墨烯纳米复合物的电化学活性,测得循环伏安催化电流值进而检测检测样品中APE1的浓度。本发明提供的电化学免疫检测方法线性响应范围为0.1-80pg/mL,检测下限为0.04pg/mL,特异性好,灵敏度高。

Description

一种离子液体-石墨烯纳米复合物、其制备方法及电化学 免疫检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及电化学免疫检测领域,特别涉及一种离子液体-石墨烯纳米复合物、 其制备方法及电化学免疫检测方法。
背景技术
[0002] 骨肉瘤是一种常见于儿童和青少年的恶性骨肿瘤,化疗是目前提高骨肉瘤患者 生存率的主要手段,然而目前仍有10%〜25%的骨肉瘤患者对现行化疗方案反应差,根 本原因是肿瘤细胞对化疗药物有抗药性。脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子抗体 (anti-APEl)是生物大分子中极具结构和功能特点的典范分子,它由DNA修复和氧化还原 两个相对独立的功能区构成,是DNA碱基切除修复(base excision repair, BER)途径的关 键限速酶,不但能修复辐射、烷化和氧化引起的DNA损伤,而且能通过氧化还原机制调节多 种转录因子(如即-1^8,4?-1481-1,?53,及!1正-1 〇等)的0嫩结合活性及下游靶基因的 表达,参与氧化应激、细胞周期调控及凋亡等多种关键的细胞反应。目前多种证据提示ΑΡΕΙ 蛋白的不正常表达与代谢异常、分化性疾病、肿瘤等病理过程密切相关,而ΑΡΕΙ表达水平 及其分布失调则与肿瘤放化疗抵抗、肿瘤诊断和预后息息相关。目前ΑΡΕΙ的检测方法多为 免疫组化方法、血清学方法。但是免疫组化方法对检验仪器要求较高,只能定性检测ΑΡΕ1, 无法对ΑΡΕΙ的含量进行准确测定,血清学方法准确性、特异性不高。
[0003] 电化学免疫分析法(Electrochemical Immunoassay, ECIA)是将免疫技术与电化 学检测结合的一种免疫分析新方法,基于抗原和抗体的特异性反应,将一些既易测定又具 有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上,通过这些标记物的增强放大效应来 显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。电化学免疫分析的标记物主要有两类:生物酶 及电化学活性物质。用作标记物的电化学活性物质为具有电化学氧化还原性质的金属离子 和电活性的有机功能基团。
[0004] 纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围(1〜100nm)或由它们 作为基本单元构成的材料,这大约相当于10〜100个原子紧密排列在一起的尺度。由于纳 米材料具有的高比表面积、高活性、特殊物理性质及小尺寸,使得纳米材料从一个惰性体转 变为一个活泼的能提供电子和获取电子的物体,将其引入传感器的构建中可明显增强传感 器的响应速度、灵敏度、选择性等。
[0005] 因此,提供一种灵敏度高、特异性好的基于复合纳米颗粒的电化学免疫检测方法 用来检测脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子抗体(anti-APEl),对癌症的早期诊断、 病情监测、判断预后及其制定合理的治疗方案和评估疗效具有重要意义。
发明内容
[0006] 有鉴于此,本发明提供一种离子液体-石墨烯纳米复合物、其制备方法及电化学 免疫检测方法。该电化学免疫检测方法线性响应范围为〇. l-80pg/mL,检测下限为0. 04pg/ mL,特异性好,灵敏度高。
[0007] 为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
[0008] 本发明提供了一种离子液体-石墨烯纳米复合物的制备方法,包括如下步骤:
[0009] 步骤1 :取石墨烯用第一阳离子表面活性剂的水溶液分散、超声处理后制得第一 阳离子表面活性剂-石墨烯复合物;
[0010] 步骤2 :取所述第一阳离子表面活性剂-石墨烯复合物与第二阳离子表面活性剂 的水溶液混合制得石墨稀纳米片;
[0011] 步骤3 :取所述石墨烯纳米片经超声分散后与离子液体混合,即得。
[0012] 所述第一阳离子表面活性剂选自十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基氯 化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵或季胺盐型gemini表面活性剂 C12C6C12Br2 ;
[0013] 所述第二阳离子表面活性剂选自聚对苯乙烯磺酸钠、聚丙烯酸钠或对甲基苯乙烯 磺酸钠。
