CN103063715B

CN103063715B - 一种基于石墨烯/三维纳米金复合物检测survivin基因的电化学DNA生物传感器的制备方法

Info

Publication number: CN103063715B
Application number: CN201210435222.7A
Authority: CN
Inventors: 林新华; 刘爱林; 钟光贤; 陈锦元; 翁少煌
Original assignee: Fujian Medical University
Current assignee: Fujian Medical University
Priority date: 2012-11-03
Filing date: 2012-11-03
Publication date: 2015-07-01
Anticipated expiration: 2032-11-03
Also published as: CN103063715A

Abstract

本发明公开一种基于石墨烯金复合材料电化学DNA生物传感器检测survivin基因的方法，包括如下步骤：根据待测基因片段设计特异性的探针，捕获探针通过金-硫键自组装在G- 3D Au/GCE表面，在目标DNA存在的情况下，捕获探针及末端标记有生物素的信号探针分别与目标DNA结合形成“三明治”结构模型。亲和素标记的辣根过氧化物酶可通过与信号探针标记的生物素结合，从而使HRP固定在电极表面。将此电极置于含3，3’，5，5’—四甲基联苯胺和H₂O₂的底液中，在HRP的催化下，H₂O₂能氧化 TMB生成双偶氮联苯胺类物质，从而产生电化学信号。本方法具有制备过程简单、快速、绿色、选择性、灵敏度高等优点。

Description

一种基于石墨烯/三维纳米金复合物检测survivin基因的电化学DNA生物传感器的制备方法

技术领域

本发明涉及一种基于石墨烯/三维纳米金纳米复合材料电化学DNA生物传感器检测骨肉瘤相关基因survivin的方法。

背景技术

近年来，电化学DNA传感器因其具有响应快、灵敏度高、操作简便、微型化、价格低廉等优点，在基因相关疾病的诊断及其他生物分析中被广泛认为是一种很有前途的检测方法。为了进一步加强传感器的灵敏度及选择性，纳米结构材料如纳米粒子、纳米多孔材料以及纳米碳材料等作为一种加强感应的换能器被广泛引入到生物传感器。

石墨烯的碳原子排列与石墨的单原子层雷同，是碳原子以sp2混成轨域呈蜂巢晶格排列构成的单层二维晶体。由于石墨烯具有很好的机械强度、导电、导热性以及比碳纳米管具有较大的表面积，因此其在很多领域有着很好的潜在应用价值，如纳米电子器件，传感器，纳米复合物，电池，超级电容器以及储氢等。然而，由于石墨烯不管在干燥状态或者是在正常的溶剂中都会发生不可逆的团聚，降低了其功效，因此其在实际应用中受到了一定限制。为了进一步探索基于石墨烯材料的应用价值，近年来科学家在通过金属纳米粒子修饰石墨烯来合成石墨烯-金属纳米粒子复合物方面进行了大量研究。合成的石墨烯-金属纳米粒子复合物呈现出极好的电化学催化活性以及电化学稳定性。

传统的制备石墨烯-金属纳米复合物的方法是通过化学还原或者热还原氧化石墨和金属前体混合物来完成。然而，这些方法大多使用高度毒性的化学还原剂如联氨或者氢醌，这些还原剂的使用必须非常小心和微量，此外，化学还原法还需要较长的时间及很高的温度。近年来，电化学还原氧化石墨由于具有简单、快速和绿色等优点，已经受到越来越多学者的关注。一般情况下，氧化石墨前体(GO)可以在负电位被电化学还原（完全还原电位为-1.5V），形成电化学还原石墨烯(ERGO)。由于金属前体如HAuCl₄等也可以在-1.5V被电化学还原成三维的纳米金结构，因此可以在负电位下通过一步的共同电化学还原法来制备石墨烯-三维纳米金复合物。

