CN104614429A

CN104614429A - 镀金铜热电极的制作和在温度可控h2o2传感器上的应用

Info

Publication number: CN104614429A
Application number: CN201510065572.2A
Authority: CN
Inventors: 吴韶华; 陈亮; 汤优; 孙建军; 王芳芳
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2015-02-09
Filing date: 2015-02-09
Publication date: 2015-05-13
Anticipated expiration: 2035-02-09
Also published as: CN104614429B

Abstract

本发明公开了一种镀金铜热电极的制作方法和在温度可控H₂O₂传感器上的应用，包括镀金铜热电极的制作，G-四链体-hemin络合物的形成及基于热电极和G-四链体-hemin络合物的电化学传感器对过氧化氢的高灵敏度检测方法。本发明基于G-四链体-hemin DNA酶耐高温特性，随着温度的升高（0~50℃），过氧化氢在传感器上的电化学催化响应逐渐增强。本发明的基于热电极和G-四链体-hemin DNA酶的电化学过氧化氢传感器使用温度范围广、灵敏度高，可实现过氧化氢的快速检测。

Description

镀金铜热电极的制作和在温度可控H2O2传感器上的应用

技术领域

本发明属于分析检测领域，具体涉及一种镀金铜热电极的制作方法和在温度可控H₂O₂传感器上的应用。

背景技术

过氧化氢(H₂O₂)不仅是一种优良的氧化剂而且是一种重要的化工产品，其可以作为氧化剂、消毒剂，在日常生活、食品加工以及医药等领域有着广泛的应用。如果过氧化氢通过食品进入人体之后，有可能引起消化道的癌变，其也可以加快人体的衰老，与各种病变的发生有着密切的联系。同时在生物体内，H₂O₂与其中间体O ▪自由基是生物体内许多反应的重要产物，H₂O₂也是许多酶促反应过程中的中间代谢产物，其会与许多生物体内的新陈代谢过程有很大的关联性。由于很多细胞都可以产生H₂O₂，而且它具有相对稳定的跨膜输运特性，其对许多生物过程起到了重要的调节作用。但是对绝大多数的生物来说，H₂O₂若含量过高则会对细胞起到毒性作用。另外H₂O₂对人们的日常生活、环境污染以及健康安全等的影响重大，因此对H₂O₂进行快速、灵敏、准确的检测具有很大的意义。

目前，对H₂O₂的检测方法主要是分光光度法、化学发光法、电化学方法以及色谱法。其中电化学分析方法，尤其研究最多的是基于各种过氧化物酶生物传感器，由于其成本低、操作比较简单、灵敏度较高及选择性高而受到广泛关注。

G-四链体-hemin DNA酶，由hemin与富含鸟嘌呤G碱基的DNA序列组成，其具有类似于过氧化物酶的催化活性，其在热力学与动力学都很稳定(Proceedings of the National Academy of Sciences, 1992,Silber K R)，相比于HRP具有显著的优势，已被广泛的用于生化反应(Anal Chem, 2010，Itamar Willner)。

热电极技术主要是通过外加电流的施加使电极表面的温度得以迅速地改变，只是对电极升温而不影响溶液整体的温度，而且不会影响参比电极的电位。本技术采用的是镀金铜热电极，相比于商业化金电极，该铜热电极制作比较简单，电极材料便宜，且铜热电极上镀金工艺比较成熟，因此可以大批量生产。通过热电极技术，改变电极温度可研究DNA酶电催化过氧化氢反应的最适温度，从而实现高灵敏检测过氧化氢。

发明内容

本发明的目的是提供一种镀金铜热电极的制作方法和在温度可控H₂O₂传感器上的应用。基于G-四链体-hemin DNA酶耐高温特性，随着温度的升高（0~50℃），过氧化氢在传感器上的电化学催化响应逐渐增强。使用温度范围广、灵敏度高，可实现过氧化氢的快速检测。

为实现上述目的，本发明采用以下方案：

一种镀金铜热电极的制作方法：将铜热电极在50~60℃镀镍液中以搅拌速度为1000r/min、电流密度为2 A/dm²进行恒电流沉积镍600s，再在3 mM 氯金酸溶液和0.1M NaNO₃溶液的混合溶液中室温下以-0.6V恒电位沉积金400s。