[0014] 作为优选,步骤3中离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐。
[0015] 本发明还提供了上述制备方法制得的离子液体-石墨烯纳米复合物在电化学免 疫检测中的应用。
[0016] 本发明提供了一种电化学免疫检测方法,包括如下步骤:
[0017] 步骤1 :获得二茂铁标记的待测蛋白抗体;
[0018] 步骤2 :取石墨烯用第一阳离子表面活性剂的水溶液分散、超声处理后制得第一 阳离子表面活性剂-石墨烯复合物,再与第二阳离子表面活性剂的水溶液混合制得石墨烯 纳米片,经超声分散后与离子液体经第一混合,制得离子液体-石墨烯纳米复合物;
[0019] 步骤3 :取所述二茂铁标记的待测蛋白抗体与所述离子液体-石墨烯纳米复合物 经第二混合后,再加入碱性磷酸酯酶经第三混合,制得离子液体-石墨烯纳米复合物-碱性 磷酸酯酶及二茂铁标记的待测蛋白抗体共耦合物;
[0020] 步骤4:将玻碳电极表面修饰处理后置于待测蛋白抗体溶液中充分结合,封闭以 去掉非特异性结合位点,,制得免疫电极;
[0021] 步骤5 :取所述免疫电极与不同浓度梯度的待测蛋白标准品溶液混合后,与所述 离子液体-石墨烯纳米复合物-碱性磷酸酯酶及二茂铁标记的待测蛋白抗体共耦合物混合 后制得工作电极;
[0022] 步骤6 :在缓冲溶液中,在底物抗坏血酸磷酸酯盐存在的条件下,取所述工作电 极、免疫电极分别与待测蛋白温育,以钼丝电极作为对电极,饱和甘汞电极(SCE)作为参比 电极,采用循环伏安法进行电化学检测,以工作电极和免疫电极的响应电流之差和所述待 测蛋白标准品溶液的浓度绘制标准曲线;
[0023] 步骤7 :取所述免疫电极与待测蛋白样品溶液温育,采用循环伏安法进行电化学 检测,测得待测蛋白样品溶液的电化学峰峰电流强度,与标准曲线比对,获得所述待测蛋白 样品溶液的浓度;
[0024] 所述第一阳离子表面活性剂选自十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基氯 化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵或季胺盐型gemini表面活性剂 C12C6C12Br2 ;
[0025] 所述第二阳离子表面活性剂选自聚对苯乙烯磺酸钠、聚丙烯酸钠或对甲基苯乙烯 磺酸钠。作为优选,步骤4中预处理为取所述玻碳电极抛光成镜面,超声处理晾干后,表面 修饰所述离子液体-石墨烯纳米复合物后吸附金纳米链。
[0026] 作为优选,步骤6中缓冲溶液为Tris-HCl缓冲溶液。
[0027] 作为优选,步骤6中缓冲溶液为pH值为7〜9的Tris-HCl缓冲溶液。
[0028] 本发明还提供了一种电化学免疫检测脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子 的方法,包括如下步骤:
[0029] 步骤1 :获得二茂铁标记的脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子抗体;
[0030] 步骤2 :取石墨烯用第一阳离子表面活性剂的水溶液分散、超声处理后制得第一 阳离子表面活性剂-石墨烯复合物,再与第二阳离子表面活性剂的水溶液混合制得石墨烯 纳米片,经超声分散后与离子液体经第一混合,制得离子液体-石墨烯纳米复合物;
[0031] 步骤3 :取所述二茂铁标记的脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子抗体与所 述离子液体-石墨烯纳米复合物经第二混合后,再加入碱性磷酸酯酶经第三混合,制得离 子液体-石墨烯纳米复合物-碱性磷酸酯酶及二茂铁标记的脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧 化还原因子抗体共耦合物;
[0032] 步骤4 :将玻碳电极表面修饰处理后置于脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因 子抗体溶液中充分结合,封闭以去掉非特异性结合位点,,制得免疫电极;
[0033] 步骤5 :取所述免疫电极与不同浓度梯度的脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原 因子标准品溶液混合后,与所述离子液体-石墨烯纳米复合物-碱性磷酸酯酶及二茂铁标 记的脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子抗体共耦合物混合后制得工作电极;