骨肉瘤是最常见的骨原发性恶性肿瘤，好发于青少年。近年来，随着根治性的手术切除以及新辅助化疗疗法的引入，其预后大为改观。然而，肿瘤细胞对化疗药物的耐药性仍然是影响骨肉瘤治疗以及复发的重要因素。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的一员，其特征是只有一个杆状病毒凋亡抑制蛋白重复区（baculoviral inhibitor of apoptosis protein repeat），并且C端不含指环结构，代之以42 个氨基酸形成的独特的α螺旋结构，富含疏水基团，能和纺锤体微管上的微管蛋白结合。Survivin蛋白通过抑制caspase的活性，从而抑制细胞的凋亡及程序性细胞的死亡。由于survivin只在胚胎组织以及人类肿瘤细胞中高度表达，而在正常人分化细胞中不表达，因此，其可以作为肿瘤细胞对化疗药物耐药性的一个重要指标。最近研究也表明，survivin与骨肉瘤相关并且可以作为骨肉瘤预后的分子标志。

目前，临床上基因检测的方法包括流式细胞仪、染色体分析、FISH、RT-PCR等，但这些方法都存在一定的局限性如费时、准确性不高、价格昂贵等。因此，研制一种高度敏感性及选择性的DNA传感器具有广阔的运用前景。

下面所述的为本发明人率先利用“一步电化学还原法”制备石墨烯/三维纳米金的纳米复合结构材料。以新制备纳米复合材料为玻碳电极修饰材料，巯基修饰的特异性基因序列为分子捕获探针，结合电化学酶联免疫分析技术，构建一种“三明治”模式的新型纳米电化学DNA传感器，并用于骨肉瘤相关基因survivin的检测。将氧化石墨滴涂于处理干净的玻碳电极后，在氯金酸及硫酸的溶液中进行共同电化学还原，利用还原过程中产生的氢气泡作为模板，可合成石墨烯/三维纳米金复合物修饰玻碳电极(G- 3D Au/GCE)。利用自组装膜法将巯基修饰捕获探针固定在G- 3D Au/GCE表面，对电极表面未结合的位点通过封闭剂进行封闭；利用长链目标链的一端与5' 端标记有生物素 (biotin) 的信号探针互补，长链目标链的另一端与捕获探针通过碱基配对结合实现共杂交，将双链DNA (dsDNA) 片段固定化；通过辣根过氧化物酶 (HRP) 上的亲和素(avidin)，根据亲和素与生物素之间的亲和作用，将酶结合上去，利用酶的信号放大作用，在底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺 (TMB) 中研究杂交前后电信号的差异，对探针的特异性及灵敏度进行测试。由于具有高传导性、电催化能力、生物相容性G- 3D Au纳米复合物作为基底电极，并且具有类似三明治结构的设计以及酶的催化功能，极大地增强了检测的特异性及灵敏度，从而建立了高灵敏度、高特异性的骨肉瘤相关基因survivin的检测方法，为骨肉瘤的预后提供分子诊断基础，具有重要的临床意义。

发明内容

本发明的目的在于提出了一种简单、快速、绿色的制备石墨烯/三维纳米金复合物修玻碳电极的方法，基于此修饰电极提出了一种操作过程简单、检测成本低廉且具有高灵敏度及选择性的检测目标基因的电化学DNA传感器。

本发明的目的是这样实现的，所述的一种基于石墨烯/三维纳米金复合材料电化学DNA生物传感器检测骨肉瘤相关基因survivin的方法, 其特征在于通过电化学还原法制备石墨烯/三维纳米金复合材料，构建电化学DNA生物传感器，利用DNA杂交前后安培电流强度的变化来实现对目标基因及含survivin片段的阳性PCR产物的测定。

所述的基于石墨烯/三维纳米金复合材料电化学DNA生物传感器检测骨肉瘤相关基因survivin的方法，其特征在于石墨烯/三维纳米金复合材料的制备采用一步电化学还原法，且所述的目标基因序列为survivin基因的一个片段，通过NCBI基因数据库同源比对，该片段为survivin的特异序列。

所述的基于石墨烯/三维纳米金复合材料电化学DNA生物传感器检测骨肉瘤相关基因survivin的方法，其特征在于依序包括如下步骤：（1）玻碳电极预处理；（2）石墨烯/三维纳米金复合材料修饰玻碳电极的制备；（3）探针的自组装及与目标基因或PCR产物、末端生物素修饰的信号探针杂交；（4）亲和素修饰的辣根过氧化物酶（HRP）与生物素结合；（5）电极在TMB溶液中，在HRP的催化下产生电化学信号，通过杂交前后电化学信号的变化可检测目标基因及阳性PCR产物。