所述的镀镍液：硫酸镍100g/L、柠檬酸钠110~130 g/L、三乙醇胺20~30 g/L、氯化钠10~15 g/L，pH为7.0~7.2。

所述的镀金铜热电极应用于制作温度可控H₂O₂传感器。

所述的镀金铜热电极上修饰G-四链体-hemin DNA酶。具体步骤：室温下镀金铜热电极修饰1µM CP 14 h，得Au-CP修饰电极；用超纯水冲洗干净，在2 mM巯基己醇浸泡1 h，得Au-CP-MCH修饰电极；在E-buffer缓冲液中浸泡1 h，再在20 µM 氯化血红素室温下修饰1h, 得Au-CP-MCH-hemin修饰电极，即在镀金铜热电极上修饰G-四链体-hemin DNA酶。捕获探针CP的序列为：5′-HS-(CH₂)₆-TTTGGGTAGGGCGGGTTGGG-3′。所述的E-buffer缓冲液：HEPES 10 mM、KCl 50 mM，pH=7.2。

本发明的显著优点在于：本发明通过控温来实现调节DNA模拟酶的催化活性，用于检测H₂O₂。与分光光度法及色谱法相比，该方法操作简单，当温度为0℃时，检测限LOD为3.8×10^– ⁶ mol L^– ¹，当其电极温度达到50℃时，检测H₂O₂的浓度可以达到1.6×10^– ⁷ mol L^– ¹，相比于低温，其检测限降低了一个数量级。

本发明首先采用DNA模拟酶，热力学与动力学都很稳定，其次通过引入热电极技术，可以探索DNA模拟酶催化过氧化氢的温度效应，最后该传感器的优势在于拓宽了使用的温度范围，且该方法操作简单，灵敏度高，可快速的用于过氧化氢的检测。同时使得将此技术用于靶链DNA、适配体及生物大分子的高灵敏检测提供了可能性。

附图说明

图1是本铜热电极制作结构示意图，(a)聚氨酯漆包圆铜线(Φ 600 μm)；(b) 环氧树脂胶；(c) 漆包圆铜线(Φ 75 μm)；(d) PVC塑料管(Φ 2 mm)；DC：直流电源。

图2是过氧化氢传感器原理示意图。

图3是有无形成G-四链体-hemin DNA酶与不同温度对DNA酶电催化效果图。铜热电极镀金后修饰不同在不同温度下扫0.5 mM H₂O₂的I-T图，a：铜热电极镀金修饰-CP-MCH，b：铜热电极镀金修饰-CP-MCH-hemin，温度每升高一次，稳定1min，温度依次是：0、10、15、20、25、30、35、40、50℃，溶液：HEPES 10 mM 、KCl50 mM，pH=7.2。

图4是铜热电极镀金后修饰-CP-MCH-hemin后在不同温度下对H₂O₂的检测效果图。a：0℃，b：50℃；工作电位：-0.4 V；H₂O₂浓度增加值分别为1 μM (201~450 s)，5μM (451~700 s)，10 μM (701~950 s)，20 μM (951~1250 s)，50μM (1251~1400 s)，100 μM (1401~1600 s)，200 μM (1601~2400s)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。本发明所用双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷(Tris)、N-(2-羟乙基)哌嗪- N'-(2-乙磺酸)钠盐(HEPES)购自生工生物工程（上海）股份有限公司。氯化血红素(hemin)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)、6-巯基-1-己醇 (MCH)购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。氯金酸、硝酸钠、盐酸、氯化钾、乙醇、30% H₂O₂、硫酸镍、三乙醇胺、氯化钠、柠檬酸钠等试剂购自上海国药集团化学试剂有限公司，所有试剂均未做进一步纯化。实验用水为科尔顿系统净化的超纯水 (电阻率>18 MΩ·cm⁻¹)。铜丝购自(3UEW，FUJI TECH，Japan)公司，铜丝直径600 µm；KW-718环氧树脂胶（湖南柯威化工科技有限公司）；漆包铜线（3UEWW，FUJI TECH，Japan）Φ=75 μm；DNA核苷酸序列有上海生工合成并纯化。E-buffer (HEPES:10 mM，50 mM KCl，pH=7.2)。

一种镀金铜热电极的制作及其应用于制作温度可控过氧化氢传感器，包括如下步骤：

1）铜热电极的制作及电极温度的测定

铜热电极的制作：通过细漆包铜线按照平行双线紧密的围绕电极材料，缠绕长度1~3mm，将缠绕好的电极保持在塑料管的中间位置，最后用环氧树脂胶固化（孙建军；陈启振；陈国南.温度调制柱端安培检测电极[P].CN101726523A）。