[0034] 步骤6 :在缓冲溶液中,在底物抗坏血酸磷酸酯盐存在的条件下,取所述工作电 极、免疫电极分别与脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子温育,以钼丝电极作为对电 极,饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极,采用循环伏安法进行电化学检测,以工作电极和免 疫电极的响应电流之差和所述脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子标准品溶液的浓 度绘制标准曲线;
[0035] 步骤7 :取所述免疫电极与脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子样品溶液温 育,采用循环伏安法进行电化学检测,测得脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子样品 溶液的电化学峰峰电流强度,与标准曲线比对,获得所述脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化 还原因子样品溶液的浓度;
[0036] 所述第一阳离子表面活性剂选自十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基氯 化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵或季胺盐型gemini表面活性剂 C12C6C12Br2 ;
[0037] 所述第二阳离子表面活性剂选自聚对苯乙烯磺酸钠、聚丙烯酸钠或对甲基苯乙烯 磺酸钠。在本发明提供的实施例中,一种电化学免疫检测脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化 还原因子的方法,包括如下步骤:
[0038] 室温离子液体-石墨烯纳米复合物与碱性磷酸酯酶(ALP)及二茂铁(Fc)标记的 anti-ΑΡΕΙ共耦合物的制备:
[0039] 将5mg石墨烯纳米片用5mLlwt %的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB, cetyltrimethylammonium bromide)溶液均勻分散,超声处理制得CTAB-石墨烯复合物;将 所述lmL CTAB-石墨烯复合物(lmg/mL)加入到0· SniLAwt1%的聚对苯乙烯磺酸钠(PSS, Polysodium4_styrenesulfonate)溶液中,制得表面带负电荷的石墨烯纳米片;将所述表 面带负电荷的石墨烯纳米片超声分散,并与〇. 5mLlmM的离子液体[bmim]BF4混合,逐制得 室温离子液体-石墨烯纳米复合物。
[0040] 将100 μ L Fc标记的anti-APEl抗体蛋白与0. 5mL室温离子液体-石墨烯纳米复 合物在4°C下搅拌混合4小时,然后再将100 μ L,10mg/mL ALP加入到上述混合溶液中并在 4°C下搅拌混合4小时。制得室温离子液体-石墨烯纳米复合物与碱性磷酸酯酶(ALP)及 二茂铁(Fc)标记的anti-APEl共耦合物,所得产物保存于4°C。
[0041] 免疫电极的制备:
[0042] 玻碳电极(Φ = 4mm)依次经1. 0,0· 3和0· 05 μ m的A1203糊抛光后用蒸馏水冲 洗干净,再分别在蒸馏水、丙酮、蒸馏水中超声洗涤,清洗后的电极置于室温下晾干,备用。 将10 μ L1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐分散石墨烯纳米复合物(lmg/mL)滴加到电极表 面并在室温下晾干,然后将该电极浸入金纳米链溶胶中自组装8小时。清洗后将修饰电极 置于anti-APEl抗体溶液中,于4°C的冰箱中浸泡吸附8h,得到免疫电极。最后将免疫电极 置于0. 25% BSA溶液中在37°C条件下温育lh,取出,水洗,于室温下放置晾干,置于4°C的 冰箱中保存待用。
[0043] 本发明提供一种离子液体-石墨烯纳米复合物、其制备方法及电化学免疫检测方 法。该检测方法采用双抗体夹心法,使固载在电极表面的脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧 化还原因子抗体(anti-APEl)与样品溶液中的脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子 (ΑΡΕΙ)发生免疫反应,再和室温离子液体-石墨烯纳米复合物与碱性磷酸酯酶(ALP)及二 茂铁(Fc)标记的anti-APEl共耦合物结合。基于ALP-Fc-anti-APE与室温离子液体-石墨 烯纳米复合物的电化学活性,测得循环伏安催化电流值进而检测检测样品中ΑΡΕΙ的浓度。 本发明提供的电化学免疫检测方法线性响应范围为〇. l-80pg/mL,检测下限为0. 04pg/mL, 特异性好,灵敏度高,对待测蛋白尤其是ΑΡΕΙ的测定具有重要意义。