所述的基于石墨烯/三维纳米金复合材料电化学DNA生物传感器检测骨肉瘤相关基因survivin的方法，其特征在于制备的石墨烯/三维纳米金复合材料修饰玻碳电极，具有大的比表面积，高导电及电催化能力，增强了该传感器的灵敏度。

所述的基于石墨烯/三维纳米金复合材料电化学DNA生物传感器检测骨肉瘤相关基因survivin的方法，其特征在于探针、目标基因及信号探针通过形成三明治结构而杂交，确保了该传感器的特异性。

所述的基于石墨烯/三维纳米金复合材料电化学DNA生物传感器检测骨肉瘤相关基因survivin的方法，其特征在于杂交后，通过生物素及亲和素结合而使HRP固定在电极表面，利用酶联放大技术，在HRP催化下，TMB底液发生氧化还原反应，产生放大的电化学信号，增强了该传感器的敏感性。

所述的基于石墨烯/三维纳米金复合材料电化学DNA生物传感器检测骨肉瘤相关基因survivin的方法，其特征在于玻碳电极依次在1.0，0.3，0.05 μm 的Al₂O₃粉末中打磨、抛光，然后分别放入浓HNO₃与水的体积比V _HNO3: V_H2O为1: 1的HNO₃、无水乙醇及去离子水中超声并用N₂吹干；用移液枪将8 μl 1 mg/ml的氧化石墨滴在处理干净的GCE表面，放入真空泵中直至表面干燥，将GO膜修饰的GCE放入2.8 mM HAuCl₄及0.1 M H₂SO₄ 中，通过循环伏安法，控制电位为0至-1.5 V合成石墨烯/三维纳米金复合物修饰玻碳电极；合成的G- 3D Au/GCE在去离子水中超声后，在0.5 M H₂SO₄ 中进行循环伏安法扫描，控制电位为-0.35-1.5V，扫速为0.1 V/s。

所述的基于石墨烯/三维纳米金复合材料电化学DNA生物传感器检测骨肉瘤相关基因survivin的方法，其特征在于取5 μL浓度为10 μM的巯基修饰的捕获探针滴于处理好的G- 3D Au/GCE表面，在室温下反应后，用PBS缓冲液清洗后用氮气吹干，接着在2.5 mM 6-巯基-1-己醇水溶液中封闭，即可得到修饰有捕获探针和巯基己醇的ERGO-Au/GCE，然后用PBS缓冲液清洗，氮气吹干；在杂交反应前，用BSA封闭5-30分钟；分别将不同PCR实际产物，阴性PCR产物在95℃下变性10 min后，置于4℃ 冰浴中备用；将修饰有捕获探针和巯基己醇的ERGO-Au/GCE电极放入到100ml含有一定浓度的信号探针和变性后的PCR产物的杂交溶液中，在37 C下杂交后，取出并用PBS缓冲液清洗，氮气吹干；用BSA封闭后，用PBS缓冲液清洗，氮气吹干；然后，在电极表面滴加5 µl avidin-HRP 酶储备液，室温下反应，用含吐温的PBS缓冲液及PBS缓冲液清洗，获得修饰有捕获探针和巯基己醇的ERGO-Au/GCE电极；将修饰有捕获探针和巯基己醇的ERGO-Au/GCE电极置于含3，3’，5，5’—四甲基联苯胺（TMB）和H₂O₂的底液中，在HRP的催化下，H₂O₂能氧化 TMB生成双偶氮联苯胺类物质，从而产生电化学信号，根据电信号的差异可以辨别阳性PCR产物，阴性PCR产物及空白溶液。

具体地说，所述的一种检测骨肉瘤相关基因survivin（凋亡抑制基因）的纳米电化学生物传感器，待测基因为survivin基因，包括如下步骤：

（1）从NCBI基因数据库中查找survivin基因序列，选择其中一段作为人工合成的探针使用，探针长度为30个碱基，经过同源比对，将对应序列作为survivin的特异性序列进行合成(5'-SH - GGC CCT TCT TGG AGG GCT GCG CCT GCA CCC -3'）, 3’端生物素标记的DNA信号探针(5' -AGG ACC ACC GCA TCT CTA CAT TCA AGA ACT-Biotin -3'), 目标系列(5'- AGT TCT TGA ATG TAG AGA TGC GGT GGT CCT GGG TGC AGG CGC AGC CCT CCA AGA AGG GCC -3')。