电极温度的测定：首先通过电势测温法测出铜电极的温度系数，然后通过直流加热电源施加电流，计算出不同的加热电流下其相应的温度。

2）电化学传感器的建立：

1、铜电极先用2000目的砂纸打磨，在抛光布打磨，打磨完先用乙醇超声30s，再水超声30s。

2、在镀镍液中恒电流镀镍600s，实验条件：50~60℃，转速1000rpm，电流密度：2 A/dm²。镀镍液由硫酸镍，柠檬酸钠，三乙醇胺，氯化钠配制而成pH为7.0~7.2。

3、镀完镍后先乙醇超声30s，超纯水超声30s，在3mM HAuCl₄（0.1M NaNO₃水溶液）中-0.6V下恒电位镀金400s。

4、室温下修饰1µM CP 14 h，得Au-CP修饰电极。用超纯水冲洗干净，在MCH（2 mM）浸泡1 h，得Au-CP-MCH修饰电极。在E-buffer缓冲液中浸泡1 h，再在20 µM hemin室温下修饰1h, 得Au-CP-MCH-hemin修饰电极。再做H₂O₂相应实验。

所述CP的序列为：5′-HS-(CH₂)₆-TTTGGGTAGGGCGGGTTGGG-3′

一种镀金铜热电极的制作及其应用于制作温度可控过氧化氢传感器的原理如图2所示，首先在铜电极上镀金后修饰带有巯基的富含鸟嘌呤G的DNA序列，可以在hemin与K⁺作用下形成G-四链体-hemin 络合物，其可以催化还原H₂O₂。

如图3所示，铜电极镀金修饰CP-MCH(a)与铜电极镀金修饰CP-MCH-hemin(b)下对比有无形成DNA酶对H₂O₂催化还原的情况与其催化能力与温度的关系，从图中可以看出b比a对H₂O₂的催化能力强，说明G-四链体-hemin DNA酶对H₂O₂具有催化效果，同时温度升高，说明G-四链体-hemin DNA酶对H₂O₂的催化能力随温度的升高而增强。

如图4所示，铜电极镀金修饰CP-MCH-TP-hemin在0℃(a)与50℃(b)对H₂O₂的催化能力比较情况。实验结果为0 ºC时，线性范围为5.0×10^– ⁶~2.0×10^– ⁴ mol L^– ¹，线性方程为：I (μA) = 0.000297426 × c (µmol L^– ¹) + 0.00274，R²= 0.9983；检测限LOD为3.8×10^– ⁶ mol L^– ¹。当电极升温至50 ºC时，响应电流与1.0×10^– ⁶~8×10^– ⁴ mol L^– ¹范围内H₂O₂浓度成正比，线性方程为：I (μA) = 0.00108× c (µmol L^– ¹) – 0.000743786，R² = 0.9989；检测限LOD为1.6×10^– ⁷ mol L^– ¹。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做到各种修改或变形仍在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种镀金铜热电极的制作方法，其特征在于：将铜热电极在50~60℃镀镍液中以搅拌速度为1000r/min、电流密度为2 A/dm²进行恒电流沉积镍600s，再在3 mM 氯金酸溶液和0.1M NaNO₃溶液的混合溶液中室温下以-0.6V恒电位沉积金400s。

2.根据权利要求1所述的镀金铜热电极的制作方法，其特征在于：所述的镀镍液：硫酸镍100g/L、柠檬酸钠110~130 g/L、三乙醇胺20~30 g/L、氯化钠10~15 g/L，pH为7.0~7.2。

3.一种如权利要求1所述的方法制作的镀金铜热电极的应用，其特征在于：所述的镀金铜热电极应用于制作温度可控H₂O₂传感器。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的镀金铜热电极上修饰G-四链体-hemin DNA酶。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：室温下镀金铜热电极修饰1µM CP 14 h，得Au-CP修饰电极；用超纯水冲洗干净，在2 mM巯基己醇浸泡1 h，得Au-CP-MCH修饰电极；在E-buffer缓冲液中浸泡1 h，再在20 µM 氯化血红素室温下修饰1h, 得Au-CP-MCH-hemin修饰电极，即在镀金铜热电极上修饰G-四链体-hemin DNA酶。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：捕获探针CP的序列为：5′-HS-(CH₂)₆-TTTGGGTAGGGCGGGTTGGG-3′。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的E-buffer缓冲液：HEPES 10 mM、KCl 50 mM，pH=7.2。