附图说明
[0044] 图1示实施例1中本发明提供的电化学免疫检测方法测得的响应电流值与 ΑΡΕΙ浓度的标准曲线;其中,横坐标为ΑΡΕΙ浓度,纵坐标为电流值;线性方程为y = 0. 157x+6. 190, R2 = 0. 991 ;
[0045] 图2示本发明提供的电化学免疫检测法与CLIA法对同一人体血清样品的测定结 果比较图;其中,横坐标为本发明提供的电化学免疫检测方法测得的电流值对应的ΑΡΕΙ的 浓度,纵坐标为CLIA法对应的ΑΡΕΙ的浓度;线性方程为y = 0. 977χ+1. 198, R2 = 0. 998。
具体实施方式
[0046] 本发明公开了一种离子液体-石墨烯纳米复合物、其制备方法及电化学免疫检测 方法,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所 有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。 本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内 容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本 发明技术。
[0047] 本发明提供的一种离子液体-石墨烯纳米复合物、其制备方法及电化学免疫检测 方法中所用原料均可由市场购得。
[0048] 下面结合实施例,进一步阐述本发明:
[0049] 实施例1离子液体-石墨烯纳米复合物的制备
[0050] 将5mg石墨烯用5mLlwt %的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB, cetyltrimethylammonium bromide)溶液均勻分散,超声处理制得CTAB-石墨烯复合物;将 所述lmL CTAB-石墨烯复合物(lmg/mL)加入到0· SniLAwt1%的聚对苯乙烯磺酸钠(PSS, Polysodium4_styrenesulfonate)溶液中,制得表面带负电荷的石墨烯纳米片;将所述表 面带负电荷的石墨烯纳米片超声分散,并与〇. 5mLlmM的离子液体[bmim]BF4混合,制得室 温离子液体-石墨烯纳米复合物。
[0051] 实施例2离子液体-石墨烯纳米复合物的制备
[0052] 将5mg石墨烯用SmLlwt%的十二烧基三甲基氯化铵溶液均勻分散,超声处理制得 CTAB-石墨烯复合物;将所述lmL CTAB-石墨烯复合物(lmg/mL)加入到0. SniLAwt1%的聚 丙烯酸钠溶液中,制得表面带负电荷的石墨烯纳米片;将所述表面带负电荷的石墨烯纳米 片超声分散,并与0. 5mLlmM的离子液体[bmim]BF4混合,制得室温离子液体-石墨烯纳米 复合物。
[0053] 实施例3离子液体-石墨烯纳米复合物的制备
[0054] 将5mg石墨烯用SmLlwt%的十二烧基三甲基溴化铵溶液均勻分散,超声处理制得 CTAB-石墨烯复合物;将所述lmL CTAB-石墨烯复合物(lmg/mL)加入到0. 5mL,5wt%的对 甲基苯乙烯磺酸钠溶液中,制得表面带负电荷的石墨烯纳米片;将所述表面带负电荷的石 墨烯纳米片超声分散,并与〇. 5mLlmM的离子液体[bmim]BF4混合,制得室温离子液体-石 墨烯纳米复合物。
[0055] 实施例4离子液体-石墨烯纳米复合物的制备
[0056] 将5mg石墨烯用SmLlwt%的十六烧基三甲基氯化铵溶液均勻分散,超声处理制得 CTAB-石墨烯复合物;将所述lmL CTAB-石墨烯复合物(lmg/mL)加入到0. 25mL,10wt%的 聚对苯乙烯磺酸钠(PSS,Polysodium4_styrenesulfonate)溶液中,制得表面带负电荷的 石墨烯纳米片;将所述表面带负电荷的石墨烯纳米片超声分散,并与0. 5mLlmM的离子液体 [bmim]BF4混合,制得室温离子液体-石墨烯纳米复合物。
[0057] 实施例5离子液体-石墨烯纳米复合物的制备
[0058] 将5mg石墨烯用5mLlwt%的季胺盐型gemini表面活性剂C12C 6C12Br2溶液均勻分 散,超声处理制得CTAB-石墨烯复合物;将所述lmLCTAB-石墨烯复合物(lmg/mL)加入到 0. 5mL,5wt%的聚丙烯酸钠溶液中,制得表面带负电荷的石墨烯纳米片;将所述表面带负电 荷的石墨烯纳米片超声分散,并与0. 5mLlmM的离子液体[bmim]BF4混合,制得室温离子液 体-石墨烯纳米复合物。
[0059] 实施例6采用本发明提供的电化学免疫检测法对ΑΡΕΙ的标准溶液进行检测
[0060] 取本发明实施例1至5提供的离子液体-石墨烯纳米复合物。