（2）玻碳电极（GCE）依次在1.0，0.3，0.05 μm 的Al₂O₃粉末中打磨、抛光，然后分别放入体积比V _HNO3: V_H2O为1: 1的 HNO₃、无水乙醇及去离子水中超声并用N₂吹干。用移液枪将8 μl 1 mg/ml的氧化石墨（GO）滴在处理干净的GCE表面，放入真空泵中直至表面干燥。将GO膜修饰的GCE放入2.8 mM HAuCl₄及0.1 M H₂SO₄ 中，通过循环伏安法（电位为0至-1.5 V）进行一步的共同电化学还原法合成ERGO-Au/GCE。合成的ERGO-Au/GCE在去离子水中超声后，在0.5 M H₂SO₄ 中进行循环伏安法扫描（电位为-0.35-1.5V，扫速为0.1 V/s），用于去除修饰电极表面的杂质及计算玻碳电极表面金的实际面积。

（3）捕获探针通过金-硫键自组装在石墨烯/三维纳米金复合物修饰玻碳电极(G- 3D Au/GCE)表面，在目标DNA存在的情况下，捕获探针及末端标记有生物素的信号探针分别与目标DNA结合形成“三明治”结构模型。

（4）亲和素标记的辣根过氧化物酶（HRP）可通过与信号探针标记的生物素结合，从而使HRP固定在电极表面。

（5）将此电极置于含3，3’，5，5’—四甲基联苯胺（TMB）和H₂O₂的底液中，在HRP的催化下，H₂O₂能氧化 TMB生成双偶氮联苯胺类物质，从而产生电化学信号。电化学检测过程中，电化学三电极体系：玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl （饱和KCl）为参比电极。所用电化学检测技术为电流-时间曲线。

本发明的优点为：与现有技术相比，本发明利用简单、快速、绿色的“一步共同电化学还原法”制备了具有高传导性、电催化活性的石墨烯/三维纳米金复合物修饰玻碳电极，结合辣根过氧化物酶的信号放大功能，极大地增强了检测的灵敏度，此外，设计的三明治结构相对稳定，有效地减少非特异性吸附，从而提高杂交检测的特异性。本发明方法可应用于临床上各种基因诊断检测，为临床上快速诊断提供可能。且该技术的所需检测操作过程简单、检测成本低廉且具有高灵敏度及选择性等优点，有利于推广使用。

附图说明

图1为本发明的基于石墨烯/三维纳米金纳米复合材料电化学DNA生物传感器检测骨肉瘤相关基因survivin的方法的测试流程图。

图2A为本发明的石墨烯/三维纳米金纳米复合材料制备过程的裸玻碳电极扫描电镜图。

图2B为本发明的石墨烯/三维纳米金纳米复合材料制备过程的氧化石墨修饰玻碳电极扫描电镜图。

图2C为本发明的石墨烯/三维纳米金纳米复合材料制备过程的三维纳米金/石墨烯修饰玻碳电极的扫描电镜图。

图3A 为本发明的三维纳米金/石墨烯修饰玻碳电极(a)，金纳米粒子修饰玻碳电极(b)及相同几何面积的平板电极(c)在0.5 M H₂SO₄中的循环伏安图。

图3B 为本发明的不同修饰电极在0.5 M H₂SO₄中的循环伏安图。

图4为本发明的传感器组装过程的交流阻抗表征图；图中：裸ERGO-Au/GCE(a)，裸GCE(b), 裸GO/GCE(c), ssDNA /MCH /ERGO-Au/GCE(d), ssDNA/ERGO-Au/GCE(e), dsDNA/ ERGO-Au /GCE (f) and dsDNA/ avidin-HRP /ERGO-Au / GCE的交流阻抗图。相同几何面积的裸AuE(a)，ssDNA/MCH/AuE (b), ssDNA/AuE (c), dsDNA/AuE (d) 和dsDNA/ avidin-HRP/ AuE (e)的交流阻抗图。