[0061] 将100 μ L Fc标记的anti-APEl抗体蛋白与0. 5mL本发明实施例1提供的离子液 体-石墨烯纳米复合物在4°C下搅拌混合4小时,然后再将100 μ L,10mg/mL ALP加入到上 述混合溶液中并在4°C下搅拌混合4小时。制得室温离子液体-石墨烯纳米复合物与碱性 磷酸酯酶(ALP)及二茂铁(Fc)标记的anti-APEl共耦合物,所得产物保存于4°C。
[0062] 免疫电极的制备:
[0063] 玻碳电极(Φ = 4mm)依次经1. 0,0· 3和0· 05 μ m的A1203糊抛光后用蒸馏水冲洗 干净,再分别在蒸馏水、丙酮、蒸馏水中超声洗涤,清洗后的电极置于室温下晾干,备用。将 10 μ L1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐分散石墨烯纳米复合物(lmg/mL)滴加到电极表面 并在室温下晾干,然后将该电极浸入金纳米链溶胶中自组装8小时。清洗后将修饰电极置 于anti-APEl抗体溶液中,于4°C的冰箱中浸泡吸附8h,得到免疫电极。最后将免疫电极置 于0. 25% BSA溶液中在37°C条件下温育lh,取出,水洗,于室温下放置晾干,置于4°C的冰 箱中保存待用。
[0064] 将制备好的免疫电极分别与80-120 μ L不同浓度的ΑΡΕΙ标准溶液,于37°C反应 30min。反应完成后用PBS冲洗去掉未结合的蛋白样品。
[0065] 将与NSE标准溶液反应后的电极置于80-120 μ L室温离子液体-石墨烯纳米复合 物与碱性磷酸酯酶(ALP)及二茂铁(Fc)标记的anti-APEl共耦合物溶液中,在37°C下反应 30min。用PBS溶液洗3次,以除去非特异性吸咐的共耦合物。
[0066] 电化学检测采用三电极体系,免疫电极为工作电极,钼丝电极作为对电极,饱和 甘汞电极(SCE)作为参比电极。在含有5mM AA-P的0· lmol/LTris-HCl (pH = 8. 5)缓冲溶 液中进行,采用循环伏安电化学对免疫电极进行三次循环伏安扫描,并记录下三次扫描得 到的氧化峰电流值。电位扫描速度为50mV/s,扫描范围为-0. 2〜0. 6V(vs. SCE)。
[0067] 免疫传感器电流响应信号的检测基于夹心反应模式,固载在电极表面的抗体分子 与样品溶液中的抗原分子发生免疫反应后,再与室温离子液体-石墨烯纳米复合物与碱性 磷酸酯酶(ALP)及二茂铁(Fc)标记的anti-APEl共耦合物结合。基于室温离子液体-石墨 烯纳米复合物与碱性磷酸酯酶(ALP)及二茂铁(Fc)标记的anti-APEl共耦合物的电化学 特性,测得的循环伏安氧化峰峰电流值随抗原浓度的增加而增强,其变化与结合的抗原蛋 白的浓度的对数成正比例关系。将三次循环伏安扫描得到的还原峰电流绝对值求平均值, 与ΑΡΕΙ标准溶液的浓度作图,图1为标准曲线,其线性响应范围为0. l-80pg/mL。
[0068] 结果表明,本发明提供的检测方法获得的还原峰电流值与ΑΡΕΙ标准溶液的浓度 具有很好的相关性,线性方程为y = 〇. 157χ+6. 190, R2 = 0. 991。
[0069] 采用本发明实施例2至5提供的离子液体-石墨烯纳米复合物,按照上述方法对 ΑΡΕΙ的标准溶液进行检测,结果同上,三次循环伏安扫描得到的还原峰电流绝对值求平均 值,与ΑΡΕΙ标准溶液的浓度具有很好的相关性。
[0070] 实施例7人体血清样品的检测
[0071]为了进一步研究该免疫传感器的临床实用价值,使用本发明提供的电化学免疫检 测方法对人体血清样品进行检测,其结果和标准的CLIA方法检测的结果进行对照。
[0072] 取本发明实施例1至5提供的离子液体-石墨烯纳米复合物。
[0073] 将100 μ L Fc标记的anti-APEl抗体蛋白与0. 5mL实施例1提供的离子液体-石 墨烯纳米复合物在4°C下搅拌混合4小时,然后再将100 μ L,10mg/mL ALP加入到上述混合 溶液中并在4°C下搅拌混合4小时。制得室温离子液体-石墨烯纳米复合物与碱性磷酸酯 酶(ALP)及二茂铁(Fc)标记的anti-APEl共耦合物,所得产物保存于4°C。
[0074] 免疫电极的制备:
[0075] 玻碳电极(Φ = 4mm)依次经1. 0,0· 3和0· 05 μ m的A1203糊抛光后用蒸馈水冲洗 干净,再分别在蒸馏水、丙酮、蒸馏水中超声洗涤,清洗后的电极置于室温下晾干,备用。将 10 μ L1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐分散石墨烯纳米复合物(lmg/mL)滴加到电极表面 并在室温下晾干,然后将该电极浸入金纳米链溶胶中自组装8小时。清洗后将修饰电极置 于anti-APEl抗体溶液中,于4°C的冰箱中浸泡吸附8h,得到免疫电极。最后将免疫电极置 于0. 25% BSA溶液中在37°C条件下温育lh,取出,水洗,于室温下放置晾干,置于4°C的冰 箱中保存待用。
[0076] 将制备好的免疫电极分别与80-120 μ L血清样品溶液,于37°C反应30min。反应 完成后用PBS冲洗去掉未结合的蛋白样品。
[0077] 将与样品溶液反应后的电极置于80-120 μ L室温离子液体-石墨烯纳米复合物 与碱性磷酸酯酶(ALP)及二茂铁(Fc)标记的anti-APEl共耦合物溶液中,在37°C下反应 30min。用PBS溶液洗3次,以除去非特异性吸咐的共耦合物。
[0078] 电化学检测采用三电极体系,免疫电极为工作电极,钼丝电极作为对电极,饱和甘 汞电极(SCE)作为参比电极。在含有5mM AA-P的0· lmol/LTris-HCl (pH = 8. 5)缓冲溶液 中进行,采用循环伏安电化学对免疫电极进行三次循环伏安扫描,并记录下三次扫描得到 的氧化峰电流值。电位扫描速度为50mV/s,扫描范围为-0. 2〜0. 6V(vs. SCE)。
[0079] 将三次循环伏安扫描得到的还原峰电流绝对值求平均值,对照ΑΡΕΙ标准曲线(图 1)得到测得的每个样品的ΑΡΕΙ含量。采用标准的CLIA方法对同一血清样品进行检测,得 到ΑΡΕΙ的浓度。将两种方法测得的结果进行比较,具体结果见图2。
[0080] 结果表明,本发明提供的电化学免疫检测方法与CLIA检测方法,两种检测方法的 相关性良好,线性方程为y = 〇· 977x+L 198, R2 = (λ 998。
[0081] 采用本发明实施例2至5提供的离子液体-石墨烯纳米复合物,按照上述方法对 同一血清样品进行检测,结果同上,见表1。
[0082] 表1本发明提供的电化学免疫检测方法与CLIA检测方法的结果比较
[0083]
Figure CN102778571BD00101
Figure CN102778571BD00111
[0084] 结果表明,本发明提供的电化学免疫检测方法与CLIA法检测结果具有很好的相 关性。
[0085] 以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人 员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1. 一种离子液体-石墨烯纳米复合物的制备方法,其特征在于,包括如下步骤: 步骤1 :取石墨烯用第一阳离子表面活性剂的水溶液分散、超声处理后制得第一阳离 子表面活性剂-石墨烯复合物; 步骤2 :取所述第一阳离子表面活性剂-石墨烯复合物与第二阳离子表面活性剂的水 溶液混合制得石墨稀纳米片; 步骤3 :取所述石墨烯纳米片经超声分散后与离子液体混合,即得; 所述第一阳离子表面活性剂选自十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基氯化 铵、十二烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵或季胺盐型gemini表面活性剂 C12C6C12Br2 ; 所述第二阳离子表面活性剂选自聚对苯乙烯磺酸钠、聚丙烯酸钠或对甲基苯乙烯磺酸 钠。
2. 根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤3中所述离子液体为1- 丁 基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐。
3. 根据权利要求1或2所述的制备方法制得的离子液体-石墨烯纳米复合物在电化学 免疫检测中的应用。
4. 一种电化学免疫检测方法,其特征在于,包括如下步骤: 步骤1 :获得二茂铁标记的待测蛋白抗体; 步骤2 :取石墨烯用第一阳离子表面活性剂的水溶液分散、超声处理后制得第一阳离 子表面活性剂-石墨烯复合物,再与第二阳离子表面活性剂的水溶液混合制得石墨烯纳米 片,经超声分散后与离子液体经第一混合,制得离子液体-石墨烯纳米复合物; 步骤3 :取所述二茂铁标记的待测蛋白抗体与所述离子液体-石墨烯纳米复合物经第 二混合后,再加入碱性磷酸酯酶经第三混合,制得离子液体-石墨烯纳米复合物-碱性磷酸 酯酶及二茂铁标记的待测蛋白抗体共耦合物; 步骤4:将玻碳电极表面修饰处理后置于待测蛋白抗体溶液中充分结合,封闭以去掉 非特异性结合位点,制得免疫电极; 步骤5 :取所述免疫电极与不同浓度梯度的待测蛋白标准品溶液混合后,与所述离子 液体-石墨烯纳米复合物-碱性磷酸酯酶及二茂铁标记的待测蛋白抗体共耦合物混合后制 得工作电极; 步骤6 :在缓冲溶液中,在底物抗坏血酸磷酸酯盐存在的条件下,取所述工作电极、免 疫电极分别与待测蛋白温育,以钼丝电极作为对电极,饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极, 