图5为本发明的探针DNA分别与完全互补、单碱基错配及完全错配DNA杂交后在三明治结构传感器的电流-时间曲线图；图中：探针DNA分别与完全互补、单碱基错配及完全错配DNA杂交后在三明治结构传感器的电流-时间曲线图：完全互补DNA(a), 单碱基错配DNA(b), 完全错配DNA(c), 捕获探针(d), 背景电流(e). 插图为相对应的直方图。

图6A为本发明的传感器与不同浓度目标链杂交后的电信号比较图；图中：目标DNA量从(a)到(n)分别为100 nM，50 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 500 pM, 100 pM, 10 pM, 5 pM, 1 pM, 500 fM，100 fM，50 fM and 0 fM。

图6B为本发明的传感器与不同浓度目标链杂交后的电流与目标DNA浓度的对数坐标图，其图中的插入图为电流强度与目标DNA浓度的线性关系图（浓度范围50 fM~5 nM）。

图7A为不同PCR产物的凝胶电泳图及本发明的传感器与PCR产物反应后的电流-时间曲线图；图中：不同PCR产物的凝胶电泳图：道次从左到右依次为(1)阴性PCR产物(不含survivin基因片段) (2)阳性PCR产物(含survivin基因片段) (3)空白背景。

图7B为DNA传感器进行PCR产物反应后的电流-时间曲线图；(a)DNA传感器与阳性PCR产物反应后的电流-时间曲线图，(b) DNA传感器与阴性PCR产物反应后的电流-时间曲线图，(c) DNA传感器与空白溶液反应后的电流-时间曲线图，图中的插入图为DNA传感器与不同的PCR产物杂交后的电信号直方图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下述的浓硝酸质量分数为65%，常用的浓硫酸中H₂SO₄的质量分数为98.3%。

本发明实施例是这样实现的（见图1），一种检测骨肉瘤相关基因survivin的纳米电化学生物传感器，待测基因为survivin基因，包括如下步骤：

（2）依据modified hummers方法从天然石墨粉合成氧化石墨(GO)。具体步骤如下：首先，将5g石墨粉放入115 mL浓硫酸中（冰浴），15g 的高锰酸钾逐渐加入使温度不超过20度，然后放在35度下，搅拌下反应30min。慢慢滴加去离子水230 mL，温度到达98度，维持15min。再加入700 mL去离子水，50ml 30% H₂O₂。用5% HCl 洗至无硫酸根离子，离心得到固体，用去离子水洗到中性，65度真空烘干。

（3）玻碳电极（GCE）依次在1.0，0.3，0.05 μm 的Al₂O₃粉末中打磨、抛光，然后分别放入浓HNO₃与水的体积比V _HNO3: V_H2O为1: 1的HNO₃、无水乙醇及去离子水中超声并用N₂吹干，得到预处理的GCE（见图2A）。用移液枪将8 μl 1 mg/ml的氧化石墨（GO）滴在处理干净的GCE表面，放入真空泵中直至表面干燥，得到GO膜修饰的GCE（见图2B）。将GO膜修饰的GCE放入2.8 mM HAuCl₄及0.1 M H₂SO₄ 中，通过循环伏安法（电位为0至-1.5 V）进行一步的共同电化学还原法合成石墨烯/三维纳米金复合物修饰玻碳电极（G- 3D Au/GCE）（见图2C），表明纳米金已成功沉积在石墨烯表面，形成了三维纳米金/石墨烯纳米复合物材料。合成的G- 3D Au/GCE在去离子水中超声后，在0.5 M H₂SO₄ 中进行循环伏安法扫描（电位为-0.35-1.5V，扫速为0.1 V/s），用于去除修饰电极表面的杂质，并通过硫酸CV扫描中的还原峰的面积就可以计算出电极表面金的真实面积（见图3A）。为了分析沉积的纳米复合物的成分，将制备的电极放入0.5 M H₂SO₄中进行循环伏安法扫描。在0～0.7 V之间，石墨烯修饰玻碳电极的CV曲线具有一对由酚羟基团产生的氧化还原峰（峰I和峰II）。而三维纳米金-石墨烯纳米复合物修饰的玻碳电极的循环伏安曲线上也可以看到这种氧化还原峰，并且还伴有金特异性的氧化还原峰（见图3B），表明了通过共同的电化学沉积后，石墨烯和金共同沉积在了玻碳电极表面形成三维纳米金-石墨烯纳米复合物修饰的玻碳电极。

（4）取5 μL浓度为10 μM的巯基修饰的捕获探针滴于处理好的G- 3D Au/GCE表面，在室温下反应2小时后，用pH 7.40 的PBS缓冲液清洗后用氮气吹干，接着在2.5 mM 6-巯基-1-己醇（MCH）水溶液中封闭1 h，即可得到修饰有捕获探针和巯基己醇的ERGO-Au/GCE，然后用pH 7.40 的PBS缓冲液清洗，氮气吹干。在杂交反应前，用5 wt%BSA封闭15分钟，通过交流阻抗法测量电极表面传递电阻(R_et)的变化，可监测传感器每一步的组装过程（见图4）。当GO修饰在玻碳电极表面后(曲线c)，由于GO弱的导电能力，阻碍了界面间的电子转移，因此，其R_et值与裸玻碳电极(曲线b)相比明显增加(曲线c)。当共同电化学还原GO和HAuCl₄后, 形成的三维纳米金-石墨烯纳米复合物具有很强的导电性，使溶液中的[Fe(CN)₆]^3-/4-更容易与电极表面发生电子转移，因此，其R_et值明显降低(曲线a)。当巯基修饰探针固定在ERGO-Au/GCE表面及接下来的组装过程中，其电阻值比平板金电极相应步骤的电阻值明显降低(曲线d-曲线g)，表明了ERGO-Au/GCE具有很强的电子转移能力。

（5）通过电流-时间曲线（i-t）扫描，考察基于的DNA传感器的选择性（见图5）。当探针通过自组装在ERGO-Au/GCE表面后，其电流强度(曲线d)与背景电流几乎相同(曲线e)，这是由于此电极表面无生物素标记的信号探针，亲和素标记的HRP不能通过亲和作用结合到电极表面，无法催化底物溶液，所以其产生的电流强度很弱。当与互补DNA杂交后，其电流强度明显增大(曲线a)，表明探针与互补DNA在电极表面发生了完全的杂交，形成了“三明治”结构。在此结构中，信号探针末端修饰的生物素可与HRP上修饰的亲和素通过亲和键，将HPR结合于电极表面，进而在HRP的催化作用下，TMB可被大量的H₂O₂氧化生成双偶氮联苯胺化合物，从而产生强安培电流信号。当溶液中存在单碱基错配DNA序列时，其安培电流信号有所降低(曲线b)，表明了探针与单碱基错配的DNA序列没有发生完全杂交。此外，当溶液中存在完全错配DNA序列时，其电流强度(曲线c)很弱，与探针DNA修饰ERGO-Au/GCE(曲线d)及背景信号(曲线e)相比，并没有发生明显的变化，表明了完全错配DNA序列没有与探针DNA发生杂交，不能形成“三明治”结构，从而HPR不能结合在电极表面产生催化作用。以上结果表明：基于ERGO-Au/GCE构建的纳米DNA生物传感器具有较强的序列选择性和特异性，能实现对单碱基突变的DNA链识别和检测。

（6）利用电流时间曲线方法对骨肉瘤相关survivin基因目标互补ssDNA进行定量检测，观察安培电流强度变化，进一步评估基于ERGO-Au/GCE的检测性能（见图6A、图6B）。随着互补链浓度的增加，其安培信号电流逐渐增大，在浓度范围5.0×10 ^-14 ～1.0×10 ^– ⁷ mol/L之间，电流信号与DNA的浓度成非线性对数函数关系（见图6A）。在5.0×10 ^-14 ～ 5.0×10 ^– ¹²mol/L范围内，电流信号与DNA的浓度呈良好的线性关系 (见图6B)，相关的回归方程为I (nA)= 0.6862+0.2529lg C_DNA(pM)，r＝0.9934，检测限可达3.4×10^-15mol/L。这说明基于ERGO-Au/GCE构建的纳米DNA生物传感器能显著提高ssDNA探针在电极上的固定量，并能加快测量底液与电极间的电子传递速率，加强DNA传感器的催化能力，从而提高对互补ssDNA序列识别的灵敏度。