采用循环伏安法进行电化学检测,以工作电极和免疫电极的响应电流之差和所述待测蛋白 标准品溶液的浓度绘制标准曲线; 步骤7 :取所述免疫电极与待测蛋白样品溶液温育,采用循环伏安法进行电化学检测, 测得待测蛋白样品溶液的电化学峰峰电流强度,与标准曲线比对,获得所述待测蛋白样品 溶液的浓度; 所述第一阳离子表面活性剂选自十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基氯化 铵、十二烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵或季胺盐型gemini表面活性剂 C12C6C12Br2 ; 所述第二阳离子表面活性剂选自聚对苯乙烯磺酸钠、聚丙烯酸钠或对甲基苯乙烯磺酸 钠; 步骤4中所述表面修饰处理为:取所述玻碳电极抛光成镜面,超声处理晾干后,表面修 饰所述离子液体-石墨烯纳米复合物后吸附金纳米链。
5. 根据权利要求4所述的电化学免疫检测方法,其特征在于,步骤6中所述缓冲溶液为 Tris-HCl缓冲溶液。
6. 根据权利要求4所述的电化学免疫检测方法,其特征在于,步骤6中所述缓冲溶液为 pH值为7〜9的Tris-HCl缓冲溶液。
7. -种电化学免疫检测脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子的方法,其特征在 于,包括如下步骤: 步骤1 :获得二茂铁标记的脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子抗体; 步骤2 :取石墨烯用第一阳离子表面活性剂的水溶液分散、超声处理后制得第一阳离 子表面活性剂-石墨烯复合物,再与第二阳离子表面活性剂的水溶液混合制得石墨烯纳米 片,经超声分散后与离子液体经第一混合,制得离子液体-石墨烯纳米复合物; 步骤3 :取所述二茂铁标记的脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子抗体与所述离 子液体-石墨烯纳米复合物经第二混合后,再加入碱性磷酸酯酶经第三混合,制得离子液 体-石墨烯纳米复合物-碱性磷酸酯酶及二茂铁标记的脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还 原因子抗体共耦合物; 步骤4 :将玻碳电极表面修饰处理后置于脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子抗 体溶液中充分结合,封闭以去掉非特异性结合位点,制得免疫电极; 步骤5 :取所述免疫电极与不同浓度梯度的脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子 标准品溶液混合后,与所述离子液体-石墨烯纳米复合物-碱性磷酸酯酶及二茂铁标记的 脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子抗体共耦合物混合后制得工作电极; 步骤6 :在缓冲溶液中,在底物抗坏血酸磷酸酯盐存在的条件下,取所述工作电极、免 疫电极分别与脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子温育,以钼丝电极作为对电极,饱 和甘汞电极(SCE)作为参比电极,采用循环伏安法进行电化学检测,以工作电极和免疫电 极的响应电流之差和所述脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子标准品溶液的浓度绘 制标准曲线; 步骤7 :取所述免疫电极与脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子样品溶液温育,采 用循环伏安法进行电化学检测,测得脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子样品溶液的 电化学峰峰电流强度,与标准曲线比对,获得所述脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因 子样品溶液的浓度; 所述第一阳离子表面活性剂选自十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基氯化 铵、十二烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵或季胺盐型gemini表面活性剂 C12C6C12Br2 ; 所述第二阳离子表面活性剂选自聚对苯乙烯磺酸钠、聚丙烯酸钠或对甲基苯乙烯磺酸 钠。
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