（7）分别将不同PCR实际产物（阳性PCR产物（含survivin基因片段），阴性PCR产物（不含survivin基因片段））在95℃下变性10 min后，置于4℃ 冰浴中备用。将步骤制备好的巯基修饰捕获探针的电极放入到100ml含有一定浓度的信号探针和变性后的PCR产物的杂交溶液中，在37 C下杂交 1小时后，取出并用pH 7.40 的PBS缓冲液清洗，氮气吹干。用5 wt % BSA封闭1.5小时后，用pH 7.40 的PBS缓冲液清洗，氮气吹干。然后，在电极表面滴加5 µl avidin-HRP 酶储备液，室温下反应15 min，用pH 7.40 的含吐温的PBS缓冲液及pH 7.40 的PBS缓冲液清洗后，立即置于含3，3’，5，5’—四甲基联苯胺盐酸盐（TMB）和30%H₂O₂的底液中，在HRP的催化下，H₂O₂能氧化 TMB生成双偶氮联苯胺类物质，从而产生电化学信号，根据电信号的差异可以辨别阳性PCR产物，阴性PCR产物及空白溶液（见图7B），并与PCR实际产物的凝胶电泳图（见图7A）进行比较。

本发明方法可应用于临床上各种基因诊断检测，为临床上快速诊断提供可能。且该技术的所需检测操作过程简单、检测成本低廉且检测结果具有高度灵敏性及选择性等优点，有利于推广使用。

Claims

1.一种基于石墨烯/三维纳米金复合物检测survivin基因的电化学DNA生物传感器的制备方法，该方法包括如下步骤：

（1）玻碳电极GCE预处理；

玻碳电极GCE依次在1.0、0.3、0.05 μm 的Al₂O₃粉末中打磨、抛光，然后分别放入浓HNO₃与水的体积比V _HNO3: V_H2O为1: 1的HNO₃、无水乙醇及去离子水中超声并用N₂吹干；

（2）石墨烯/三维纳米金复合物修饰玻碳电极的制备；

用移液枪将8μL 1mg/ml的氧化石墨GO滴在处理干净的玻碳电极GCE表面，放入真空泵中直至表面干燥，将GO膜修饰的GCE放入2.8 mM HAuCl₄及0.1 M H₂SO₄ 中，通过循环伏安法，控制电位为0至-1.5 V合成石墨烯/三维纳米金复合物修饰玻碳电极G-3D Au/GCE；合成的G-3D Au/GCE在去离子水中超声后，在0.5 M H₂SO₄ 中进行循环伏安法扫描，控制电位为-0.35-1.5V，扫速为0.1 V/s；

（3）捕获探针的自组装及与目标基因序列、末端生物素修饰的DNA信号探针杂交；

取5μL浓度为10μM的巯基修饰的捕获探针滴于处理好的G-3D Au/GCE表面，在室温下反应后，用PBS缓冲液清洗后用氮气吹干，接着在2.5 mM 6-巯基-1-己醇水溶液中封闭，得到修饰有捕获探针和巯基己醇的G-3D Au/GCE，然后用PBS缓冲液清洗，氮气吹干；在杂交反应前，用BSA封闭5-30分钟；然后放入到100 mL含有一定浓度的DNA信号探针和目标基因序列的杂交溶液中，在37 ^◦C下杂交后，取出并用PBS缓冲液清洗，氮气吹干；用BSA封闭后，用PBS缓冲液清洗，氮气吹干；

所述捕获探针为5'-SH - GGC CCT TCT TGG AGG GCT GCG CCT GCA CCC -3', 所述DNA信号探针为5' -AGG ACC ACC GCA TCT CTA CAT TCA AGA ACT-Biotin -3', 目标基因序列为5'- AGT TCT TGA ATG TAG AGA TGC GGT GGT CCT GGG TGC AGG CGC AGC CCT CCA AGA AGG GCC -3'；

（4）亲和素修饰的辣根过氧化物酶HRP与生物素结合；

在步骤（3）所得到的电极表面滴加5 µL avidin-HRP 酶储备液，室温下反应，用含吐温的PBS缓冲液及PBS缓冲液清洗，获得电化学DNA生物传感器。

2.根据权利要求1 所述的制备方法，其特征在于：捕获探针、目标基因序列及DNA信号探针通过形成三明治结构而杂交。